CN103898213A

CN103898213A - 一种检测α2珠蛋白基因点突变的巢式非对称PCR试剂盒

Info

Publication number: CN103898213A
Application number: CN201410098630.7A
Authority: CN
Inventors: 周万军; 熊符; 徐湘民
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2014-03-14
Filing date: 2014-03-14
Publication date: 2014-07-02
Anticipated expiration: 2034-03-14
Also published as: CN103898213B

Abstract

本发明公开了一种检测α2珠蛋白基因点突变的试剂盒，该试剂盒由巢式非对称PCR扩增引物、荧光探针、淬灭探针、LADNA聚合酶等组成。通过巢式非对称PCR特异性扩增人类α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变目的序列、特异性荧光探针的分子杂交及解链分析，检测受检样本的α-地贫点突变基因型。该试剂盒对检测α-地中海贫血WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变位点的野生型和突变型具有良好的敏感性和准确性，重复性和稳定性很好，完全适用于α-地中海贫血点突变的临床检测。

Description

一种检测α2珠蛋白基因点突变的巢式非对称PCR试剂盒

技术领域

本发明属于分子检测领域，具体涉及一种巢式非对称PCR解链荧光分析检测α2珠蛋白基因点突变试剂盒。

背景技术

人类α-珠蛋白基因簇位于16号染色体上，表达α珠蛋白链，与β珠蛋白链结合，形成具有功能血红蛋白四聚体。正常情况下，人类珠蛋白基因所表达的α类和β类珠蛋白链比例适当（1:1），当α珠蛋白基因缺陷，导致α链合成减少而β链相对过剩，即可导致α-地中海贫血疾病。地中海贫血（简称“地贫”）是全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病之一，主要集中在地中海沿岸国家、东南亚、少数非洲地区和我国南方，保守估计全世界携带者近2亿人。临床上常见α-地贫和β-地贫。但α-地贫的人群携带率远高于β-地贫。此病无有效治疗手段，应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。导致α链合成减少的根本原因是α珠蛋白基因突变，包含大片段缺失和点突变两种类型，其中由α珠蛋白基因点突变而导致的α-地贫又称为α-地贫基因点突变或非缺失型α-地贫。

正常人每条16号染色体上有两个高度同源的α珠蛋白基因，即α2和α1，正常情况下，α2较α1功能更强，α2约占基因表达量的2/3，α1约占基因表达量的1/3。目前的研究及分子流行病学调查结果显示，α-地贫基因点突变主要发生在功能较强的α2珠蛋白基因上，如中国人群中常见的WS、QS、CS，以及次常见的CD30、CD31等突变类型。

当前α-地贫基因点突变的分子诊断和产前诊断策略，是采用相应的技术方法，分析α珠蛋白基因是否存在点突变。检测技术的发展历程中，扩增阻碍突变系统PCR（ARMS-PCR），是分别针对每一个突变位点，采用两个PCR反应管逐一检测，操作繁琐、费时费力，并且这种技术的检测条件难以控制，易于出现假阴性和假阳性结果。随后采用的等位基因特异性寡核苷酸杂交法（ASO），大大减少了假阴性和假阳性结果，但仍需逐一检测每一个突变位点，检测通量低，费时费力。当前在临床上常规使用的反向点杂交法（RDB），可同时检测WS、QS和CS三种突变类型，在一定程度上减小了劳动强度，增加了检测通量，可是，此技术的操作流程依然繁琐，先PCR扩增α2珠蛋白基因，然后再通过变性、杂交、洗膜、显色等一系列操作再观察检测结果，同时，PCR产物的开盖操作也大大增加了实验室携带污染的风险。DNA测序分析也是当前可选的一种α珠蛋白基因点突变检测方案，此技术操作过程是先PCR扩增，再PCR产物纯化、测序PCR反应、测序仪上毛细管电泳分析等，同样存在操作繁琐、携带污染等问题。总的来说，目前使用α2珠蛋白基因点突变检测方法，检测成本高、工作量大、操作繁琐、检测通量小，难以实现自动化和标准化，且存在PCR产物携带污染等技术局限，不能满足当前α-地贫的大规模人群筛查和临床常规分子诊断需要。

