CN112795677B - 一种皮肤利什曼原虫虫种鉴定的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利什曼原虫虫种鉴定的试剂盒或芯片、利什曼原虫虫种鉴定的探针组、利什曼原虫虫种鉴定的扩增引物对以及在鉴定利什曼原虫虫种中的应用或者在制备诊断利什曼病的产品中的应用。本发明还提供了一种鉴定利什曼原虫虫种的方法。采用本发明提供的试剂盒或芯片可以准确鉴定皮肤利什曼病感染原虫L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantum。与现有的技术相比具有可应用于临床，使用便捷，鉴定准确的优势，可以推广使用。

Description

一种皮肤利什曼原虫虫种鉴定的试剂盒
技术领域
本发明属于寄生虫分子检测技术领域，更具体地，涉及一种皮肤利什曼原虫虫种鉴定的引物对、探针及检测方法和试剂盒。
背景技术
利什曼病是由利什曼原虫（Leishmania spp.）寄生于人体引起的疾病，通过受感染的雌性白蛉叮咬传播。根据不同种的利什曼原虫在人体的寄生部位和临床表现，利什曼原虫可引起一系列疾病，以皮肤利什曼和内脏利什曼病最为常见，其中皮肤利什曼病虽然不会对生命构成威胁，但会引起严重的面部损毁。
明确感染原虫的虫种对临床用药，患者管理以及疾病防控具有重要的指导作用。目前临床对利什曼原虫的虫种鉴定主要从流行病学以及临床背景进行推断，实验室分型主要依赖于扩增利什曼原虫的核糖体DNA内转录间隔区基因（ITS1, ITS2），核糖体RNA小亚基基因（SSU rRNA）以及热激蛋白70基因（HSP70）等单一基因并进行测序比对，该方法基于普通PCR并通过产物分析进行虫种的鉴定，容易造成实验室气溶胶的污染，而且结果往往不准确。分子分型的方法（RFLP,RAPD,MLEE等）虽然分型结果较为准确，但操作繁琐，技术难度大，实验室之间的可比性较差，并不适合于临床应用。
专利CN101613752A公开了一种快速检测杜氏利什曼原虫的荧光定量PCR试剂盒，采用杜氏利什曼原虫kDNA基因特异性引物，以SYBR-Green染料收集荧光定量。
Hossain et al.2017公开了荧光定量PCR法用于检测和定量内脏利什曼病，采用利什曼原虫REPL重复的保守区特异性引物和探针进行定量。
但上述方法仍然存在灵敏度不高、特异性不强的缺陷,且不可以进行利什曼原虫的虫种鉴定。
专利CN111549160A公开了一种用于检测利什曼原虫的引物组、试剂盒及其应用，但所检测的利士曼原虫主要是针对黑热病的检测，且试剂盒是基于利士曼原虫动基体小环进行设计，而本申请基于利士曼原虫序列多态性的基因以及基因上具有可区分不同种的单碱基差异位点。
本申请应用皮肤利什曼病感染原虫不同虫种保守基因的序列多态性设计等位基因特异性探针组合构建荧光定量PCR技术建立皮肤利什曼病感染原虫L.major（Leishmania major，硕大利什曼原虫）、L.tropica（Leishmaniatropica，热带利什曼原虫）、L.donovani（Leishmania donovani，杜氏利什曼原虫）或L.infantum（Leishmania infantum，婴儿利什曼原虫）的虫种鉴别诊断检测体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是从皮肤利什曼病感染原虫的保守基因中筛选种间具有序列多态性的基因以及基因上具有可区分不同种的单碱基差异位点。根据保守基因设计一对扩增引物，依据种间的单碱基差异位点设计等位基因特异性探针构建皮肤利什曼感染病原体L.major、L.tropica和L.donovani或L.infantum的虫种鉴定检测系统。该方法的建立使得临床具有可应用的准确、便捷的皮肤利什曼病感染原虫的虫种鉴定方法，该方法应用于临床对于指导临床用药，预后判断以及利什曼原虫的预防控制具有重要意义。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
选择利什曼原虫的保守基因，通过公共数据库获取皮肤利什曼感染原虫不同种的保守基因序列，使用BioEdit软件进行比对筛选出种间具有多态性的基因，再进一步筛选出可区分L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantum的单碱基差异位点。根据以上筛选出的基因设计引物及探针组，并使用本申请设计的反应体系及扩增条件，以临床样品中提取的DNA作为模板进行检测便可确定皮肤利什曼病感染原虫的虫种。
本发明的第一方面，提供了一种利什曼原虫虫种鉴定的扩增引物对，所述的扩增引物对为针对SPDSYN基因保守序列设计。
优选的，所述的扩增引物对包含：
