CN113308518B

CN113308518B - Dna甲基化的超敏检测方法及其应用

Info

Publication number: CN113308518B
Application number: CN202110615426.8A
Authority: CN
Inventors: 罗阳; 张亮亮; 赵贤贤; 胡孝林; 陈恒屹; 于兴乐
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2041-06-02
Also published as: CN113308518A

Abstract

本发明属于核酸分析方法技术领域，公开了一种DNA甲基化的超敏检测方法及其应用，该检测方法包括依次进行的滚环扩增、内切酶切割二次滚环扩增及CRISPR‑Cas12a检测三个步骤，能实现DNA甲基化信号三重放大及检测，解决现有DNA甲基化检测技术中存在的周期长、灵敏度低、成本高等问题。本发明适用于制备试剂盒检测癌症等疾病基因甲基化水平，对提升滚环扩增的性能，使其在生物传感、诊断、药物筛选和纳米技术等领域得到广泛应用具有十分重要的意义。

Description

DNA甲基化的超敏检测方法及其应用

技术领域

本发明属于核酸分析方法技术领域，涉及DNA的检测方法及其应用，具体地说是一种DNA甲基化的超敏检测方法及其应用。

背景技术

DNA的甲基化发生是在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程，在基因调控区启动子上富含CpG序列，而这些CpG序列的甲基化水平与基因的表达密切相关。

近年来，随着聚合酶链式反应技术(PCR)的快速发展，抑癌基因的甲基化与癌症的关系得到不断深入的研究；研究表明，抑癌基因启动子区CpG岛的异常甲基化导致抑癌基因失活，是癌症发生的一个重要机制，而且甲基化水平随着癌症的发展而提高；一些基因的高甲基化水平有可能成为肿瘤乃至癌细胞形成的标志物，如何在癌症早期了解相关抑癌基因启动子区CpG岛的甲基化状态，即如何高效、准确地检测DNA的甲基化水平，对于及时发现和治疗癌症有着非常重要的意义。

目前，针对DNA甲基化的检测手段主要有：①直接测序法，这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准，但有着需要大量克隆测序，过程较为繁琐、成本高昂等缺点；②焦磷酸测序法，虽然该法提高检测速度，但焦磷酸测序的准确性受制于片段长度，CpG与前向引物3’端的距离也可影响检测结果的准确性；③甲基化敏感性限制性内切酶-PCR法，该法是利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区域不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析，相对简单、成本低廉、甲基化位点明确，实验结果易于解释；但存在非酶切位点的CG位点被忽略、只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时，该检测方法的结果才有意义以及存在着酶消化不完全引起的假阳性问题等缺点；④甲基化特异性PCR法，它是在重亚硫酸盐处理的基础上建立的一种方法，该方法很好的避免了使用限制性内切酶及其后续相关的问题，且敏感性高；但仍有需预先知道待测片段的DNA序列、仅可用于定性研究、若待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡，则检测复杂程度大增等缺点。因此，亟需提供一种超敏、快速的DNA甲基化检测技术。

近年来，滚环扩增技术(rolling circle amplification,RCA)作为一种分子扩增方法，与PCR相比，其具有诸多优势，例如：可在室温下催化DNA聚合；可以很容易地结合其它检测平台(如微阵列)，用于并行的或高通量的分析等，但在纳米技术和生物检测方面的研究和应用，特别是在功能核酸方面的研究和应用仍处于初级阶段。

因此，设计一种结合滚环扩增技术与新型基因编辑技术的超敏、快速的DNA甲基化检测技术，促进将RCA商业化应用于甲基化检测技术，对提升滚环扩增技术的性能，使其在生物传感、诊断、药物筛选和纳米技术等领域得到广泛应用具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的，是要提供一种DNA甲基化的超敏检测方法，它是由依次进行的滚环扩增技术、内切酶切割触发二次滚环扩增及CRISPR-Cas12a检测组成的DNA甲基化信号放大及检测方法，以实现解决现有技术中存在的检测周期长、灵敏度低、成本高等问题的目的；