随着目前以降低地贫患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施，以及地贫分子机制及分子流行病学的深入研究，准确可靠、简单实用、能实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的高通量检测技术与方法，是这些项目实施的技术支撑条件，更是当前地中海贫血分子诊断的迫切需要。针对上述α2珠蛋白基因点突变检测分析的技术局限，研发相应的技术方法，一次性闭管操作以防止PCR产物携带污染，单反应管检测多种突变类型以提高检测通量且简化操作强度，仪器自动检测分析以实现自动和标准化，是目前方法学研究的主要方向。

发明内容

为了解决现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种可以一次性闭管检测α2珠蛋白基因中WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变类型的检测试剂盒。

本发明所采取的技术方案是：

用于检测α2珠蛋白基因点突变的巢式非对称荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括：

（1）用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物对；

（2）用于扩增CD30/CD31目的片段DNA单链的引物；

（3）用于扩增WS/QS/CS目的片段DNA单链的引物；

（4）特异性检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变序列的野生型及突变型的荧光探针，以及相对应的淬灭探针，通过在荧光探针上修饰不同的荧光信号和/或不同的解链温度来区分WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变序列的野生型及突变型。

所述用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物对的Tm值比其他引物或荧光探针、淬灭探针的Tm值高5-10℃。

作为优选的，所述用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物对的Tm值≥72℃。

作为优选的，用于扩增目的片段DNA单链的引物的Tm值≤63℃。

作为优选的，特异性检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变序列的荧光探针以及相对应的淬灭探针的Tm值≤63℃。

作为优选的，所述用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物Tm值为72℃-74℃，其中：正向引物位于α2珠蛋白基因第1外显子5’端UTR区域；反向引物位于α2珠蛋白基因第3外显子3’端UTR区域，该区域须避开与α1珠蛋白基因的同源序列，从而保证扩增α2珠蛋白基因的特异性与准确性。

所述用于扩增CD30/CD31目的片段DNA单链的引物，是位于CD30/CD31突变3’端100－130bp位置的反向扩增引物，Tm值62℃-64℃，以保证此对引物能特异性扩增包含CD30/CD31突变及侧翼序列的负义链单链DNA。

所述用于扩增WS/QS/CS目的片段DNA单链的引物，是位于CS突变3’端10－35bp，距权利5所列特异性α2珠蛋白全序列3’末端2－5bp的反向扩增引物，Tm值62℃-64℃，以保证此对引物能特异性扩增包含WS/QS/CS突变及侧翼序列的负义链单链DNA。

所述用于特异性检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五个突变位点的荧光探针以及相对应的淬灭探针的序列分别如下：

（1）特异性检测CD30/CD31位点野生型及CD31(AGG→AAG)突变类型的荧光探针，为包含CD30位点及5’侧翼4-7bp、CD31位点及3’侧翼10-13bp范围的野生型DNA序列，正义链，Tm值60℃-62℃，5’端标记Cy5荧光基团；

相对应的淬灭探针为位于荧光探针5’上游、其3’端距荧光探针5’端3－8bp的野生型DNA序列，正义链，Tm值62℃-65℃，3’端标记荧光淬灭基团；

（2）特异性检测CD30（delGAG）突变类型的荧光探针，为包含CD30位点、5’侧翼6-9bp及3’侧翼11-14bp的突变型DNA序列，正义链，Tm值58℃-60℃，3’端标记HEX荧光基团；

相对应的淬灭探针为位于荧光探针3’下游、其5’端距荧光探3’端3－8bp的野生型DNA序列，正义链，Tm值62℃-65℃，5’端标记荧光淬灭基团；

（3）特异性检测WS/QS位点野生型的荧光探针，为包含WS位点及5’侧翼2-5bp、QS位点及3’侧翼4-6bp范围的野生型DNA序列，正义链，Tm值58℃-60℃，3’端标记FAM荧光基团；

