CN105349683A - 目标物保护的哑铃分子探针介导的级联滚环扩增策略用于dna甲基转移酶活性的灵敏检测 - Google Patents

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Abstract

本发明提供目标物保护的哑铃分子探针介导的级联滚环扩增策略用于DNA甲基转移酶活性的灵敏检测，基于目标物保护的哑铃分子探针介导的级联的滚环扩增策略，我们开发了一种新颖的DNA甲基转移酶活性分析的荧光检测系统。该检测体系具有出色的特异性和灵敏性，检测限低至0.0024U/mL，在定量监测甲基转移酶活性和抗癌药物的筛选中表现出潜在的应用价值。

Description

目标物保护的哑铃分子探针介导的级联滚环扩增策略用于DNA甲基转移酶活性的灵敏检测
技术领域
本发明涉及酶活性检测领域，具体涉及一种目标物保护的哑铃分子探针介导的级联的滚环扩增策略检测DNA甲基转移酶活性的方法、探针和试剂盒。
背景技术
DNA甲基转移酶的功能是维持基因组的甲基化模式，在调控基因表达和维持基因组稳定性中发挥着重要的作用。甲基转移酶活性的异常会导致异常的DNA甲基化模式，从而使得肿瘤抑制基因沉默并导致癌症的发生。因此DNA甲基转移酶的活性已经成为许多癌症的预测标志物和治疗靶点。此外，甲基转移酶活性的异常通常发生在其他恶性肿瘤迹象之前，因此在癌症的早期诊断中具有潜在的应用价值。因此，准确和灵敏的甲基转移酶活性分析和抑制剂的筛选用于活性抑制为临床诊断和药物开发提供了一种有价值的策略。
检测DNA甲基转移酶活性的传统的方法包括辐射标记法，高效液相色谱法，凝胶电泳法和基于免疫的分析方法。除了这些方法，一些新颖的具有提高的检测灵敏度，特异性和简便性的策略也已经被报道，包括荧光法，比色法，生物发光法，化学发光法，电化学和电致化学发光法。在大多数的这些新颖的方法中，DNA分子探针由于具有独特的分子识别能力和设计的灵活性而在目标物识别和信号扩增中起到了重要的作用。首先，DNA分子探针被赋予了DNA甲基转移酶和甲基化敏感的限制性内切酶的双识别功能，用于区分甲基化的和未甲基化的DNA分子探针。此外，DNA分子探针中也含有能够介导扩增策略的DNA触发链序列用于放大区分事件。目前，大多数已报道的用于DNA甲基转移酶活性分析的DNA分子探针都是双链DNA或发夹DNA。在DNA甲基转移酶和内切酶作用之后，DNA触发链被释放或完整的DNA探针被保留来放大甲基化事件。尽管这些方法实现了灵敏的DNA甲基转移酶的活性分析，但是仍然存在一些影响检测准确性和灵敏性的局限。双链DNA或发夹DNA中的DNA触发链处于半封闭的状态，因此DNA分子探针和后续的信号扩增探针的杂交或放大体系中探针和核酸酶的非特异性的作用可能导致非特异性的扩增。此外，通常也需要其他的DNA探针(如挂锁探针，发夹探针或标记的信号探针)来将识别事件转导为放大的信号的输出，而这种间接的检测模式会导致灵敏度的降低和复杂的探针设计。
发明内容
鉴于以上的局限性，本文中我们基于目标物保护的哑铃分子探针(D-probe)介导的级联的滚环扩增策略开发了一种准确、灵敏的DNA甲基转移酶活性分析方法(图1)。首先D-probe作为甲基转移酶和内切酶的酶联识别探针。随后，甲基化保护的D-probe保留完整性并可作为级联的滚环扩增的环状模板。最后，级联的滚环扩增产生大量的D-probe复制体，这些复制体能够与多分子标记的SybrGreenI染料结合，产生协同放大的荧光信号用于检测。与已报道的基于双链或发夹DNA分子探针相比，该方法具有以下的特点：(1)D-probe同时作为DNA甲基转移酶和内切酶的识别探针，级联的滚环扩增的模板和信号探针避免了多个探针设计的需要。(2)一旦未甲基化的D-prone被内切酶切为两部分，级联的滚环扩增能够被有效的阻止，因此降低了非特性的扩增。(3)级联的滚环扩增和多分子标记的SybrGreenI的协同放大作用能够保证甲基转移酶活性分析的灵敏度的提高。(4)DNA甲基转移酶和内切酶的酶联识别之后，D-probe能够被级联的滚环扩增过程直接的放大。这种更直接的检测模式会带来更简单和灵敏的甲基转移酶活性的分析。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测DNA甲基转移酶活性或抑制剂药物的筛选的哑铃分子探针，该探针颈部含有能被甲基转移酶和对甲基化敏感的限制性内切酶识别的5’-CCGG-3’序列，该探针环部含有能够介导级联的滚环扩增的DNA触发的5-CCGG-3’的四核苷酸序列。
