CN116479116A - 可排除smn2干扰的smn1基因检测的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可排除SMN2干扰的SMA基因检测的试剂盒及检测方法，将SMN1和SMN2两个差异碱基分别设计在FIP和BIP引物的3’端，并在FIP和BIP引物的3’端倒数第二碱基处设计辅助突变碱基，增强了LAMP扩增的特异性。通过BIP‑W排除了SMN2对扩增的影响，FIP‑W和FIP‑M区分SMN1是否发生突变，从而准确判断待测样品的SMN1基因的基因型。本发明的检测方法采用环介导等温扩增技术，具有极高的灵敏度，因此，仅需患者少量口腔拭子经过煮沸释放DNA即可作为模板进行扩增，不需采集血液标本。
Description
本申请是名为《可排除SMN2干扰的SMN1基因检测引物组、试剂盒及检测方法》的专利申请的分案申请，原申请的申请日为2020年01月19日，申请号为202010058927.6。
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，特别是涉及一种可排除SMN2干扰的SMN1基因检测的试剂盒及检测方法。
背景技术
脊髓型肌萎缩症(Spinal muscular atrophy,SMA)是一类相对常见的常染色体隐性遗传病，以脊髓前角运动神经元退化变性和丢失导致的肌无力和肌萎缩为主要临床特征。SMA发病率为1/10000～1/6000，携带率为1/50～1/40。SMA的发病原因主要是由于位于5q13.2上的运动神经元存活基因1(survival motor neuron gene 1，SMN1)上的7号外显子第6个碱基由C突变为T，导致SMN蛋白功能缺陷所致的遗传性神经肌肉病。SMN是一个广泛表达的管家蛋白，可作为亚单位与Sm蛋白结合，以SMN复合体形式募集Sm核蛋白和小核核糖核酸(snRNAs)组装成核糖核蛋白复合物(snRNPs)。此外，SMN2作为脊髓性肌萎缩症(SMA)的修饰基因，存在于每个人的体内，且SMN2与SMN1的基因序列仅有个别碱基的差异(如图2)，因此，在检测过程中SMN2对基因筛查存在较大的干扰作用，往往很难区分SMN1基因突变携带者和纯合正常人。虽然，目前已经研制出了针对SMA的有效药物，但仍需要早发现早治疗，尤其是针对婴儿期的SMA患者治疗效果更佳，而且治疗费用极高。因此，对SMN1基因型进行婚前筛查，降低新生儿患SMA风向至关重要。
目前，针对SMA的基因检测技术主要是基于聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR(RT-PCR)、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)、单链构象多态性(PCR-SSCP)、多重连接探针扩增技术(MLPA)、荧光原位杂交技术(FISH)等，然后结合核酸测序技术进行序列分析。但是，上述技术均是基于PCR技术的体外扩增，但是由于受PCR技术的灵敏度限制，检测结果有一定失败的可能性。另一方面由于PCR技术由于DNAPolymerase扩增过程中有一定几率出现扩增变异，因此，也存在一定的假阳性率。且上述技术的检测时间长、费用高，在基层医疗单位推广普及的难度较高。
环介导等温扩增技术(LAMP)由于其对检测设备的要求较低，操作简便，以及高灵敏度，目前已经广泛应用于病原微生物的检测中。近年来也研究报道利用LAMP法检测基因突变，如专利文献CN 105861690A利用肽核酸(PNA)制备的探针与DNA或RNA能够形成稳定的复合体，而单碱基突变能够引起该复合体较大Tm值变化的原理，与LAMP技术结合。但目前肽核酸合成技术仍不成熟，合成的PNA纯度一般仅能达到90％-95％，同时，肽核酸合成成本较高，合成50nmol的费用高达5000-6000元左右，检测费用高，推广难度大。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
可排除SMN2干扰的SMN1基因检测的试剂盒，该试剂盒包括引物组、BstDNAPolymerase、dNTP、缓冲液、指示剂和添加剂；
所述引物组包括以下7条引物；
F3：5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTAT-3’；
B3：5’-GTTTTGGCATCAAAATTCTTTAAT-3’；
FIP-W:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAACTTTATTTTCCTTACAGGGT TVC-3’；
FIP-M:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAACTTTATTTTCCTTACAGGGT TVT-3’；
BIP-W:5’-TGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAAGTTTTACATTAACCT TTCAACTTVT-3’；
LF：5’-GTGAGCACCTTCCTTCTTTTT-3’；
LB：5’-GTGGAAAACAAATGTTTTTGAAC-3’；
所述的缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20；
所述的指示剂为SYBR Green I溶液或Calcein溶液和MnCl2溶液的混合液；
所述的添加剂包括海藻糖和BSA。