（4）特异性检测CS位点野生型的荧光探针，为包含CS位点、5’侧翼8-12bp及3’侧翼10-14bp范围的野生型DNA序列，正义链，Tm值58℃-60℃，5’端标记ROX荧光基团；

（5）特异性检测WS（CD122，C>G）突变类型的荧光探针，为包含WS位点、5’侧翼4-8bp及3’侧翼4-8bp范围的突变型DNA序列，正义链，Tm值52℃-55℃，3’端标记HEX荧光基团；

（6）特异性检测QS（CD125，T>C）突变类型的荧光探针，为包含QS位点、5’侧翼4-7bp及3’侧翼8-12bp范围的突变型DNA序列，正义链，Tm值53℃-56℃，3’端标记FAM荧光基团；

（7）特异性检测CS（CD142，T>C）突变类型的荧光探针，为包含CS位点、5’侧翼6-10bp及3’侧翼8-12bp范围的突变型DNA序列，正义链，Tm值53℃-56℃，5’端标记ROX荧光基团；

上述（3）、（4）、（5）、（6）和（7）所述的荧光探针相对应的淬灭探针为位于此荧光探针3’端下游、其5’端距此荧光探3’端5-15bp、其3’端距CS位点野生及突变型荧光探针5’端5-15bp的野生型DNA序列，正义链，Tm值62℃-65℃，5’端和3’端均标记荧光淬灭基团；

以上所有荧光探针及淬灭探针，在未标记相应荧光及淬灭基团的一端，均添加2-5bp与目的序列不匹配的碱基，以保护未标记端的完整性。

进一步作为优选的：

所述用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物对如下所示：

F：5’-gctcgcgggccggcact-3’（SEQIDNO.1），

R：5’-ctccattgttggcacattccgggatag-3’（SEQIDNO.2）。

所述用于扩增CD30/CD31目的片段DNA单链的引物序列为：5’-ctgcggggagaagcagagt-3’（SEQIDNO.3）；

所述用于扩增WS/QS/CS目的片段DNA单链的引物序列为：5’-gggcaggaggaacggctac-3’（SEQIDNO.4）。

（1）特异性检测CD30/CD31位点野生型及CD31（AGG→AAG）突变类型的荧光探针为：

5’-ccctggagaggtgaggctaaa-3’（SEQIDNO.5），

相对应的淬灭探针为：5’-aatggcgagtatggtgcgg-BHQ2-3’（SEQIDNO.6）；

（2）特异性检测CD30（delGAG）突变类型的荧光探针为：

5’-aaccctgaggtgaggctcc-HEX-3’（SEQNO.7）；

相对应的淬灭探针为：5’-BHQ1-cctgctccgacccggaaa-3’（SEQNO.8）；

（3）特异性检测WS/QS位点野生型的荧光探针为：

5’-aagcacgcctccctggac-FAM-3’（SEQNO.9）；

（4）特异性检测CS位点野生型的荧光探针为：

5’-ROX-caaataccgttaagctggagaaa-3’（SEQNO.10）；

（5）特异性检测WS（CD122，C>G）突变类型的荧光探针为：

5’-aaggtgcaggcctcc-HEX-3’（SEQNO.11）；

（6）特异性检测QS（CD125，T>C）突变类型的荧光探针为：

5’-actccccggacaagttc-FAM-3’（SEQNO.12）；

（7）特异性检测CS（CD142，T>C）突变类型的荧光探针为：

5’-ROX-aataccgtcaagctggtaa-3’（SEQNO.13）；

上述（3）、（4）、（5）、（6）和（7）所述的荧光探针相对应的淬灭探针为：

5’-BHQ1-cttctgtgagcaccgtgctg-BHQ2-3’（SEQNO.14）。

本发明技术原理与说明：

正常情况下，人类机体内所表达的α和β珠蛋白链的比例适当（1:1），形成具有生物功能的血红蛋白四聚体。当α珠蛋白功能基因缺失，导致α合成减少而β链相对过剩则为α-地贫。就一套人类正常基因组而言（即一个细胞的核基因组），α1和α2珠蛋白基因各有两个拷贝，α1和（或）α2珠蛋白基因缺失和（或）点突变是导致地贫的分子机制，因此检测α2珠蛋白基因上是否存在点突变，即是地贫分子诊断的主要途径之一。

