CN102146476A - 一种检测α-珠蛋白基因缺失的荧光定量PCR试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学领域,提供一种检测α-珠蛋白基因缺失的荧光定量PCR试剂盒,该试剂盒由一对特异性扩增ζ珠蛋白的引物、一对特异性扩增α1珠蛋白的引物、一对特异性扩增α2珠蛋白的引物、一对特异性扩增β-Actin基因的引物、特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针物、特异性检测α1珠蛋白的荧光探针、特异性检测α2珠蛋白的荧光探针、特异性检测β-Actin基因的荧光探针和DNA聚合酶等组成。该试剂盒对检测缺失型α-地中海贫血具有良好的敏感性和准确性,重复性和稳定性很好,完全适用于缺失型α-地中海贫血的临床检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物化学领域,具体涉及包含核酸的测定或检验方法的试剂。
背景技术
人类α-珠蛋白基因簇位于16号染色体上,有ζ、α1、α2三个功能基因,表达相应的ζ和α珠蛋白链,再与相应的β珠蛋白链结合,形成ζ2γ2(胚胎期血红蛋白Hb Portland)和α2β2(成人血红蛋HbA)。正常情况下,人类珠蛋白基因所表达的α类和β类珠蛋白链比例适当,形成具有功能的血红蛋白四聚体。当α珠蛋白基因缺陷,导致α链合成减少而β链相对过剩,即可导致α-地中海贫血疾病。地中海贫血(简称“地贫”)是全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病之一,主要集中在地中海沿岸国家、东南亚、少数非洲地区和我国南方,保守估计全世界携带者近2亿人。临床上常见α-地贫和β-地贫。但α-地贫的人群携带率远高于β-地贫。此病无有效治疗手段,应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。导致α链合成减少的基因缺陷主要是α珠蛋白基因缺失,其缺失数目是α-地贫临床表现及分型的依据。正常个体为2个α1和2个α2珠蛋白基因,其中:缺失1个为静止型,缺失2个为标准型,缺失3为HbH病,4个均缺失的为Hb Bart’s胎儿水肿综合征。
在α-珠蛋白基因缺失型分子诊断和产前诊断的临床实践中,采用相应的技术方法,分析是否存在某种缺失类型而间接推导α珠蛋白基因的缺失情况。检测技术发展历程中,准确性高但操作繁琐、费时费力的Southern杂交技术,不适合常规检测,目前实验室已基本不用。随着上世纪80年代末PCR技术的发明,此技术很快被应用于α-地贫基因缺失分子诊断。在缺失区域两侧设计一对引物,正常情况下两引物间片段很长不属于PCR有效扩增范围,而当缺失时距离变短则能扩增出特异性的扩增产物,此即目前常规使用的跨越裂点PCR技术(也称裂口PCR,gap-PCR)。以PCR技术的高灵敏性及相对易操作特点,结合当时为数很少的几种已知缺失类型,gap-PCR分子诊断方法尚能基本满足需求。随着α-地贫分子机制及分子流行病学的研究与发展,新的缺失类型陆续发现,目前缺失种类已超过30种。并且,α珠蛋白基因簇具有高GC含量及高度同源的结构特征,加上各缺失类型的缺失范围不相同、缺失长度不一,有的缺失类型断裂点不明,这也就意味着目前的gap-PCR方法,必须采用不同的检测体系和检测条件,逐一对各种缺失类型分别进行分析,以确定受检者是否有基因缺失及缺失类型。另外,PCR技术具有高灵敏性,极微量的外源污染,尤其是产前诊断中的母源性污染,就能导致基于gap-PCR方法定性分析的假阳性诊断结果,造成严重后果。总的来说,目前常规使用的gap-PCR方法,检测成本高、工作量大、操作繁琐、检测通量小,难以实现自动化和标准化,且存在难以解决的假阴性及假阳性技术瓶颈,不能满足当前缺失型α-地贫的大规模人群筛查和临床常规分子诊断需要。