本发明的另一个目的，是要提供上述DNA甲基化的超敏检测方法的一种应用，它用于制备试剂盒检测癌症基因甲基化水平。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种DNA甲基化的超敏检测方法，它包括依次进行的滚环扩增技术、内切酶切割触发二次滚环扩增及CRISPR-Cas12a检测；

该方法是一种DNA甲基化信号放大及检测方法。

作为一种限定，它包括依次进行的以下步骤：

S1.滚环扩增：

将待扩增DNA样品、锁式探针、T4连接酶、phi29聚合酶及dNTP混匀成体系，进行滚环扩增反应，得混合物α；

其中，具体为，将2-5μM待扩增DNA样品、2-5μM锁式探针、2μL T4连接酶、3μL phi29聚合酶及2μL dNTP混匀成体系，于37℃进行滚环扩增反应，得混合物α；

优选地，将2μM待扩增DNA样品、2μM锁式探针、2μL T4连接酶、3μL phi29聚合酶及2μL dNTP混匀成体系，于37℃进行滚环扩增反应，得混合物α；

S2.内切酶切割触发二次滚环扩增：

向混合物α加入内切酶，切割，使靶标DNA序列游离，进行二次滚环扩增反应，得产物β；

其中，混合物α包括经滚环扩增克隆得到的少量DNA片段、滚环扩增反应体系中未参与反应的原料及酶等，而产物β为经二次滚环扩增克隆得到的大量DNA片段；

S3.CRISPR-Cas12a检测：

取产物β，灭活内切酶，设计与产物β序列互补的sgRNA及报告探针，采用CRISPR-Cas12a体系进行反应，通过报告探针检测，得结果。

其中，sgRNA与产物β的DNA序列部分互补。

作为进一步限定，所述待扩增DNA样品是经转化制得，所述转化是将DNA样品的非甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变。

作为进一步限定，所述转化是取DNA样品经转化剂转化处理，得待扩增DNA样品，备用。

作为再进一步限定，所述转化采用的转化剂为肼盐、重亚硫酸氢盐或亚硫酸氢盐。

作为进一步限定，所述内切酶为双链特异性核酸酶或核酸外切酶III。

作为更进一步限定，所述靶标DNA序列为甲基化序列，并且其与锁式探针两端互补。

作为进一步限定，所述报告探针修饰有荧光基团及淬灭基团。

本发明还提供了上述上述DNA甲基化的超敏检测方法的一种应用，用于制备试剂盒检测乳腺癌、肺癌等癌症基因甲基化水平。

本发明由于采用了上述技术方案，其与现有技术相比，所取得的技术进步在于：

(1)本发明通过设计特异性的锁式探针精准识别甲基化序列，保证了该方法的特异性；利用恒温扩增的滚环扩增技术实现甲基化信号的第一重放大；通过内切酶切割触发二次滚环扩增，将产物α切割成两部分，一部分序列与靶标DNA序列一致可以形成进行第二次滚环扩增，构成甲基化信号的第二重放大；

另一部分序列能够被CRISPR-Cas12a体系识别，借助Cas12a酶的“反式切割”特性实现甲基化信号的第三重放大，并通过检测报告探针实现对结果的判读；

(2)本发明提供了一种超敏、快速的DNA甲基化检测技术，该方法在保证检测特异性的同时，通过三重信号放大途径，极大地提高了甲基化检测灵敏度，同时使用T4连接酶提高了检测的特异性，对于肿瘤的早期筛查具有极大的临床意义；

(3)本发明的DNA甲基化检测技术一体化进行检测，转化、滚环扩增及内切酶切割触发二次滚环扩增过程无需回收产物及更换反应体系，极大提高了检测效率；

本发明的检测方法简单易操作，成本低，可用于制备检测试剂盒商业化应用，该方法实现了滚环扩增与新型基因编辑技术CRISPR-Cas12a的结合，为其它基于滚环扩增的高敏、高通量基因分析检测方法在生物传感、诊断、药物筛选和纳米技术等领域的开发提供启示意义；本发明适于用作试剂盒检测疾病基因甲基化水平。