由于α1和α2珠蛋白基因高度同源，其编码序列完全相同，以基因组DNA为模板的WS、QS、CS、CD30、CD31突变基因型检测，就必须消除α1珠蛋白基因同源序列的干扰。例如：某受检样为CS突变纯合子，那么样本中只包含α2珠蛋白基因CS(CD142,T>C)突变的目的序列，在采用ASO、RDB或荧光标记探针杂交等方法进行检测时，就只有突变探针与目的序列进行杂交的信号；然而，如果检测体系中有足够量的α1珠蛋白基因序列时，就会有突变位点野生型探针与α1珠蛋白基因序列进行杂交的信号而误判为突变杂合子基因型。据此，本研究发明了巢式非对称荧光PCR体系，准确检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31突变基因型。

本研究发明的检测体系中，包含的特异性扩增α2珠蛋白基因全序列的引物，其Tm值较高（≥72℃），且加入量相对较少（1.0pmol/test）。在检测反应的起始阶段，以72℃的退火温度，经30个循环，特异性扩增α2珠蛋白基因序列。而其它引物及探针，由于它们的Tm值（≤63℃）远低于α2珠蛋白基因全序列扩增引物，在72℃条件下不会与模板杂交。经过第一轮的α2珠蛋白基因全序列特异性扩增，此时反应体系中虽然有α1珠蛋白基因序列的存在，但其拷贝数只有α2珠蛋白基因序列的几十至几百万分之一，其拷贝数量远远不足以对后续的检测分析造成影响。并且，特异性扩增α2珠蛋白基因序列的引物较少，经过此轮扩增已基本消耗殆尽或剩余很少而不影响后续检测。

随后，以稍低的退火温度（63℃）、高引物浓度（15.0pmol/test），以第一轮PCR扩增的α2珠蛋白基因全序列为模板，分别巢式扩增WS/QS/CS和CD30/CD31突变位点目的片段单链DNA，为后续的荧光检测探针提供足够量的单链模板。在此轮巢式扩增的退火温度下，由于其它探针的Tm值均低于63℃而不会与模板杂交而影响此轮扩增反应。

最后，通过95℃的变性，40℃的复性，让各野生型、突变型荧光探针及淬灭探针与相应的互补模板进行分子杂交；再通过程序性升温及荧光信号检测分析，获得各荧光通道的解链分析数据，以判断受检样本的点突变基因型。如图1所示，淬灭探针位于突变位点附近的保守序列，复性时即与对应的模板序列进行杂交，当突变位点的荧光探针与相对应的模板杂交时，此探针的荧光基团与淬灭基团距离靠近而无荧光。随着温度的逐渐上升，各荧光探针在相应的温度时发生解链，荧光探针游离于模板、远离淬灭基团而发出荧光，仪器可检测到某一温度、某一荧光通道荧光值的变化。如CS突变杂合子样本，经巢式非对称PCR扩增、变性复性后，CD30/CD31位点野生型、WS/QS位点野生型、CS位点野生型、CS（CD142，T>C）突变型等荧光探针会与相对应的DNA序列杂交，随着温度的逐步上升，于54.0±1.0℃时ROX通道有荧光信号的明显增加，59.0±1.0℃时FAM和ROX通道有荧光信号的明显增加，61.0±1.0℃时Cy5通道有荧光信号的明显增加。