所述引物F3、B3浓度相同，为0.8～1.6μmol/L，LF、LB浓度相同，为1.6～3.2μmol/L，FIP-W、FIP-M、BIP-W浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；所述的Bst DNAPolymerase0.3～0.4U/μl；所述的dNTP为1.0～3.5mmol/L；所述的缓冲液中Tris-HCl为10～50mmol/L、KCl为10～100mmol/L、(NH4)2SO4为5～20mmol/L、MgSO4为6～10mmol/L、Tween-20质量占缓冲液质量为0.1％～0.5％；所述的SYBR Green I浓度为1×～5×；所述的Calcein和MnCl2的混合液中，Calcein溶液浓度为10-30μmol/L，MnCl2溶液的为500μmol/L；所述的添加剂中海藻糖为0.1～0.3mol/L，BSA为0.2～1mg/ml；FIP-W特异性扩增SMN1-W，FIP-M特异性扩增SMN1-M。
可排除SMN2干扰的SMN1基因的检测方法，包括以下步骤：
将口腔拭子放入200μlTE缓冲液中涡旋震荡1min，100℃加热5min，得到待测试模板；
分别将SMN1-W和SMN1-M基因连接到pUC57载体上，并稀释至1ng/μl，作为阳性对照；以无菌超纯水作为阴性对照；
利用LAMP技术，分别取待测试模板、阳性对照和阴性对照加入到权利要求1所述的试剂盒体系中，整个反应体系于65℃45sec，65℃15sec的条件下反应60个循环；然后85℃反应5min，根据反应曲线判断SMN1基因的基因型。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明利用LAMP技术将待测碱基位于引物3’端，同时人为的突变待测碱基相邻位置的碱基，从而使DNA聚合酶在扩增过程中能够准确识别位于引物3’端的待测碱基，显著提高了Bst DNAPolymerase对引物3’端的识别能力，避免了探针的设计和使用，降低了检测费用，提高了检测试剂保存的稳定性；
(2)本发明的检测方法采用环介导等温扩增技术，具有极高的灵敏度，因此，仅需患者少量口腔拭子经过煮沸释放DNA即可作为模板进行扩增，不需采集血液标本；
(3)本发明无需进行DNA提取操作，口腔拭子经过煮沸即可作为模板，结合冷冻干燥技术，整个检测过程只需加入少量的口腔拭子粗提液和反应缓冲液即可，极大的简化了操作步骤；
(4)本发明通过对SMN1和SMN2两个不同位点同时进行检测实现了快速鉴别SMN1基因纯合突变、纯合正常、杂合突变，能够有效避免SMN2基因对检测结果的干扰。并且对检测设备没有特殊要求，仅需一台水浴锅或其他能够提供恒温条件的设备和一台蓝光灯即可。该技术在实现精准检测的同时，也实现了即时检测，并降低了检测费用和推广难度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明试剂盒检测点突变示意图，A：FIP-W扩增野生型SMN1；B：FIP-M不能扩增野生型SMN1；C：FIP-W不能扩增突变型SMN1；D：FIP-M可以扩增突变型SMN1；E：BIP-W扩增SMN1；F：BIP-W不扩增SMN2。
图2是SMN1和SMN2基因序列差异部分。
图3是实施例4的检测结果图，A：FIP-W扩增SMN1-W；B：FIP-M扩增SMN1-M；C：FIP-W扩增待测样品1为纯合正常；D：FIP-M扩增待测样品2为纯合突变。
图4是对比例1的检测结果图，A：FIP-W扩增SMN1-W；B：FIP-M扩增SMN1-M；C：FIP-W扩增待测样品1为纯合正常；D：FIP-M扩增待测样品2为纯合突变。
图5是对比例2的检测结果图，A：FIP-W扩增SMN1-W；B：FIP-M扩增SMN1-M；C：FIP-W扩增待测样品1为纯合正常；D：FIP-M扩增待测样品2为纯合突变。
图6是对比例3的检测结果图，A：FIP-W扩增SMN1-W；a：FIP-W扩增SMN1-M；B：FIP-M扩增SMN1-M；b：FIP-M扩增SMN1-W；C：FIP-W扩增待测样品1；c：FIP-M扩增待测样品1；D：FIP-W扩增待测样品2；d：FIP-M扩增待测样品2。
图7是对比例4的检测结果图，A：FIP-W扩增SMN1-W；a：FIP-W扩增SMN1-M；B：FIP-M扩增SMN1-M；b：FIP-M扩增SMN1-W；C：FIP-W扩增待测样品1；c：FIP-M扩增待测样品1；D：FIPW扩增待测样品2；d：FIP-M扩增待测样品2。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本文中提及“实施例”意味着，结合实施例描述的特定特征、结构或特性可以包含在本申请的至少一个实施例中。在说明书中的各个位置出现该短语并不一定均是指相同的实施例，也不是与其它实施例互斥的独立的或备选的实施例。本领域技术人员显式地和隐式地理解的是，本文所描述的实施例可以与其它实施例相结合。
本发明中用于检测未反生突变的扩增引物称为野生型引物，用W表示，如FIP-W表示检测疑似SMA患者SMN1野生型基因引物。用于检测发生突变的扩增引物称为突变型引物，用M表示。辅助突变碱基在野生型引物和突变型引物中均存在，且为同一碱基，可以是除本身碱基以外的其他三种碱基，如本身为A，则可以是T、C或G。
本发明的引物组中的7条引物：
F3：5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTAT-3’；
B3：5’-GTTTTGGCATCAAAATTCTTTAAT-3’；
FIP-W:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAACTTTATTTTCCTTACAGGG TTVC-3’；