附图说明

图1为本发明实施例1中聚丙烯酰胺凝胶电泳验证RCA扩增成功的结果图；

图2为本发明实施例1中报告基因荧光检测结果图；

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。

如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得，所用工艺如无特殊说明，均为本领域常规工艺方法。

实施例1一种基于重亚硫酸氢盐的DNA甲基化的超敏检测方法

实验材料：实验中所需的序列均合成于生工生物工程(上海)股份有限公司，RCA反应所需的酶phi29聚合酶、T4连接酶、Nb.BbvCI切刻内切酶\CRISPR-Cas12a蛋白购买于NEB。

DNA重亚硫酸氢盐转化试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；

本实施例的方法是包括依次进行的滚环扩增、内切酶切割触发二次滚环扩增及CRISPR-Cas12a检测的DNA甲基化检测方法；

它包括依次进行的以下步骤：

一、转化：

采用DNA重亚硫酸氢盐转化试剂盒，进行亚硫酸氢盐转化处理，实验方法参考试剂盒说明书，具体为：

S11.取130μl的CT Conversion Reagent和20μl的DNA样本，混合于1.5mL离心管；

DNA样本的结构为：5’-GAG GGT GGG G^mCG GAC ^mCG^mC GTG ^mCGC T^mC G G^mCG G^mCTG-3’；

S12.将离心管放入98℃水浴锅中10分钟，64℃水浴锅中2.5个小时；

S13.将离心管中的溶液吸出，加入到Zymo-SpinTM的萃取柱中；

S14.取600μl的M-Binding Buffer加入到萃取柱中，摇晃混匀；

S15.转速＞10000转/分钟的离心机中，离心30秒，倒掉液体；

S16.取100μl的M-Wash Buffer加入萃取柱，离心30秒，倒掉液体；

S17.取200μl的M-Desulphonation Buffer加入萃取柱，等待17分钟，使其充分浸润，离心30秒；

S18.取200μl的M-Wash Buffer加入离心管中，离心30秒，重复此步骤一次，随后将收集柱丢弃，萃取柱放入1.5mL离心管中；

S19.取10μl的M-Elution Bufer加入到萃取柱中，离心30秒，萃取柱丢弃，离心管中得到处理好的10μl待扩增DNA样品，备用。

经上述操作，非甲基化的序列经过处理，胞嘧啶转变为尿嘧啶无法与锁式探针结合，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变。

二、滚环扩增：

利用DNAman设计特异性锁式探针(即Padlock序列)，其包含与待扩增DNA样品中甲基化序列部分互补的片段；

Padlock序列为：

5’-CACGCGGTCCGCCCCACCCTCGCTGAGGAAAAAAACAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATATTAATAACATCCAAAATTAGCTGAGGCAGCCGCCGAGCG-3’

其中，与待扩增DNA样品中甲基化序列互补的片段为：

5’-CACGCGGTCCGCCCCACCCT-3’

5’-CAGCCGCCGAGCG-3’

将2μM待扩增DNA样品、2μM锁式探针、2μL T4连接酶、3μL phi29聚合酶及2μL dNTP混匀成体系，于37℃进行滚环扩增反应，得混合物α，仅取1μL用于验证滚环扩增反应结果；

验证滚环扩增反应是否成功：

取1μL混合物α、及等量对照用途的Methylated DNA、Unmethylated DNA、Padlockprobe、Unmethylated RCA product和Marker经聚丙烯酰胺凝胶电泳验证；

其中聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图1所示，图中，Methylated RCA product泳道结果条带在500bp以上，表明滚环扩增反应成功。

三、内切酶切割触发二次滚环扩增：

向2μL混合物α加入2μL双链特异性核酸酶，37℃切割，使靶标DNA序列游离，利用混合物α中滚环扩增体系中剩余原料，37℃，2h，进行二次滚环扩增反应，得产物β；