A）上游：5’-AGATCATTGCGTACTTGAC-3’（SEQ ID NO：1），
下游：5’-TCATCGACACAACGGACC-3’（SEQ ID NO：2）；
或，
B）上游：5’-aaacgacggccagtgaattcAGATCATTGCGTACTTGAC-3’（SEQ ID NO：6），
下游：5’-accatgattacgccaagcttTCATCGACACAACGGACC-3’（SEQ ID NO：7）。
优选的，所述的利什曼原虫虫种为皮肤利什曼原虫虫种，进一步优选的，所述的皮肤利什曼原虫虫种包括L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantum虫种。
本发明的第二方面，提供了一种利什曼原虫虫种鉴定的探针组，所述的探针组针对SPDSYN基因SNPs位点设计。其中，SPDSYN基因SNPs位点位于SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的第50位。
所述的探针组包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
优选的，所述的探针组还包括探针组中探针的5’端的荧光报告基团和3’端的荧光猝灭基团。
本发明所述的荧光报告基团可以为任意现有技术使用的荧光报告基团。包括但不限于VIC(绿色荧光蛋白)、6-FAM（6-carboxy-fluorescein，6-羧基荧光素）、Tex Red（德克萨斯红）、TET（Tetrachlorofluorescein，四氯-6-羧基荧光素）、JOE（2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素）、HEX（hexachlorofluorescein，六氯-6-甲基荧光素）、CY3（三氢-吲哚菁型染料）、CY5（三氢-吲哚菁型染料）、ROX（Carboxy-X-Rhodamine，6-羧基-X-罗丹明）、LCRED640（红色染料640）或LC RED705（红色染料705），优选的，所述的荧光基团为VIC、6-FAM或Tex Red。
本发明所述的荧光淬灭基团可以为任意现有技术使用的荧光淬灭基团。包括但不限于DABCYL（4-（4-恶烷氨基苯偶氮）苯甲酸）、BHQ1（Black Hole Quencher 1）、BHQ2（BlackHole Quencher 2）或BHQ3（Black Hole Quencher 3）。
优选的，所述的探针组包含5’-VIC-SEQ ID NO：3-BHQ1-3’、5’-6-FAM-SEQ ID NO：4-BHQ1-3’和5’-Tex Red-SEQ ID NO：5-BHQ2-3’。
其中，5’-VIC-SEQ ID NO：3-BHQ1-3’具体为5’-VIC-TCAGGAACCCCATCATCT-BHQ1-3’；
5’-6-FAM-SEQ ID NO：4-BHQ1-3’具体为5’-6-FAM-TCAGGAAGCCCATCATCT-BHQ1-3’；
5’-Tex Red-SEQ ID NO：5-BHQ2-3’具体为5’-Tex Red-TCAGGAATCCCATCATCT-BHQ2-3’。
优选的，所述的利什曼原虫虫种为皮肤利什曼原虫虫种，进一步优选的，所述的皮肤利什曼原虫虫种包括L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantum虫种。
本发明的第三方面，提供了一种鉴定利什曼原虫虫种的质粒，所述的利什曼原虫虫种为皮肤利什曼原虫虫种，优选的，所述的皮肤利什曼原虫虫种包括L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantum虫种。
优选的，所述的质粒包含与L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantumSPDSYN基因的SNPs位点一致的序列，进一步优选的，所述的质粒包含SEQ ID NO：8、9或10。
本发明是从皮肤利什曼病感染原虫的保守基因中筛选种间具有序列多态性的基因以及基因上具有可区分不同种的单碱基差异位点。根据保守基因设计一对扩增引物，并依据种间的单碱基差异位点设计等位基因特异性探针。
本发明第四方面，提供了一种利什曼原虫虫种鉴定的试剂盒或芯片，所述的试剂盒或芯片包含针对SPDSYN基因的扩增引物对和探针组。
优选的，所述的探针组中的探针为针对SPDSYN基因的SNPs位点设计。SPDSYN基因SNPs位点位于SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10的第50位。