优选的，所述探针序列为SEQIDNO:1所示：
SEQIDNO:1：
p-CCGGTTCCTCTCTTAGTGCAGAGTACGGAGATAGGGAGAAAGGAGAGGAACCGGGTGTGTGTAAAGAAAGAAAGAAAGACACACAC。
本发明的上述的探针可用于检测甲基转移酶活性或抑制剂药物的筛选。
本发明还提供了一种检测甲基转移酶活性的方法，根据上述探针发生甲基化与否，以及能否进而被对甲基化敏感的限制性内切酶剪切从而发生随后的级联的滚环复制和荧光染色来判断甲基转移酶的活性。
优选的，具体包括如下步骤：
1)设计权利要求1或2所述的探针；
2)将甲基化转移酶、限制性内切酶同时作用于该探针；
3)将得到的产物进行级联滚环扩增；
4)向级联滚环扩增产物中加入相应的荧光染料，检测信号强度，根据信号强度和甲基转移酶活性的对应关系判定待测甲基转移酶的活性。
优选的，所述步骤2)的具体作用过程为：
若甲基转移酶不存在时，所述探针的5’-CCGG-3’的序列能够被对甲基化敏感的限制性内切酶识别，并在胞嘧啶之间切割为两部分；随后的级联的滚环扩增过程被阻止；若甲基转移酶存在时，该探针的5’-CCGG-3’的序列中的胞嘧啶被甲基化，形成5’-CCmGG-3’的序列对甲基化敏感的限制性内切酶的切割被阻止，随后进行级联的滚环扩增。
优选的，所述级联滚环扩增的具体步骤为：将步骤2)得到的甲基化保护的完整的D-probe与引物1——P1杂交，并在phi29DNA聚合酶的作用下进行线性的滚环扩增，形成长的重复的D-probe的复制体；然后，引物2——P2被加入沿着RCA的产物形成多重的双链片段，形成的双链片段被RsaI识别并切割，使得长的RCA产物转化为多个新的D-probe单体；随后，对RsaI进行热失活，使得碎片P2从新的D-probe单体上解离下来，完整的P2与新的D-probe单体杂交；再然后，新形成的多个环状的D-probe单体和P2触发新一轮的滚环扩增，产生更多的D-probe复制体；
其中，所述的RsaI能够识别和切割双链回文序列5’-GT↓AC-3’，↓代表切割位点。
更优选的，所述引物1序列为SEQIDNO:2所示，
SEQIDNO:2：
CTCCCTATCTCCGTACTCTGCA。
更优选的，所述引物2序列为SEQIDNO:3所示：
SEQIDNO:3：
TGCAGAGTACGGAGATAGGGAG。
本发明还提供了一种用于检测甲基转移酶活性或抑制剂药物的筛选的试剂盒，所述试剂盒包括上述的任意一项探针。
本发明的有益效果：
总而言之，我们已经开发了一种目标物保护的哑铃分子探针介导的级联的滚环扩增策略用于准确和灵敏的DNA甲基转移酶活性的分析。HpaII充分的切割和级联的滚环扩增对环状模板的依赖性提高了扩增的特异性。级联的滚环扩增和多分子标记的SybrGreenI的引入提高了检测的灵敏度。多功能化的哑铃分子探针的设计避免了复杂的探针设计。通过该策略获得了宽的动力学范围(0.01到50U/mL)和低的检出限(0.0024U/mL)。我们也证实了该策略在含有细胞裂解液的样品中工作的有效性。更重要的是，利用该方法也能便利的评估5-Aza-dC和5-Aza的抑制效应，从而在定量监测和甲基转移酶活性和抑制剂药物的筛选中显示出潜在的应用价值。这些结果表明该传感策略在临床诊断和治疗中是一种可取的有价值的策略。
附图说明
图1.基于目标物保护的哑铃分子探针介导的级联的滚环扩增策略用于DNA甲基转移酶活性分析的原理
图2.(A)聚丙烯酰胺电泳实验验证甲基化过程，(B)琼脂糖电泳实验分析滚环扩增产物，(C)荧光实验验证整体实验的可行性
图3.(A)不同浓度的M.SssI下的荧光图谱；(B)荧光净信号与M.SssI浓度之间的线性关系。
图4.(A)基于目标物保护的哑铃分子探针介导的线性的滚环扩增策略用于DNA甲基转移酶活性分析的原理，(B)线性滚环扩增体系不同浓度的M.SssI下的荧光图谱；(C)线性滚环扩增体系荧光净信号与M.SssI浓度之间的线性关系。
图5.不同胞嘧啶甲基转移酶对ΔF的影响