本发明的有益效果是：

（1）本发明设计的引物探针具有很好的特异性和重复性；

（2）本发明所述的方法对人类α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31点突变检测具有良好的灵敏度、稳定性与准确性；

（3）本发明所述的方法，只需将受检样本基因组DNA加入到检测试剂中，一次性闭管操作，无中间环节，操作简单且可消除PCR产物对实验环境的污染；

（4）本发明是以当前的常规荧光定量PCR仪为仪器平台，可实现自动化和规模化检测。

附图说明

图1是本发明WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变的位置及相应探针位置图；

图2是解链分析代表性峰图；

图3是α-地贫基因型为αα/αα的点突变解链分析峰图；

图4是α-地贫基因型为αCSα/αα的点突变解链分析峰图；

图5是α-地贫基因型为αWSα/αα的点突变解链分析峰图；

图6是α-地贫基因型为αCSα/αCSα的点突变解链分析峰图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1

用于检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31点突变的巢式非对称PCR试剂盒

1、试剂盒组成

（1）一对特异性扩增α2珠蛋白基因全序列引物

F：5’-gctcgcgggccggcact-3’（SEQNO.1），

R：5’-ctccattgttggcacattccgggatag-3’（SEQNO.2）；

（2）两条扩增α2珠蛋白基因序列DNA单链引物

扩增CD30/CD31目的片段单链引物序列为：5’-ctgcggggagaagcagagt-3’（SEQNO.3），

扩增WS/QS/CS目的片段单链引物序列为：5’-gggcaggaggaacggctac-3’（SEQNO.4）；

（3）探针

特异性检测CD30/CD31位点野生型及CD31（AGG>AAG）突变类型的荧光探针：

5’-Cy5-ccctggagaggtgaggctaaa-3’（SEQNO.5）；

特异性检测CD30/CD31位点野生型及CD31(AGG>AAG)的淬灭探针：

5’-aatggcgagtatggtgcgg–BHQ2-3’（SEQNO.6）；

特异性检测CD30(delGAG)突变类型的荧光探针：

5’-aaccctgaggtgaggctcc-HEX-3’（SEQNO.7）；

特异性检测CD30(delGAG)突变类型的淬灭探针：

5’-BHQ1-cctgctccgacccggaaa-3’（SEQNO.8）；

特异性检测WS/QS位点野生型的荧光探针：

5’-aagcacgcctccctggac-FAM-3’（SEQNO.9）；

特异性检测CS位点野生型的荧光探针：

5’-ROX-caaataccgttaagctggagaaa-3’（SEQNO.10）；

特异性检测WS(CD122，C>G)突变类型的荧光探针：

5’-aaggtgcaggcctcc-HEX-3’（SEQNO.11）；

特异性检测QS(CD125，T>C)突变类型的荧光探针：

5’-actccccggacaagttc-FAM-3’（SEQNO.12）；

特异性检测CS(CD142，T>C)突变类型的荧光探针：

5’-ROX-aataccgtcaagctggtaa-3’（SEQNO.13）；

特异性检测WS/QS/CS位点野生型及突变型的淬灭探针：

5’-BHQ1-cttctgtgagcaccgtgctg-BHQ2-3’（SEQNO.14）；

所述的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，HEX指六氯-6-甲基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，Cy5是指花青染料分子5，BHQ1和BHQ2是指荧光淬灭基团。

各条探针与WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变的位置见图1。

（4）其它组成成份：

TaKaRaLATaq酶及配套LATaqBuffer、dNTPS购自Takara公司，甜菜碱购自美国Sigma公司。

本发明所述试剂盒的使用方法为：

（1）反应体系为：

表1：本试剂盒的反应体系

（2）反应程序为：

95℃预变性8min；95℃30sec+72℃60sec，30个循环；95℃30sec+63℃20sec，40个循环；72℃再延伸5min；95℃变性5min；40℃复性30min；40℃-70℃解链分析并采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道荧光信号。