优选的，所述的探针组中的探针长度为现有技术中常规设计的长度。优选为15-30bp。
优选的，所述的探针组包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。
优选的，所述的探针组还包括探针组中探针的5’端的荧光报告基团和3’端的荧光猝灭基团。
本发明所述的荧光报告基团可以为任意现有技术使用的荧光报告基团。包括但不限于VIC、6-FAM、Tex Red、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、LC RED640或LC RED705，优选的，所述的荧光基团为VIC、6-FAM或Tex Red。
本发明所述的荧光淬灭基团可以为任意现有技术使用的荧光淬灭基团。包括但不限于DABCYL、BHQ1、BHQ2或BHQ3。
优选的，所述的探针组包含5’-VIC-SEQ ID NO：3-BHQ1-3’、5’-6-FAM-SEQ ID NO：4-BHQ1-3’和5’-Tex Red-SEQ ID NO：5-BHQ2-3’。
其中，5’-VIC-SEQ ID NO：3-BHQ1-3’具体为5’-VIC-TCAGGAACCCCATCATCT-BHQ1-3’；
5’-6-FAM-SEQ ID NO：4-BHQ1-3’具体为5’-6-FAM-TCAGGAAGCCCATCATCT-BHQ1-3’；
5’-Tex Red-SEQ ID NO：5-BHQ2-3’具体为5’-Tex Red-TCAGGAATCCCATCATCT-BHQ2-3’。
优选的，所述的扩增引物对为针对SPDSYN基因保守序列设计。进一步优选的，所述的扩增引物对分别针对SEQ ID NO：8、9或10的5’端和3’端序列设计。
优选的，所述的扩增引物对包含：
A）上游：5’-AGATCATTGCGTACTTGAC-3’（SEQ ID NO：1），
下游：5’-TCATCGACACAACGGACC-3’（SEQ ID NO：2）；
或，
B）上游：5’-aaacgacggccagtgaattcAGATCATTGCGTACTTGAC-3’（SEQ ID NO：6），
下游：5’-accatgattacgccaagcttTCATCGACACAACGGACC-3’（SEQ ID NO：7）。
优选的，所述的试剂盒还包含PCR反应所需试剂。所述的PCR反应所需试剂包括但不限于Taq DNA聚合酶、dNTPs、酶稳定剂、Taq DNA聚合酶反应缓冲液、溴酚蓝染料或水中的一种或两种以上的组合。优选的，所述的试剂盒中还包含DNA提取所需试剂。
优选的，所述的利什曼原虫虫种包括L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantum中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的利什曼原虫虫种包括L.major、L.tropica或L.donovani。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的利什曼原虫虫种包括L.major、L.tropica，或L.infantum。
优选的，所述的芯片为基因芯片、蛋白芯片或Luminex液态芯片。
优选的，所述的芯片还包括固相载体。进一步优选的，所述的固相载体选自硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片或聚丙烯膜中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述探针固定在固相载体上的方法选自原位合成法、点样法或其他固定方法。
其中，将芯片中的探针固定在所述的固相载体上。优选的，将探针序列密集有序地排列固定在固相载体预先设置的区域内，形成微型检测器件。
本发明的第五方面，提供了一种鉴定利什曼原虫虫种的方法，所述方法包括如下步骤：获得样本总DNA，PCR扩增所述的总DNA，或者对样本总DNA进行测序，采用上述的探针组确定关键碱基；
其中，PCR的反应体系包含上述的扩增引物对和上述的探针组。
优选的，所述的PCR反应体系(20μl)：
Master mix(Promega，A6001) 10ul
CL-SPD-F (10μM) 0.5μl
CL-SPD-R (10μM) 0.5μl
Probe-SPD-LM (20μM) 0.125μl
Probe-SPD-LT (20μM) 0.125μl
Probe-SPD-LDI (20μM) 0.125μl
Template 5-50ng
dH2O 补充至20 ul
其中，LM为L.major，LT为L.tropica，LDI为L.donovani或L.infantum。