FIP-M:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAACTTTATTTTCCTTACAGGG TTVT-3’；
BIP-W:5’-TGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAAGTTTTACATTAACC TTTCAACTTVT-3’；
LF：5’-GTGAGCACCTTCCTTCTTTTT-3’；
LB：5’-GTGGAAAACAAATGTTTTTGAAC-3’。
其中，V为辅助突变碱基，为A、C、G中的任意一个碱基，FIP-W配合F3、B3、BIP-W、LF和LB作为检测野生型SMN1-W基因的引物组，FIP-M配合F3、B3、BIP-W、LF和LB作为检测突变型SMN1-M基因的引物组。
图1所示为本发明的检测方法的检测点突变示意图。本发明将SMN1和SMN2两个差异碱基分别设计在FIP和BIP引物的3’端，并在FIP和BIP引物的3’端倒数第二碱基处设计辅助突变碱基，增强了LAMP扩增的特异性。通过BIP-W排除了SMN2对扩增的影响，FIP-W和FIPM区分SMN1是否发生突变，从而准确判断待测样品的SMN1基因的基因型。
以下给出本发明的具体实施例，需要说明的是本发明并不局限于以下具体实施例中，凡在本申请技术方案基础上做的等同变换均落入本发明的保护范围。
实施例1
本实施例公开的试剂盒包括：Bst DNA Polymerase、dNTP、引物组、缓冲液、指示剂和添加剂；其中，Bst DNA Polymerase为0.32U/μl，dNTP为1.4mmol/L，缓冲液由20mmol/LTris-HCl、10mmol/L(NH4)2SO4、50mmol/LKCl、质量份数为0.1％的Tween-20、8mmol/LMgSO4组成，指示剂为2×SYBR Green I，添加剂由0.1mol/L海藻糖和0.5mg/ml BSA组成。引物组包括以下7条引物：
F3：5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTAT-3’；
B3：5’-GTTTTGGCATCAAAATTCTTTAAT-3’；
FIP-W:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAACTTTATTTTCCTTACAGGG TTVC-3’；
FIP-M:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAACTTTATTTTCCTTACAGGG TTVT-3’；
BIP-W:5’-TGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAAGTTTTACATTAACC TTTCAACTTVT-3’；
LF：5’-GTGAGCACCTTCCTTCTTTTT-3’；
LB：5’-GTGGAAAACAAATGTTTTTGAAC-3’。
本实施例的引物组中，F3、B3的浓度相同，均为0.4μmol/L；LF、LB的浓度相同，为0.8μmol/L；FIP-W、FIP-M、BIP-W的浓度相同，为1.6μmol/L。
使用本实施例的试剂盒检测SMN1基因，具体包括：
制备DNA模板：采集两个人的口腔拭子，将两个口腔试子分别放入TE缓冲液(10mMTris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)中涡旋震荡1min，100℃加热5min，取5μl作为待测试模板，得到待测样品1和待测样品2。
分别将SMN1-W和SMN1-M连接到pUC57载体上，并稀释至1ng/μl，作为阳性对照；以无菌超纯水作为阴性对照。
利用LAMP技术，分别取5μl待测样品1、5μl待测样品2、5μl阳性对照和5μl阴性对照加入到试剂盒形成的体系中，整个反应体系于65℃45sec，65℃15sec(采集荧光)条件下共反应60个循环；然后85℃反应5min，荧光通道选择SYBR Green I。反应曲线判断SMN1基因的基因型。
本实施例的检测结果如图3所示，从图3可以看出，FIP-W能够特异性扩增SMN1-W，而FIP-M则特异性扩增SMN1-M，待测样品1(曲线C)结果显示其基因型纯合正常，待测样品2(曲线D)结果显示其基因型纯合突变。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于：试剂盒中的添加剂为0.1mol/L海藻糖。本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图4所示。可以看出，单独使用0.1mol/L海藻糖作为添加剂的时候，虽然也能够完成特异性的检测工作，但是扩增效率较实施例1有明显下降。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于：试剂盒中的添加剂为0.5mg/ml BSA。本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图5所示。单独使用0.5mg/ml BSA作为添加剂的时候，虽然也能够完成特异性的检测工作，但是扩增效率较实施例1有明显下降。
综合实施例1、对比例1与对比例2的检测结果可以看出，在单独使用海藻糖和BSA的时候对反应均轻微的抑制作用。但是，当海藻糖和BSA联合使用的时候未表现出抑制作用。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的试剂盒中，引物FIP和BIP无辅助突变碱基，其余引物与实施例1相同，即：