所用仪器为Bio-RadCFX96荧光定量PCR仪，购于美国Bio-Rad公司。

（3）样品处理：

用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至100-300ng/μl备用。其中gDNA标本可以通过以下方法获得：抽取外周全血标本，EDTA抗凝，采用天根柱式外周血基因组DNA柱式提取试剂（北京天根生物技术公司）抽提得到gDNA样本。

（4）样本检测：

将待检gDNA标本，应用上述反应体系和反应程序，于荧光定量PCR仪上进行扩增检测，记录解链分析图谱及对应解链温度值。

（5）数据分析和结果判断：

仪器配套软件会根据解链分析荧光信号的变化而自动显示解链分析峰图，峰图峰尖处（倒置峰的最低点）对应的温度即为解链温度，如图2所示：A中有两个解链温度，分别为52.5±1.0℃和61.0±1.0℃；B中只有一个52.5±0.5℃的解链温度。

本发明中检测的5种突变类型，其解链温度均设计在50℃-65℃之间,此5个突变位点野生型和突变型对应的荧光通道及解链温度见表2。检测结果可按上述操作说明获得受检样本的解链温度，然后再结合表3分析其突变基因型。

表2α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31野生型及突变型对应荧光通道及解链温度表

表3：α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31突变基因型解链温度分析表

实施例2

利用实施例1的试剂盒及方法对α-地中海贫血珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31点突变进行检测：

1、样本来源及类型：

从本实验室样本库中选取已确诊的α-地贫gDNA标本，基因型分别为α^CD30α/αα、α^CD30α/α^CD30α、α^CD31α/αα、α^CD31α/α^CD31α各1份，α^CSα/αα、α^CSα/α^CSα、α^WSα/αα、α^WSα/α^WSα、α^QSα/αα、α^QSα/α^QSα、--^SEA/α^WSα、--^SEA/α^QSα、--^SEA/α^CSα、αα/αα各2份,用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至100－200ng/μl备用。

2、样本检测：

将上述待检gDNA标本，应用上述本试剂盒的反应体系（表1），以本发明的PCR反应程序（95℃预变性8min；95℃30sec+72℃60sec，30个循环；95℃30sec+63℃20sec，40个循环；72℃再延伸5min；95℃变性5min；40℃复性30min；40℃-70℃解链分析并采集FAM、HEX、ROX、Cy5通道荧光信号），于Bio-RadCFX96荧光定量PCR仪上进行扩增检测，记录解链温度值

3、数据分析和结果判断：

本案例的检测结果见表4。本方法检测确定的点突变基因型与已知的点突变基因型完全相符，灵敏度与准确性均达到100%。（代表性解链分析峰图见图3、图4、图5、图6）。

表4：相对拷贝数定量数据分析表

注：*第一列基因型后所标(1)、(2)表示此基因型标本第1、2号标本。

#α-地贫基因型为--^SEA/α^WSα、--^SEA/α^QSα、--^SEA/α^CSα的标本，由于其中一个单倍型的α珠蛋白基因缺失，因此只存在有点突变的α2珠蛋白基因序列，故其点突变基因型为突变纯合。

以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

<110> 南方医科大学

<120> 一种检测α2珠蛋白基因点突变的巢式非对称PCR试剂盒

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctcgcgggc cggcact 17

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctccattgtt ggcacattcc gggatag 27

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgcggggag aagcagagt 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gggcaggagg aacggctac 19

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccctggagag gtgaggctaa a 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aatggcgagt atggtgcgg 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aaccctgagg tgaggctcc 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cctgctccga cccggaaa 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