优选的，所述荧光定量PCR扩增的反应条件：60℃ 30s; 94-96℃ 2-3min；94-96℃15-30s，55-60℃ 15-30s，共35-40个反应循环;60℃ 30s 。
进一步优选的，所述荧光定量PCR扩增的反应条件：60℃ 30s; 95℃ 2min；95℃15s，60℃ 30s，共40个循环;60℃ 30s。
本发明的第六方面，提供了上述试剂盒或芯片、上述的探针组或者上述的扩增引物对在鉴定利什曼原虫虫种中的应用或者在制备诊断利什曼病的产品中的应用。
本发明所述的鉴定为区分样本中利什曼原虫为L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantum，或者，所述的鉴定为确定样本中是否包含L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantum，或者，所述的鉴定为确定样本中是否含有L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantum。本申请所述的鉴定也可以为确定利什曼原虫虫种是否存在或者含量。以及，通过本申请的探针组也可以用于利什曼原虫的定位。
优选的，所述的样本为皮肤DNA。
优选的，所述的利什曼病为皮肤利什曼病。
本发明还提供了一种诊断利什曼病的方法，所述的方法包括使用上述试剂盒或芯片、上述的探针组或者上述的扩增引物对进行PCR，鉴定利什曼原虫虫种。
优选的，所述的利什曼病为皮肤利什曼病。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
使用皮肤利什曼原虫虫种鉴定荧光定量PCR试剂盒或芯片可以对皮肤利什曼病感染原虫L.major、L.tropica、L.donovani或L.infantum进行虫种鉴定。此技术与现有的技术相比具有可应用于临床，使用便捷，鉴定准确的优势，可以推广使用。
本发明所述的术语PCR是指聚合酶链式反应。
本发明所述的术语dNTPs是指三磷酸碱基脱氧核苷酸，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP等。
本发明中的CL为Cutaneous leishmaniasis皮肤利什曼病。
附图说明
图1：仅加入构建的L.major质粒测试皮肤利什曼病原体L.major（图A）、L.tropica（图B）和L.donovani或L.infantum（图C）的虫种鉴定检测结果；
图2：仅加入构建的L.tropica质粒测试皮肤利什曼病原体L.major（图A）、L.tropica（图B）和L.donovani或L.infantum（图C）的虫种鉴定检测结果；
图3:仅加入构建的L.donovani或L.infantum质粒测试皮肤利什曼病原体L.major（图A）、L.tropica（图B）和L.donovani或L.infantum（图C）的虫种鉴定检测结果；
图4：加入构建的L.major、L.tropica和L.donovani或L.infantum质粒测试皮肤利什曼病原体L.major（图A）、L.tropica（图B）和L.donovani或L.infantum（图C）的虫种鉴定鉴定结果。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。如无特殊说明，均为常规方法。除非另行定义，文中所用的专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
人皮肤中利什曼原虫总DNA的提取（Qiagen 69506;血液,组织DNA提取试剂盒）：
（1）取皮肤利什曼患者的皮损组织10-50mg，尽量剪成小块，加入20μl蛋白酶K和180μl buffer ATL，混匀，56℃金属浴上振荡消化完全；
（2）消化好的样本溶液加入200μl buffer AL，震荡混匀15s，56℃金属浴上孵育10分钟；
（3）加入200μl无水乙醇，振荡混匀15秒；
（4）将上述液体加入过滤柱中，8000转离心1分钟；
（5）弃掉液体，换新的接收管，加入洗液1500μl，8000转离心1分钟；
（6）弃掉液体，换新的接收管，加入洗液2500μl，14000转离心3分钟；
（7）弃掉液体，换新的接收管，14000转离心1分钟；
（8）加入100μl洗脱液，静置1分钟，14000转离心1分钟，收集到的即为提取的DNA。
实施例1 皮肤利什曼原虫虫种鉴定基因的选择以及虫种鉴定检测系统引物及探针的设计
从利什曼原虫的42个保守基因中筛选出具有序列多态性的基因Spermidinesynthase (SPDSYN)，根据SPDSYN基因上的SNPs设计引物和探针组合（表1）。
表1 扩增目标基因的引物序列及扩增条件