针对gap-PCR应用于α-珠蛋白基因缺失分子诊断上的局限,近年来对gap-PCR方法进行改进。例如多重gap-PCR方法,即在同一PCR反应体系里加上两对以上特异性引物,同时检测几种已知缺失类型,但由于各缺失类型的缺失范围与长度不同,各自的PCR体系及扩增条件也就不同,所以多重gap-PCR也只是局限于极少的、PCR扩增体系与条件基本相同的缺失类型;也有学者报道应用DHPLC(变性高效液相色谱)作为后PCR产物分析处理方式,对-α3.7和-α4.2等缺失类型进行分子诊断,以提高检测通量;还有报道以熔链分析作为gap-PCR产物分析处理方式,检测SEA和THAIL两种缺失类型。最近,有报道应用实时荧光PCR对SEA和/或Hb Bart’s胎儿水肿综合征进行分子诊断,其扩增与检测一次性闭管完成,无凝胶电泳等后PCR处理,虽然只局限于某一种缺失类型的检测,但其具有操作相对简单、可实现标准化及大规模检测等技术优势。总的来说,一些分子生物学新技术,已相继应用到缺失型α-地贫的分子诊断中,在方法学上虽然有一定进展,但基本上都属于针对各种缺失类型进行定性分析的方法学改进,仍存在假阴性与假阳性等技术瓶颈,其操作可行性、检测通量等方面不能满足当前大规模人群筛查及常规检测的需要。
随着目前以降低地贫患儿出生率为目标的预防计划与措施的相继实施,以及地贫分子机制及分子流行病学的深入研究,准确可靠、简单实用、能实现自动化和标准化、适合大规模人群筛查和常规分子诊断的高通量检测技术与方法,是这些项目实施的技术支撑条件,更是当前地中海贫血遗分子诊断的迫切需要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测α-珠蛋白基因缺失的荧光定量PCR试剂盒,该试剂盒可以直接定量检测α珠蛋白基因簇中ζ、α1、α2三个功能基因的拷贝数以及拷贝数的变化。
为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案是:
一种检测α-珠蛋白基因缺失的荧光定量PCR试剂盒,该试剂盒包括扩增引物和荧光探针,其特征在于,所述的扩增引物为,一对特异性扩增ζ珠蛋白的引物、一对特异性扩增α1珠蛋白的引物、一对特异性扩增α2珠蛋白的引物和一对特异性扩增β-Actin基因的引物;所述的荧光探针为,特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针、特异性检测α1珠蛋白的荧光探针、特异性检测α2珠蛋白的荧光探针和特异性检测β-Actin基因的荧光探针,其中,
(1)所述的一对特异性扩增α1珠蛋白的引物中,
上游引物序列为:5’-CGTCGTGTACTTGTGTGATGGTTAGA-3’(SEQ NO.1),
下游引物序列为:5’-CGTCGTAAACAGGTAAACAAAGCAATAG-3’(SEQ NO.2);
(2)所述的一对特异性扩增α2珠蛋白的引物中,
上游引物序列为:5’-CGTCGTGTACAACTTCCTATTCTCAGTG-3’(SEQ NO.3),
下游引物序列为:5’-CGTCGGGAAGACTTGCTAGGTAAATACT-3’(SEQ NO.4);
(3)所述的一对特异性扩增ζ珠蛋白的引物中,
上游引物序列为:5’-CCGTCCAGGAGGCTGCTTACT-3’(SEQ NO.5),
下游引物序列为:5’-GGTGCTCCTTATTCATTTCAGAATCAC-3’(SEQ NO.6);
(4)所述的一对特异性扩增β-Actin基因的引物中,
上游引物序列为:5’-GGTCCCTACTGTGCACCTACTTAATACAC-3’(SEQ NO.7),
下游引物序列为:5’-GCTGACACTGGCTCGTGTGAC-3’(SEQ NO.8);