图6.细胞裂解液体系中荧光净信号与M.SssI浓度之间的线性关系。
图7.不同浓度的5-氮杂胞苷(5-Aza)和5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-dC)对甲基转移酶活性的抑制作用。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
原理
哑铃分子探针(D-probe)的设计和整个工作原理(以M.SssI甲基转移酶为例)如图1所示。首先，D-probe通过分子内的DNA杂交形成稳定的哑铃结构。D-probe茎部的红色部分设计为5’-CCGG-3’的回文序列来识别M.SssI甲基转移酶和HpaII内切酶。M.SssI甲基转移酶能够将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到5’-CCGG-3’的回文序列中的胞嘧啶上，形成5’-CCmGG-3’。HpaII内切酶能够切割5’-CCGG-3’的双链回文序列，切割位点位于胞嘧啶之间，但是胞嘧啶甲基环的回文序列不能被HpaII切割。此外，D-probe一个环部的橘色部分含有5’-GTAC-3’的四核苷酸序列用于级联的滚环扩增。如图1，该M.SssI甲基转移酶活性分析方法包括两部分的过程，一个是M.SssI甲基转移酶和HpaII内切酶的酶联识别过程，另一个是级联的滚环扩增和信号产生的过程。第一部分中，当M.SssI甲基转移酶不存在时，D-probe茎部的5’-CCGG-3’的回文序列能够被HpaII内切酶识别，并在胞嘧啶之间切割为两部分。因此，随后的级联的滚环扩增过程被阻止，产生微不足道的荧光信号。然而，当M.SssI甲基转移酶存在时，D-probe茎部的5’-CCGG-3’的回文序列中的胞嘧啶被甲基化，形成5’-CCmGG-3’的回文序列，HpaII内切酶的切割被阻止，因此能够进行甲基化保护的级联的滚环扩增过程(如下)。首先，甲基化保护的完整的D-probe与引物1(P1)杂交，并在phi29DNA聚合酶的作用下进行线性的滚环扩增，形成长的重复的D-probe的复制体。然后，引物2(P2)被加入沿着RCA的产物形成多重的双链片段，形成的双链片段能够被RsaI(能够识别和切割双链回文序列5’-GT↓AC-3’，↓代表切割位点)是被并切割，使得长的RCA产物转化为多个新的D-probe单体。随后，对RsaI进行热失活，同时该过程也起到了退火的作用，使得碎片P2从新的D-probe单体上解离下来，完整的P2与新的D-probe单体杂交。值得注意的是，P2偏向于与同一个单体的末端杂交，在T4DNA连接酶的作用下形成环状的单体产物而不是线性的串联体。再然后，新形成的多个环状的D-probe单体和P2触发新一轮的滚环扩增，因此实现级联的滚环扩增，产生更多的大量的D-probe复制体。最后，多分子插入的SybrGreenI与D-probe复制体的茎部结合，产生明显增强的荧光信号。因此，通过荧光信号的测量能够实现灵敏的、准确的M.SssI甲基转移酶活性的分析。
可行性
为了研究该M.SssI甲基转移酶活性分析方法的可行性，聚丙烯酰胺电泳实验首先被用来验证甲基化过程。如图2A，M.SssI甲基转移酶不存在时，电泳条带3中可以观察到两条迁移速率比较快的亮带，表明未甲基化的D-probe被内切酶切成了两部分。然而，当M.sssI甲基转移酶和HpaII内切酶都存在时，条带2中仅能观察到一条与原始的D-probe(条带1)迁移速率相同的亮带，表明甲基化反应的发生以及甲基化的D-probe不能被HpaII内切酶切断。
为了进一步验证甲基化保护的D-probe能够被级联的滚环扩增过程放大，琼脂糖电泳实验被用来检测放大产物。如图2B，条带a中没有明显的亮带，表明没有明显的RCA过程的发生，这与D-probe被HpaII内切酶切割成两段不能触发级联的滚环扩增的事实一致。作为对比，在条带b和c中，分别有明显的具有高分子量的亮带，表明滚环扩增过程的发生。此外，条带c与条带b相比，亮带更大，更亮，这证实了级联的滚环扩增相比与线性的滚环扩增能够产生更多的滚环扩增产物。