Figure 504025DEST_PATH_IMAGE001
实施例2 构建皮肤利什曼原虫L.major、L.tropica和L.donovani或L.infantum的标准质粒
1.目的片段的制备及纯化：
（1）建立PCR扩增反应体系：2×GoTaq Green Master Mix 10μl，引物T-SPD-F200nM，引物T-SPD-R 200nM，56ng/μl DNA样品0.5μl，无菌双蒸水补充至20μl，DNA样品来自实验室保存的利什曼原虫L.major、L.tropica和L.donovani或L.infantum感染的临床样本中提取,其中，引物T-SPD-F序列为5’-aaacgacggccagtgaattcAGATCATTGCGTACTTGAC-3’（SEQ ID NO：6），引物T-SPD-R序列为5’-accatgattacgccaagcttTCATCGACACAACGGACC-3’（SEQ ID NO：7）。
（2）PCR扩增反应条件：95℃，5min；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 30s，共35个循环；72℃ 5min，4℃ ∞。
（3）扩增产物回收：采用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，使用天根生物的通用性DNA纯化回收试剂盒切胶回收目的片段。
2.质粒载体的酶切及纯化：
（1）EcoRⅠ和HindⅢ酶切质粒载体pUC19线性化的酶切反应体系：HindⅢ 1ul，EcoRⅠ 1ul，10×M buffer 2ul，pUC19 1μg，dH2O 14ul。
（2）酶切的反应条件：37℃ 1h。
（3）线性化pUC19质粒的回收：采用1%琼脂糖凝胶电泳检测步骤（2）酶切后的产物，使用天根生物的通用性DNA纯化回收试剂盒切胶回收线性化的pUC19质粒。
3.目的片段与线性化质粒载体pUC19的重组及转化：
（1）重组反应体系：线性化载体pUC19 50ng，目的片段8ng，2×EasyGeno AssemblyMix 5μl，无菌双蒸水补充反应体系至10μl；
（2）反应条件：50℃水浴，15min；
（3）取100μl感受态细胞DH5α置于冰浴中解冻；
（4）在步骤（3）的感受态细胞DH5α悬液中加入步骤（2）的10ul重组产物，轻弹混匀，在冰浴中静置30min；
（5）将步骤（4）的样品置于42℃水浴中放置90s，然后快速转移到冰浴中，使细胞冷却3min，该过程不要摇动离心管；
（6）在步骤（5）的样品中加入350ul无菌的不含抗生素的37℃预热的SOC培养基，混匀后置于37℃摇床震荡培养45min；
（7）吸取步骤（6）的已转化的感受态细胞100ul，加到含100 μg/ml氨苄青霉素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的平板涂布棒轻轻的将细胞均匀涂开，将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16h。
4.单克隆菌株的鉴定：
（1）随机挑取步骤3.（7）中的单克隆菌株放入含有氨苄青霉素的LB培养基中培养，并送测序；
（2）测序结果如SEQ ID NO：8，质粒的测序结果含有插入的目的序列且与L.majorSPD的SNPs一致；SEQ ID NO：9，含有插入的目的序列，且与L.tropica SPD基因的SNPs位点一致，质粒构建成功；SEQ ID NO：10，含有插入的目的序列，且与L.donovani或L.infantumSPD基因的SNPs位点一致，质粒构建成功。
5.质粒DNA的提取（天根生物的通用型DNA纯化回收试剂盒（DP214-02）切胶回收线性化的pUC19质粒）：
（1）将测序鉴定含有目的序列的菌株在含有氨苄青霉素的LB培养基中扩大培养；
（2）将步骤（1）的培养菌株12000rpm离心1min，收集菌体；
（3）在步骤（2）的样品中加入150μl溶液P1，涡旋振荡混匀；
（4）在步骤（3）的样品中加入150μl溶液P2，温和的上下翻转6-8次，使菌体充分裂解；
（5）在步骤（4）的样品中加入350μl溶液P5，立即快速上下颠倒数次，充分混匀；
（6）将步骤（5）的样品12000rpm离心2min，将上清液转移到吸附柱CP3中，12000rpm离心30s，倒掉废液；
（7）将步骤（6）的吸附柱CP3放入收集管中，并加入300μl漂洗液PWT，12000rpm离心30s，倒掉废液；
（8）将步骤（7）的吸附柱CP3放回收集管，12000rpm离心1min；
（9）将步骤（8）的吸附柱CP3置于一个新的离心管中，向膜的中间位置加50μl洗脱缓冲液TB，12000rpm离心30s，收集溶液，即为质粒DNA，并用NanoDrop定量。