aagcacgcct ccctggac 18

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

caaataccgt taagctggag aaa 23

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaggtgcagg cctcc 15

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

actccccgga caagttc 17

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aataccgtca agctggtaa 19

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cttctgtgag caccgtgctg 20

Claims

1.用于检测α2珠蛋白基因点突变的巢式非对称荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括：

（1）用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物对；

（2）用于扩增CD30/CD31目的片段DNA单链的引物；

（3）用于扩增WS/QS/CS目的片段DNA单链的引物；

（4）特异性检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变序列的野生型及突变型的荧光探针，以及相对应的淬灭探针，通过在荧光探针上修饰不同的荧光信号和/或不同的解链温度来区分WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变序列的野生型及突变型；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物对的Tm值≥72℃。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于扩增目的片段DNA单链的引物的Tm值≤63℃。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，特异性检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五个点突变序列的荧光探针以及相对应的淬灭探针的Tm值≤63℃。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物Tm值为72℃-74℃，其中：正向引物位于α2珠蛋白基因第1外显子5’端UTR区域；反向引物位于α2珠蛋白基因第3外显子3’端UTR区域，该区域须避开与α1珠蛋白基因的同源序列，从而保证扩增α2珠蛋白基因的特异性与准确性。

6.根据权利要求1或5所述的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性扩增α2珠蛋白全序列的引物对如下所示：

F：5’- gctcgcgggccggcact - 3’（SEQ ID NO. 1），

R：5’-ctccattgttggcacattccgggatag-3’（SEQ ID NO. 2）。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于： 1）所述用于扩增CD30/CD31目的片段DNA单链的引物，是位于CD30/CD31突变3’端100-130bp位置的反向扩增引物，Tm值62℃-64℃； 2）所述用于扩增WS/QS/CS目的片段DNA单链的引物，是位于CS突变3’端10-35bp，距权利5所列特异性α2珠蛋白全序列3’末端2-5bp的反向扩增引物，Tm值62℃-64℃。

8.根据权利要求1或7所述的试剂盒，其特征在于：

1）所述用于扩增CD30/CD31目的片段DNA单链的引物序列为：5’-ctgcggggagaagcagagt -3’（SEQ NO. 3）；

2）所述用于扩增WS/QS/CS目的片段DNA单链的引物序列为：5’- gggcaggaggaacggctac -3’（SEQ NO.4）。

9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五个突变位点的荧光探针以及相对应的淬灭探针的序列分别如下：

（2）特异性检测CD30（del GAG）突变类型的荧光探针，为包含CD30位点、5’侧翼6-9bp及3’侧翼11-14bp的突变型DNA序列，正义链，Tm值58℃-60℃，3’端标记HEX荧光基团；

10.根据权利要求1或9所述的试剂盒，其特征在于，所述用于特异性检测α2珠蛋白基因WS、QS、CS、CD30、CD31五个突变位点的荧光探针以及相对应的淬灭探针的序列分别如下：

5’- ccctggagaggtgaggctaaa -3’（SEQ NO. 5），

相对应的淬灭探针为：5’-aatggcgagtatggtgcgg-BHQ2-3’（SEQ NO. 6）；

（2）特异性检测CD30（del GAG）突变类型的荧光探针为：

5’- aaccctgaggtgaggctcc-HEX-3’（SEQ NO. 7）；

相对应的淬灭探针为：5’-BHQ1-cctgctccgacccggaaa -3’（SEQ NO. 8）；

（3）特异性检测WS/QS位点野生型的荧光探针为：

5’- aagcacgcctccctggac-FAM-3’（SEQ NO. 9）；

（4）特异性检测CS位点野生型的荧光探针为：

5’-ROX-caaataccgttaagctggagaaa -3’（SEQ NO. 10）；

（5）特异性检测WS（CD122，C>G）突变类型的荧光探针为：

5’-aaggtgcaggcctcc-HEX-3’（SEQ NO. 11）；

（6）特异性检测QS（CD125，T>C）突变类型的荧光探针为：

5’-actccccggacaagttc-FAM-3’（SEQ NO. 12）；

（7）特异性检测CS（CD142，T>C）突变类型的荧光探针为：

5’-ROX-aataccgtcaagctggtaa-3’（SEQ NO. 13）；

5’-BHQ1-cttctgtgagcaccgtgctg-BHQ2-3’（SEQ NO. 14）。