最后，荧光测量被用来监测反应进程和进一步的验证M.SssI甲基转移酶活性分析方法的可行性。如图2C，仅有D-probe，P1和P2存在时，体系具有微弱的荧光信号(曲线a)，而这个微弱的信号的产生可能来源于P1/P2的杂交体。在不含有M.SssI甲基转移酶的空白体系中，荧光信号几乎不变(曲线b)，这与目标物不存在时，D-probe被HpaII内切酶切成两部分而不能触发级联的滚环扩增过程的事实相符合。重要的是，几乎没有增强的荧光信号表明级联的滚环扩增过程能够被有效的阻止并确保一个可忽略不计的非特异性的放大。当向体系中进一步的加入M.SssI甲基转移酶时，线性的(曲线c)和级联的(曲线d)滚环扩增体系中均能观察到明显的荧光增强，表明甲基化的发生以及随后的甲基化保护的D-probe介导的线性的和级联的滚环扩增策略的进行。此外，级联的滚环扩增体系与线性的滚环扩增体系相比具有更明显的荧光信号的增强进一步的证实了级联的滚环扩增更强的放大能力。这些结果与电泳实验的结果一致，共同证实了该基于目标物保护的D-probe介导的级联的滚环扩增策略的甲基转移酶活性分析方法是可行的。
传感体系的分析性能
在最优的实验条件下，我们评估了该M.SssI甲基转移酶活性分析方法的灵敏度和动力学范围。图3A描述了不同浓度的M.sssI的荧光响应。随着M.SssI甲基转移酶的浓度从0到100U/mL逐渐增加，荧光强度也逐渐增加。在图3B(内插图)，可以观察到荧光强度与M.SssI浓度(0.01到50U/mL范围内)的对数有一个良好的线性拟合关系。线性方程为ΔF＝4389.9+1674.7lgC，线性相关系数R为0.995，其中ΔF＝F–F0，F和F0分别是目标物存在和不存在时体系的荧光强度，估算检测限为0.0024U/mL，该检出限低于大多数基于双链DNA或发夹DNA分子探针介导的滚环扩增的方法。同时，对照试验线性的滚环扩增(一轮滚环扩增)的传感性能也在该文章中进行了评估(图4)。估算的检测限为0.08U/mL,比级联的滚环扩增的体系高很多。这些结果再次验证了级联的滚环扩增的强的放大能力，从而确保了更灵敏的甲基转移酶活性的分析。此外，该方法的日内和日间精密度也分别在0.025,1.0,25U/mL三个浓度下进行了考查。在这三个浓度下，日内实验的相对标准偏差分别为4.6％,4.0％,4.6％，日间实验的相对标准偏差分别为6.3％,6.5％,6.2％。这些结果表明该甲基转移酶活性分析方法具有良好的重现性。
特异性
为了考察该方法的选择性，其他的胞嘧啶甲基转移酶，包括AluI,HaeIII和HhaI被选作干扰甲基转移酶。AluI,HaeIII和HhaI分别可以对双链回文序列中的5’-AGCT-3’,5’-GGCC-3’,5’-GCGC-3’胞嘧啶进行甲基化。如图5，只有当M.SssI甲基转移酶存在时，才能观察到明显的相对荧光强度，表明该传感方法对M.SssI甲基转移酶具有良好的选择性。这明显是由于在HpaII的识别序列5’-CCGG3’中的胞嘧啶不能被AluI,HaeIII和HhaI甲基化，而这些未甲基化的D-probe则会被HpaII内切酶裂解。
复杂生物样品的分析
为了检验该传感体系对细胞内和实际样品甲基转移酶活性分析的可能性，实验过程中细胞裂解液被加入到缓冲体系中模拟细胞内复杂体系。荧光强度和甲基转移酶浓度的对数的线性关系与在缓冲体系中的线性关系相似(图6)。此外，我们也对三个不同浓度的(0.025,1.0和25U/mL)的回收率进行了计算，分别为92％,91％和98％。这些结果表明，该传感体系在细胞内模拟体系中表现良好，有望进一步用于实际样品的分析。
抑制剂评估实验
由于DNA甲基转移酶活性的调控可能会阻止异常的DNA甲基化或杀死癌细胞，因此DNA甲基转移酶抑制剂的筛选用于活性抑制已经在疾病诊断中引起了广泛的关注。在本研究中，我们考察了该方法对M.SssI甲基转移酶抑制剂评估和筛选能力。5-氮杂胞苷和5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza和5-Aza-dC)两种抗癌药物被选作模型抑制剂。考虑到整个过程中还涉及HpaII,RsaI,T4DNA连接酶和phi29DNA聚合酶，两种药物(均为5μM)对这些酶活性的影响。结果表明，影响是可以忽略不计的。因此，我们进一步的评估了这两种药物(5μM内)对M.sssI甲基转移酶的抑制效应。图7表明，M.SssI的活性随着两种药物浓度的增加而逐渐降低，表明DNA甲基化的削弱。5-Aza和5-Aza-dCIC50值(降低50％酶活性所需的抑制剂浓度)分别为3.0和0.46μM。由此可见，两种药物的抑制效应具有明显的剂量依赖性，5-Aza-dC与5-Aza相比具有更高的抑制效率，这与先前的报道相符合。这些结果表明，该方法具有应用于甲基转移酶抑制剂筛选的潜力，从而服务于抗菌可抗癌治疗。