(5)所述的特异性检测α1珠蛋白的荧光探针为:
5’-FAM-CTGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGC-BHQ1-3’(SEQ NO.9);
(6)所述的特异性检测α2珠蛋白的荧光探针为:
5’-HEX-TCTCCCCTGCATCCCTTTCAGC-BHQ1-3’(SEQ NO.10);
(7)所述的特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针为:
5’-Cy5-CCCTGCTCCTCTGGTTTCCCC-BHQ2-3’(SEQ NO.11);
(8)所述的特异性检测β-Actin基因的荧光探针为:
5’-ROX-CAAGGCCGCTTTACACCAGCCT-BHQ2-3’(SEQ NO.12)。
本发明所述的扩增引物和荧光探针可以由本领域常用的方法合成。
本发明所述的荧光探针中,FAM指羧基荧光素,HEX指六氯-6-甲基荧光素,ROX指羧基-X-罗丹明,CY5是指花青染料分子5,BHQ1和BHQ2是指荧光淬灭基团。
本发明所述的荧光定量PCR试剂盒还包括多重PCR常用试剂,如,DNA聚合酶、200ng/ul正常基因型对照gDNA标本、二氯化镁和dNTPs等,其中DNA聚合酶为Ex Taq。DNA聚合酶、二氯化镁和dNTPs由宝生物(TaKaRa)大连有限公司提供。
本发明中,ζ、α1、α2珠蛋白基因为目的基因,β-Actin(β肌动蛋白基因)为参比基因。所有目的基因和参比基因扩增子DNA序列长度为70-120bp、GC含量40%-65%、无连续的5个G或C(参见图1)。
本发明所述的试剂盒的使用方法为:
(1)反应体系为:
表1:本发明试剂盒PCR反应体系
(2)反应程序为:95℃预变性5min;94℃30sec+52℃30sec,3-5个循环;90℃20sec+60℃1min,35个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号。
反应所用仪器为StrateGene MX3005P,购于美国Invitrogene公司。
(3)样品处理:用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至100-300ng/μl备用。其中gDNA标本可以通过以下方法获得:抽取外周全血标本,EDTA抗凝,采用天根柱式外周血基因组DNA柱式提取试剂(北京天根生物技术公司)抽提得到gDNA样本。
(4)样本检测:将待检gDNA标本,2-3份ζ、α1和α2珠蛋白基因拷贝数均为2的正常对照gDNA样本,以及1-2份α1和α2珠蛋白基因拷贝数已知的质控gDNA样本,应用上述反应体系和反应程序,于荧光定量PCR仪上进行扩增检测,记录Ct值。
(5)数据分析和结果判断:参照文献(Kenneth J,et a1.METHODS.2001;25:402-408)的基本模式,根据定量检测所获得的Ct值(即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,其值的大小可以反映所检测模板数的多少),以ζ、α1和α2珠蛋白基因拷贝数均为2的正常标本为对照标本,按下述公式进行计算:
待检样本(或对照样本)目的基因ΔCt=Ct_目的基因-Ct_参比基因
待检样本目的基因ΔΔCt=ΔCt_待检样本-ΔCt_对照样本
待检样本目的基因相对拷贝数Cs=2-ΔΔCt×2(2为对照标本该目的基因已知拷贝数);
以ζ、α2或α1基因均为2个拷贝的正常标本作为正常对照标本时,目的基因(ζ、α1或α2)的Cs为0.5-1.4(2-ΔΔCt值为0.25-0.70)时,其相对拷贝数为1,即为缺失了1个目的基因;当Cs>1.5(2-ΔΔCt值>0.75)时,则判断此目的基因无缺失;如果目的基因片段无扩增,或2-ΔΔCt值<0.2时,可判断受检样本中无此目的基因,即缺失了2个目的基因。