实施例3 使用构建的标准质粒测试皮肤利什曼原虫虫种鉴定检测系统
（1）使用构建好的L.major、L.tropica和L.donovani或L.infantum的质粒DNA，将其稀释为浓度为105copies/μl，测试皮肤利什曼感染病原体L.major、L.tropica和L.donovani或L.infantum虫种鉴定检测体系；
（2）荧光定量PCR扩增的反应体系：引物CL-SPD-F 250nM、引物CL-SPD-R 250nM和探针Probe-SPD-LM 125nM，探针Probe-SPD-LT 125nM 1μl, 探针Probe-SPD-LDI 125nM 1μl,上述引物和探针浓度是在反应体系中的终浓度，浓度为105 copies/μl的L.major、L.tropica和L.donovani或L.infantum的质粒DNA各1μl，10μl的GoTaq® Probe qPCRMaster Mix，无菌双蒸水补齐至20μl；
（3）荧光定量PCR扩增的反应条件：95℃2min；95℃15s，60℃30s，40个循环。
（4）获得的扩增曲线如图1-4所示，表明本申请设计的引物及探针可以对皮肤利什曼病感染原虫L.major、L.tropica和L.donovani或L.infantum进行准确鉴定。
实施例4 使用已知虫种的临床样本DNA验证
使用已知虫种的利什曼原虫虫种鉴定检测体系检测了19例L.major，5例L.infantum和1例L.donovani的临床样本，如表2所示，各样本均可在其品种对应的荧光条件下检测出Ct值，说明样本已在检测该品种的探针条件下进行扩增，结果显示品种符合率为100%。具体操作如下：
一、提取患者组织样本中的DNA
（1）取皮肤利什曼患者的皮损组织10-50mg，尽量剪成小块，加入20μl蛋白酶K和180μl buffer ATL，混匀，56℃金属浴上振荡消化完全；
（2）消化好的样本溶液加入200μl buffer AL，震荡混匀15s，56℃金属浴上孵育10分钟；
（3）加入200μl无水乙醇，振荡混匀15秒；
（4）将上述液体加入过滤柱中，8000转离心1分钟；
（5）弃掉液体，换新的接收管，加入洗液1500μl，8000转离心1分钟；
（6）弃掉液体，换新的接收管，加入洗液2500μl，14000转离心3分钟；
（7）弃掉液体，换新的接收管，14000转离心1分钟；
（8）加入100μl洗脱液，静置1分钟，14000转离心1分钟，收集到的即为提取的DNA。
二、使用荧光定量PCR检测仪按如下PCR反应体系及反应条件进行扩增，获得Ct值
反应体系（20μl）
Master mix(Promega，A6001) 10μl
CL-SPD-F (10μM) 0.5μl
CL-SPD-R (10μM) 0.5μl
Probe-SPD-LM (20μM) 0.125μl
Probe-SPD-LT (20μM) 0.125μl
Probe-SPD-LDI (20μM) 0.125μl
Template 2μl
dH2O 6.625μl
反应条件
Figure 952324DEST_PATH_IMAGE002
三、PCR反应扩增结束后分析结果如表2所示
表2临床样本的验证结果
Figure 13952DEST_PATH_IMAGE003
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行一些改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京友谊医院
<120> 一种皮肤利什曼原虫虫种鉴定的试剂盒
<130> 1
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agatcattgc gtacttgac 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcatcgacac aacggacc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaggaaccc catcatct 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcaggaagcc catcatct 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcaggaatcc catcatct 18
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacgacggc cagtgaattc agatcattgc gtacttgac 39