FIP-W:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAA-CTTTATTTTCCTTACAGG GTTTC-3’；
FIP-M:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAA-CTTTATTTTCCTTACAGG GTTTT-3’；
BIP-W:5’-TGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAA-GTTTTACATTAACC TTTCAACTTTT-3’。
本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图6所示。可以看出，没有辅助突变碱基的引物完全不能区分野生型和突变型，根据该组引物的检测结果判断待测样品的基因型则为携带者；当辅助突变碱基与待测位点相邻时，野生型引物仅扩增野生型模板，突变型引物仅扩增突变型模板，可以显著区分野生型和突变型。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于：本对比例的试剂盒中，引物FIP和BIP中辅助突变碱基的位置为：
FIP-W:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAA-CTTTATTTTCCTTACAGG GTVTC-3’；
FIP-M:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAA-CTTTATTTTCCTTACAGG GTVTT-3’；
BIP-W:5’-TGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAAGTTTTACATTAACC TTTCAACTVTT-3’。
本对比例的检测方法与实施例1相同，其结果如图7所示。可以看出，当辅助突变碱基与待测位点相隔1～2个碱基的时候，野生型引物对突变型模板的扩增效率有明显降低，但体现在时间间隔上仅有5～10min，不利于区分两种基因型。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (2)
1.可排除SMN2干扰的SMN1基因检测的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括引物组、BstDNAPolymerase、dNTP、缓冲液、指示剂和添加剂；
所述引物组包括以下7条引物；
F3：5’-GCTATCTATGTCTATATAGCTAT-3’；
B3：5’-GTTTTGGCATCAAAATTCTTTAAT-3’；
FIP-W:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAACTTTATTTTCCTTACAGGGT TVC-3’；
FIP-M:5’-TGCTGGCAGACTTACTCCTTAACTTTATTTTCCTTACAGGGT TVT-3’；
BIP-W:5’-TGAAAGTGAATCTTACTTTTGTAAAAGTTTTACATTAACCT TTCAACTTVT-3’；
LF：5’-GTGAGCACCTTCCTTCTTTTT-3’；
LB：5’-GTGGAAAACAAATGTTTTTGAAC-3’；
所述的缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4和Tween-20；
所述的指示剂为SYBRGreenI溶液或Calcein溶液和MnCl2溶液的混合液；
所述的添加剂包括海藻糖和BSA。
所述引物F3、B3浓度相同，为0.8～1.6μmol/L，LF、LB浓度相同，为1.6～3.2μmol/L，FIP-W、FIP-M、BIP-W浓度相同，为1.6～3.2μmol/L；所述的BstDNAPolymerase0.3～0.4U/μl；所述的dNTP为1.0～3.5mmol/L；所述的缓冲液中Tris-HCl为10～50mmol/L、KCl为10～100mmol/L、(NH4)2SO4为5～20mmol/L、MgSO4为6～10mmol/L、Tween-20质量占缓冲液质量为0.1％～0.5％；所述的SYBRGreenI浓度为1×～5×；所述的Calcein和MnCl2的混合液中，Calcein溶液浓度为10-30μmol/L，MnCl2溶液的为500μmol/L；所述的添加剂中海藻糖为0.1～0.3mol/L，BSA为0.2～1mg/ml；FIP-W特异性扩增SMN1-W，FIP-M特异性扩增SMN1-M。
2.可排除SMN2干扰的SMN1基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将口腔拭子放入200μlTE缓冲液中涡旋震荡1min，100℃加热5min，得到待测试模板；
分别将SMN1-W和SMN1-M基因连接到pUC57载体上，并稀释至1ng/μl，作为阳性对照；以无菌超纯水作为阴性对照；
利用LAMP技术，分别取待测试模板、阳性对照和阴性对照加入到权利要求1所述的试剂盒体系中，整个反应体系于65℃45sec，65℃15sec的条件下反应60个循环；然后85℃反应5min，根据反应曲线判断SMN1基因的基因型。
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