本发明的基本原理是基于α珠蛋白基因缺失是导致α-地贫根本原因的发病机制。人类α珠蛋白基因簇中,只有ζ、α1、α2三个功能基因,表达相应的ζ(ζ基因)和α(α1和α2基因)珠蛋白链,其再与相应的β珠蛋白链结合,形成ζ2γ2(胎儿期血红蛋白Hb Portland)和α2β2(成人血红蛋HbA)。正常情况下,α和β珠蛋白链的比例适当(1∶1),形成具有生物功能的血红蛋白四聚体。当α珠蛋白功能基因缺失,导致α合成减少而β链相对过剩则为α-地贫。就一套人类正常基因组而言(即一个细胞的核基因组),α珠蛋白基因型为ζζ/α1α1/α2α2,即ζ、α1、α2珠蛋白基因各有两个拷贝,缺失型α-地贫即是由于缺失了其中1个或几个功能基因所引起。据此分子机制,任何一种分子诊断方法的最终目的都是为了确定α珠蛋白基因是否有缺失及缺失了多少,只要能准确分析α珠蛋白基因的缺失与缺失数目,也就能准确诊断缺失型α-地贫。本发明所述的试剂盒,即是采用四重TaqMan荧光定量技术,定量检测样本中ζ、α1、α2基因的拷贝数,以其拷贝数变化,实现缺失型α-地贫的快速分子诊断。
本发明具有以下优点:
(1)本发明设计的引物探针具有很好的特异性和重复性。
(2)本发明所述的试剂盒对α-地中海贫血珠蛋白基因缺失检测,具有良好的灵敏度、稳定性与准确性。
(3)本发明所述的试剂盒对α-地中海贫血珠蛋白基因缺失检测,具有良好的敏感度和特异度。
附图说明
图1是本发明试剂盒扩增的代表性DNA片段的基因组中的位置图及相关信息。
图2是数据分析(2-ΔΔCt值计算)图示。
具体实施方式
下面将结合实施例来说明本发明具有的有益效果。
实施例1:试剂盒的灵敏性与准确性小样本评价
1、试剂盒的组成:
(1)特异性扩增α1珠蛋白的上游引物为:
5’-CGTCGTGTACTTGTGTGATGGTTAGA-3’(SEQ NO.1),
特异性扩增α1珠蛋白的下游引物为:
5’-CGTCGTAAACAGGTAAACAAAGCAATAG-3’(SEQ NO.2),
(2)特异性扩增α2珠蛋白的上游引物序列为:
5’-CGTCGTGTACAACTTCCTATTCTCAGTG-3’(SEQ NO.3),
特异性扩增α2珠蛋白的下游引物为:
5’-CGTCGGGAAGACTTGCTAGGTAAATACT-3’(SEQ NO.4),
(3)特异性扩增ζ珠蛋白的上游引物为:
5’-CCGTCCAGGAGGCTGCTTACT-3’(SEQ NO.5),
特异性扩增ζ珠蛋白的下游引物列为:
5’-GGTGCTCCTTATTCATTTCAGAATCAC-3’(SEQ NO.6),
(4)特异性扩增β-Actin基因的上游引物为:
5’-GGTCCCTACTGTGCACCTACTTAATACAC-3’(SEQ NO.7),
特异性扩增β-Actin基因的下游引物为:
5’-GCTGACACTGGCTCGTGTGAC-3’(SEQ NO.8);
(5)特异性检测α1珠蛋白的荧光探针为:
5’-FAM-CTGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGC-BHQ1-3’(SEQ NO.9),
(6)特异性检测α2珠蛋白的荧光探针为:
5’-HEX-TCTCCCCTGCATCCCTTTCAGC-BHQ1-3’(SEQ NO.10),
(7)特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针为:
5’-Cy5-CCCTGCTCCTCTGGTTTCCCC-BHQ2-3’(SEQ NO.11),
(8)特异性检测β-Actin基因的荧光探针为:
5’-ROX-CAAGGCCGCTTTACACCAGCCT-BHQ2-3’(SEQ NO.12)。
(9)其它组成成份:
TaKaRa Ex Taq酶及配套Buffer、dNTPS、MgCl2购自Takara公司。2、α-地中海贫血珠蛋白基因缺失的检测:
(1)样本来源及类型:从本实验室样本库中选取已确诊的缺失型α-地贫gDNA标本,基因型分别为αα/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα、--SEA/-α4.2、--SEA/--SEA、-SEA/-α3.7、-α3.7/-α3.7、-α4.2/-α4.2、-αhail/αα各1份(共10份),用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至100-300ng/μl备用。
(2)样本检测:将上述待检gDNA标本,2份ζ、α1和α2珠蛋白基因拷贝数均为2的正常对照gDNA样本,以及1-2份质量控制标本,应用上述本发明的反应体系(表1),以本发明的PCR反应程序(95℃预变性5min;94℃30sec+52℃30sec,3-5个循环;90℃20sec+60℃1min,35个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号),于StrateGene MX 3005P荧光定量PCR仪上进行扩增检测,记录Ct值。
(3)数据分析和结果判断:根据本发明所述的数据分析公式进行计算,并按其结果判断标准确定检测所获得的目的基因拷贝数。
3、检测结果:
本案例的检测结果见表2。根据所检标本α-地贫基因型所推导的目的基因拷贝数值与本案例分析的结果相比较,本试剂盒的灵敏度与准确性均达到100%。
表2:相对拷贝数定量数据分析表
*标本号1无目的基因缺失;2为缺失1个α2基因;3为缺失1个α1基因;4为缺失2个α2基因;5为缺失2个α1基因;6为缺失2个α2和1个α1基因;7为缺失1个α2和2个α1基因;8为缺失1个α2和1个α1基
因;9为缺失2个α2和2个α1基因;10为缺失1个ζ、1个α2和1个α1基因。
4、结果分析及临床意义:
(1)数据分析结果显示ζ、α2或α1基因均为2个拷贝,提示受检标本无此三个基因的缺失,即可排除缺失型α-地贫,但不能排除导致α-地贫的点突变类型。
(2)数据分析结果显示ζ、α2为2个拷贝,α1为1个拷贝,提示受检标本为缺失1个α1基因的静止型α-地贫,我国南方地区常见的缺失类型基因型为-α3.7/αα。
(3)数据分析结果显示ζ、α1为2个拷贝,α2为1个拷贝,提示受检标本为缺失1个α2基因的静止型α-地贫,我国南方地区常见的缺失类型基因型为-α4.2/αα。
(4)数据分析结果显示ζ为2个拷贝,α1和α2为1个拷贝,提示受检标本为缺失1个α2和1个α1基因的标准型α-地贫,我国南方地区常见的缺失类型基因型为--SEA/αα。
(5)数据分析结果显示ζ、α2为2个拷贝,无α1目的基因,提示受检标本为缺失2个α1基因的标准型α-地贫,我国南方地区常见的缺失类型基因型为-α3.7/-α3.7。
(6)数据分析结果显示ζ、α1为2个拷贝,无α2目的基因,提示受检标本为缺失2个α2基因的标准型α-地贫,我国南方地区常见的缺失类型基因型为-α4.2/-α4.2。
(7)数据分析结果显示ζ为2个拷贝,α2为1个拷贝,无α1目的基因,提示受检标本为缺失2个α1基因和1个α2基因HbH病,我国南方地区常见的缺失类型基因型为--SEA/-α3.7。
(8)数据分析结果显示ζ为2个拷贝,α1为1个拷贝,无α2目的基因,提示受检标本为缺失2个α2基因和1个α1基因HbH病,我国南方地区常见的缺失类型基因型为--SEA/-α4.2。
(9)数据分析结果显示ζ为2个拷贝,无α2和α1目的基因,提示受检标本为缺失2个α2基因和2个α1基因Hb Bart’s水肿胎,我国南方地区常见的缺失类型基因型为--SEA/--SEA。