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accatgatta cgccaagctt tcatcgacac aacggacc 38
<210> 8
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agatcattgc gtacttgacg gtggcaaagc cgatatcctt cttcaggaac cccatcatct 60
tctctatcaa cgggcgatgc agccagacag actcgccctg gttgcacaca acgccgcccg 120
gccgcagaat gcggagcaca ttcgtgtaga agtccgcgcc gaacaactcc gacgccggcc 180
ccttcgggtc cgttgtgtcg atga 204
<210> 9
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agatcattgc gtacttgacc gtggcaaatc cgatatcctt cttcaggaag cccatcatct 60
tctctatcaa cgggcggtgc agccagacag actcgccctg gttgcacaca acgccgcccg 120
gccgcagaat gcggagcacg ttcgtgtaga agtccgcgcc gaacaactcc gacgccggcc 180
ccttcgggtc cgttgtgtcg atgatga 207
<210> 10
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agatcattgc gtacttgacg gtggcaaagc cgatatcctt cttcaggaat cccatcatct 60
tctctatcaa cgggcgatgc agccagacag actcgccctg gttgcacaca acgccgcccg 120
gccgcagaat gcggagcaca ttcgtgtaga agtccgcgcc gaacaactcc gacgccggcc 180
ccttcgggtc cgttgtgtcg atga 204

Claims (4)

1.一种利什曼原虫虫种鉴定的试剂盒或芯片，其特征在于，所述的试剂盒或芯片包含针对SPDSYN基因的扩增引物对和探针组，所述的SPDSYN基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，所述的利什曼原虫虫种为L.major，L.tropica、L.donovani和L.infantum的组合，所述的探针组包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5，
所述的扩增引物对为：
A）上游：5’-AGATCATTGCGTACTTGAC-3’（SEQ ID NO：1），
下游：5’-TCATCGACACAACGGACC-3’（SEQ ID NO：2）；
和
B）上游：5’-aaacgacggccagtgaattcAGATCATTGCGTACTTGAC-3’（SEQ ID NO：6），
下游：5’-accatgattacgccaagcttTCATCGACACAACGGACC-3’（SEQ ID NO：7）。
2.根据权利要求1所述的试剂盒或芯片，其特征在于，所述探针组中探针的5’端包含荧光报告基团的修饰，3’端包含荧光淬灭基团的修饰，所述的荧光报告基团选自VIC、6-FAM、Tex Red、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、LC RED640或LC RED705，所述的荧光淬灭基团选自DABCYL、BHQ1、BHQ2或BHQ3。
3.根据权利要求1所述的试剂盒或芯片，其特征在于，所述的探针组为5’-VIC-SEQ IDNO：3-BHQ1-3’、5’-6-FAM-SEQ ID NO：4-BHQ1-3’和5’-Tex Red-SEQ ID NO：5-BHQ2-3’。
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒或芯片，其特征在于，所述的试剂盒或芯片还包含PCR反应所需试剂，所述的PCR反应所需试剂选自Taq DNA聚合酶、dNTPs、酶稳定剂、TaqDNA聚合酶反应缓冲液、溴酚蓝染料或水中的一种或两种以上的组合。
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