实施例1
材料与试剂
所有的DNA序列均由上海生物工程有限公司合成和纯化(上海，中国)。甲基化转移酶M.SssI、HaeIII、AluI、限制性内切酶HpaII、RsaI，T4DNA连接酶和DNA聚合酶均购于NewEnglandBiolabs(Ipswitch，MA)。酶反应缓冲液以及S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)也均由NewEnglandBiolabs提供。SybrGreenI购于百泰克公司(北京，中国)。甲基化转移酶抑制剂5-氮杂胞嘧啶(5-Aza)和5-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶(5-Aza-dC)购于Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。所有的试剂均为分析纯，所用水为超纯水(>18.25MΩcm-1)。
表1
仪器装置
荧光分光光度计(F-7000，日本Hitachi)；电热恒稳培养箱(DNP-9052，上海精宏实验设备有限公司)；恒温循环水槽(HX-105，北京长流科学仪器有限公司)；电子天平(ME型号，梅特勒-托利多仪器有限公司)。K30型干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司，杭州)。DYY-8C型双稳定时电泳仪电源(北京市六一仪器厂，北京)；JY-SCZ9型双垂直电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司，北京)。
封闭的哑铃分子探针的制备
封闭的哑铃分子探针是通过5’-磷酸化的哑铃形状的DNA序列在T4连接酶的作用下自我模板连接形成的。连接反应在37℃进行2h，再加入ExoI和ExoIII对残留的未环化的DNA序列切割，产生纯的封闭的哑铃分子探针，随后进行酶失活，放到-20℃备用。
哑铃分子探针的甲基化和切割
取不同浓度的M.SssI，160μMSAM与哑铃分子探针在NEBuffer2(1×)混合，反应2h后，加入甲基化敏感限制性内切酶HpaII与Cutsmart(1×)缓冲液混合，反应2.5h。进行HpaII失活，失活条件为85℃下保持20min，并使温度缓慢降下来。
级联的滚环扩增放大
上述甲基化产物首先在Cutsmart(1×)缓冲液中，在P1,dNTPs和phi29DNA聚合酶的作用下，37℃下孵育50min进行第一轮的滚环扩增。随后，在Cutsmart(1×)缓冲液中，混入P2和RsaI内切酶，37℃下孵育50min对一轮滚环扩增产物进行单化，并在65℃下20min进行酶失活。随后，在由T4DNA连接酶在37℃下孵育30min将单化的D-probe环化。最后，进一步加入dNTPs和phi29DNA聚合酶，在37℃下孵育50min进行第二轮的滚环扩增，实现级联的滚环扩增。
染料的加入以及荧光测定
上述杂交链式反应完成后，在反应体系中加入SybrGreenI，涡旋混匀后，避光反应15min。
所有的荧光强度测定都是通过日本HitachiFL-7000荧光分光光度计上进行，然后建立M.SssI活性浓度与绝对荧光强度的关系曲线。
M.SssI甲基转移酶活性分析的选择性
为了考察该M.SssI甲基转移酶活性分析的选择性，选择另外三种胞嘧啶甲基转移酶(HaeIII、HhaI和AluI甲基转移酶)作为潜在的干扰酶。选择性实验中除了使用50U/mLHaeIII、HhaI或AluI甲基转移酶代替M.SssI甲基转移酶，其余的步骤与上述描述的相同。
药物对M.SssI甲基转移酶活性的影响