四、CRISPR-Cas12a检测：

取5μL产物β，灭活双链特异性核酸酶，设计与产物β中滚环扩增序列部分互补的sgRNA及报告探针，加入2μM该探针进入反应体系。

sgRNA序列为

5’-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUAUAGUGAGUCGUAUAUU-3’；

报告探针结构为5’-FAM-ATTCGCGTTA-BHQ₂-3’；

采用2μl CRISPR-Cas12a蛋白、3μL buffer、2μL报告探针的CRISPR-Cas12a反应体系，在37℃反应20min，反应结束后，通过荧光分光光度计对报告探针表达的荧光强度检测，结果如图2所示。

结果表明，相较于对照组，甲基化的DNA荧光强度高，可明显区别于非甲基化的DNA，本发明的方法可有效检测DNA甲基化水平。

实施例2一种基于肼盐的DNA甲基化的超敏检测方法

本实施例的方法是包括依次进行的RCA扩增、内切酶切割触发二次滚环扩增及CRISPR-Cas12a检测的DNA甲基化检测方法；

它包括依次进行的以下步骤：

一、转化：

采用DNA肼盐转化试剂盒，进行转化处理，实验方法参考试剂盒说明书，得待扩增DNA样品，备用。

步骤二及三与实施例1的基本相同，不同之处仅在于内切酶选用核酸外切酶III，得产物β；

步骤四与实施例1相同，经荧光分光光度计对报告探针表达的荧光强度检测，结果表明，相较于对照组，甲基化的DNA荧光强度高，可明显区别于非甲基化的DNA，本发明的方法可用于制备试剂盒有效检测癌症基因甲基化水平。

实施例3一种基于核酸外切酶III的DNA甲基化的超敏检测方法

它包括依次进行的以下步骤：

一、转化：

采用DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒，进行转化处理，实验方法参考试剂盒说明书，得待扩增DNA样品，备用。

此外，在步骤二中，将2-5μM待扩增DNA样品、2-5μM锁式探针、2μL T4连接酶、3μLphi29聚合酶及2μL dNTP混匀成体系，于37℃进行滚环扩增反应，得混合物α，均可实现相同效果。

需要注意，上述实施例，仅是本发明的较佳实施例，并非是对本发明所作的其他形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员都可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆大学

<120> DNA甲基化的检测方法及其应用

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cacgcggtcc gccccaccct cgctgaggaa aaaaacagaa attaccctat agtgagtcgt 60

atattaataa catccaaaat tagctgaggc agccgccgag cg 102

<210> 2

<211> 39

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

uaauuucuac uaaguguaga uuauagugag ucguauauu 39

Claims

1.一种非疾病诊断和治疗目的的DNA甲基化的超敏检测方法，其特征在于，它包括依次进行的滚环扩增、内切酶切割触发二次滚环扩增及CRISPR-Cas12a检测；

其中，包括依次进行的以下步骤：

S1.RCA扩增：

将2μM待扩增DNA样品、2μM锁式探针、2μL T4连接酶、3μL phi29聚合酶及2μL dNTP混匀成体系，于37℃进行滚环扩增反应，得混合物α；

S2.内切酶切割触发二次滚环扩增：

S3.CRISPR-Cas12a检测：

取产物β，灭活内切酶，设计与产物β序列互补的sgRNA及报告探针，采用CRISPR-Cas12a体系进行反应，通过报告探针检测，得结果；

步骤S1中，所述待扩增DNA样品是经转化制得，所述转化是将DNA样品的非甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶碱基保持不变；

步骤S2中，所述内切酶为双链特异性核酸酶或核酸外切酶III ；所述靶标DNA序列为甲基化序列，该序列与锁式探针两端互补。

2.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗目的的DNA甲基化的超敏检测方法，其特征在于，所述转化是取DNA样品经转化剂转化处理，得待扩增DNA样品，备用。

3.根据权利要求1所述的非疾病诊断和治疗目的的DNA甲基化的超敏检测方法，其特征在于，所述转化采用的转化剂为肼盐、重亚硫酸氢盐或亚硫酸氢盐。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的非疾病诊断和治疗目的的DNA甲基化的超敏检测方法，其特征在于，所述报告探针修饰有荧光基团及淬灭基团。