(10)数据分析结果显示ζ、α2和α1均为1个拷贝,提示受检标本为缺失1个ζ、1个α2和1个α1基因的标准型α-地贫,我国南方地区常见的缺失类型基因型为--THAI/αα或--FIL/αα。
(11)另外,数据分析时,如果某目的基因的2-ΔΔCt值>1.25,提示此受检标本可能为此目的基因的多拷贝,可采用其它相应方法进行检测确认;如果某目的基因有扩增,但2-ΔΔCt值<0.2,则提示很可能为非特异性扩增,或微量目的基因片段的污染所导致,可判断为样本中无此目的基因。
实施例2:本发明所述试剂盒的敏感度和特异度评价
1.标本收集:
从本实验室样本库中,收集218例经gap-PCR检测的已知基因型gDNA标本,此批标本包含αα/αα、-α3.7/αα、-α4.2/αα、--SEA/αα、--SEA/-α4.2、--SEA/--SEA、-SEA/-α3.7、-α3.7/-α3.7、-α4.2/-α4.2、-αTHAI/αα这10种基因型,用灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至100-300ng/μl备用。所采用的gap-PCR检测体系为已通过Southern Blot验证的检测体系,根据缺失类型准确推导ζ、α1、α2基因相对拷贝数。
2.标本检测:
(1)试剂盒组成:
同实施例1。
(2)样本检测:将上述待检gDNA标本,2份ζ、α1和α2珠蛋白基因拷贝数均为2的正常对照gDNA样本,以及1-2份质量控制标本,应用上述本发明的反应体系(表1),以本发明的PCR反应程序(95℃预变性5min;94℃30sec+52℃30sec,3-5个循环;90℃20sec+60℃1min,35个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号),于StrateGene MX 3005P荧光定量PCR仪上进行扩增检测,记录Ct值。
(3)数据分析和结果判断:根据本发明所述的数据分析公式进行计算,并按其结果判断标准确定检测所获得的目的基因拷贝数。
3、检测结果:
本案例的检测结果见表3。根据所检标本α-地贫基因型所推导的目的基因拷贝数值与本案例分析的结果相比较,结果表明本发明所述的荧光定量PCR试剂盒诊断基因缺失型α-地贫的敏感度和特异度均达到100%。
4、结果分析及临床意义:
同实施例1。
表3:218例已知基因型标本基因拷贝数定量检测结果
*3为目的基因三拷贝数,(1)为例数,2/3(1)即是指其中有1例为目的基因3拷贝;0.99±0.09为相对拷贝数为2的2-ΔΔCt±SD,1.33±0.00为相对拷贝数为3的2-ΔΔCt±SD。
实施例3:小规模人群筛查检测评价
1.标本收集:
从南方医院产前诊断中心生化遗传室随机收集104份外周血标本,用F-820血液分析仪,对此104份外周血标本作血常规分析,以获得表型资料。再用天根柱式外周血基因组DNA柱式提取试剂(北京天根生物技术公司)抽提gDNA,以灭菌双蒸水将gDNA标本稀释至100-300ng/μl备用。
2.标本检测:
(1)试剂盒组成:
同实施例1
(2)样本检测:将上述104份待检gDNA标本,采用双盲的方法,同时应用缺失型α-地贫gap-PCR方法及本试剂盒平行检测。所采用的gap-PCR方法为本实验室已通过Southern Blot验证的检测体系及检测条件。本试剂盒的检测方法为:每一轮PCR反应,将待检标本,2份ζ、α1和α2珠蛋白基因拷贝数均为2的正常对照gDNA样本,2份ζ、α1和α2珠蛋白基因拷贝数已知的质控标本,应用上述本发明的反应体系(表1),以本发明的PCR反应程序(95℃预变性5min;94℃30sec+52℃30sec,3-5个循环;90℃20sec+60℃1min,35个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号),于StrateGene MX 3005P荧光定量PCR仪上进行扩增检测,记录Ct值。