为了进一步研究该方法的抑制剂筛选能力，该工作中使用两种典型的抗癌药物，5-氮杂胞苷和5-氮杂-2′-脱氧胞苷，评估了其对M.SssI甲基转移酶活性的抑制作用。甲基化实验在10μL1×NEBuffer2中进行，包含160μMSAM、600nMdsDNA、10U/mLM.SssI甲基转移酶和不同浓度的抑制剂，37℃孵育2h。剩余的步骤和上述描述的相同。M.SssI甲基转移酶的相对活性使用下面的公式进行估算：
R A = F i - F 0 F t - F 0
F0,Ft和Fi分别是甲基转移酶不存在时，100U/mL甲基转移酶存在时，甲基转移酶及抑制剂都存在时体系所对应的的荧光强度。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (10)

1.一种用于检测DNA甲基转移酶活性或抑制剂药物的筛选的哑铃分子探针，其特征在于，该探针颈部含有能被甲基转移酶和对甲基化敏感的限制性内切酶识别的5’-CCGG-3’序列，该探针环部含有能够介导级联的滚环扩增的DNA触发的5-CCGG-3’的四核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述探针序列为SEQIDNO:1所示：
SEQIDNO:1：
p-CCGGTTCCTCTCTTAGTGCAGAGTACGGAGATAGGGAGAAAGGAGAGGAACCGGGTGTGTGTAAAGAAAGAAAGAAAGACACACAC。
3.权利要求1或2所述的探针在检测甲基转移酶活性或抑制剂药物的筛选中的应用。
4.一种检测甲基转移酶活性的方法，其特征在于，根据权利要求1或2所述的探针，根据该探针发生甲基化与否，以及能否进而被对甲基化敏感的限制性内切酶剪切从而发生随后的级联的滚环复制和荧光染色来判断甲基转移酶的活性。
5.权利要求4所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)设计权利要求1或2所述的探针；
2)将甲基化转移酶、限制性内切酶同时作用于该探针；
3)将得到的产物进行级联滚环扩增；
4)向级联滚环扩增产物中加入相应的荧光染料，检测信号强度，根据信号强度和甲基转移酶活性的对应关系判定待测甲基转移酶的活性。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的具体作用过程为：
若甲基转移酶不存在时，所述探针的5’-CCGG-3’的序列能够被对甲基化敏感的限制性内切酶识别，并在胞嘧啶之间切割为两部分；随后的级联的滚环扩增过程被阻止；若甲基转移酶存在时，该探针的5’-CCGG-3’的序列中的胞嘧啶被甲基化，形成5’-CCmGG-3’的序列对甲基化敏感的限制性内切酶的切割被阻止，随后进行级联的滚环扩增。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述级联滚环扩增的具体步骤为：将步骤2)得到的甲基化保护的完整的D-probe与引物1——P1杂交，并在phi29DNA聚合酶的作用下进行线性的滚环扩增，形成长的重复的D-probe的复制体；然后，引物2——P2被加入沿着RCA的产物形成多重的双链片段，形成的双链片段被RsaI识别并切割，使得长的RCA产物转化为多个新的D-probe单体；随后，对RsaI进行热失活，使得碎片P2从新的D-probe单体上解离下来，完整的P2与新的D-probe单体杂交；再然后，新形成的多个环状的D-probe单体和P2触发新一轮的滚环扩增，产生更多的D-probe复制体；
其中，所述的RsaI能够识别和切割双链回文序列5’-GT↓AC-3’，↓代表切割位点。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引物1序列为SEQIDNO:2所示，
SEQIDNO:2：
CTCCCTATCTCCGTACTCTGCA。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述引物2序列为SEQIDNO:3所示：
SEQIDNO:3：
TGCAGAGTACGGAGATAGGGAG。
10.一种用于检测DNA甲基转移酶活性或抑制剂药物的筛选的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的探针。
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