(3)数据分析和结果判断:根据本发明所述的数据分析公式进行计算,并按其结果判断标准确定检测所获得的目的基因拷贝数。
3、检测结果:
两种检测方法均检出16例标本有α珠蛋白基因缺失,88例无α珠蛋白基因缺失,阴性与阳性符合率100%。其中,16例阳性标本中,由gap-PCR所推导的α珠蛋白基因缺失类型和数目,与本发明所述的试剂盒所获得的基因拷贝数结果一致,符合率达100%(见表4)。
4、结果分析及临床意义:
同实施例1。
表4:104例随机人群α-地贫珠蛋白基因缺失筛查基因拷贝数检测结果
C_d:经缺失类型所推导的基因相对拷贝数;C_R:定量检测基因相对拷贝数;
+:表型阳性(小细胞低色素);-:表型正常
实施例4:大样本盲法分析评价
1.标本收集:
从本教研室样本资源库中所保存的gDNA样本中,选取表型资料完整、均已用gap-PCR检测3.7、4.2、SEA、THAIL等这几种本地区常见缺失类型gDNA标本545份,包含αα/αα、-α4.2/αα、-α3.7/αα、--SEA/αα、-α3.7/-α4.2、--SEA/-α4.2、--SEA/-α3.7、--S EA/--SEA、--THAIL/αα、-α4.2/-α4.2、-α3.7/-α3.7这几种本地区多见的缺失型α-地贫基因型;以及本教研室新发现缺失类型αα/--27.6、--SEA/--27.6;并另收集本教研室已用MLPA检测的α1珠蛋白基因三联体(anti3.7)gDNA标本。这批标本,先检测其浓度,按所需标本量为30-50μl、DNA浓度为200ng/μl左右进行稀释,然后,于核酸蛋白分析仪上,测定标本浓度以保证DNA浓度范围为100-300ng/μl,OD260/280>1.55,对于不符合要求的标本,不纳入本次评价分析。
2.标本检测:
(1)试剂盒组成:
同实施例1
(2)样本检测:将上述545份待检gDNA标本,进行盲法编号后,应用本发明的试剂盒进行检测,检测方法为:每一轮PCR反应,将待检标本,2份ζ、α1和α2珠蛋白基因拷贝数均为2的正常对照gDNA样本,1份ζ、α1和α2珠蛋白基因拷贝数已知的质控标本,应用上述本发明的反应体系(表1),以本发明的PCR反应程序(95℃预变性5min;94℃30sec+52℃30sec,3-5个循环;90℃20sec+60℃1min,35个循环,于60℃退火步骤末采集荧光信号),于StrateGene MX 3005P荧光定量PCR仪上进行扩增检测,记录Ct值。
(3)数据分析和结果判断:根据本发明所述的数据分析公式进行计算,并按其结果判断标准确定检测所获得的目的基因拷贝数。
(4)检测结果汇总分析与处理:将定量检测结果汇总,与以gap-PCR检测缺失基因型所推导的ζ、α1、α2基因相对拷贝数结果进行比校分析。针对缺失型α地贫的检测结果分析,缺失类型分析与定量方法结果相符合的,从中随机抽取若干标本,以MLPA验证。对于不相符的,先用gap-PCR进行缺失类型复查,以校正gap-PCR检测结果,并从校正的结果之中随机抽取几份以MLPA验证。经第一轮分析与校正后,对于检测结果仍不相符的标本,采用酚氯仿抽提法对标本进行纯化,盲法编号后,再用本研究所建立的新方法进行复查,并分析复查结果,如还有不相符的检测结果,则用MPLA进行验证。针对α-珠蛋白基因多拷贝(CNVs),则用MPLA进行验证。
3、检测结果:
此批545份盲法分析标本中,有3例检测结果特殊的标本,有待采用其它检测手段作进行一步进行分析与探计,其具体情况还不明晰,故未纳入汇总分析。有效的542份评价标本的检测结果显示:缺失1个目的基因与无缺失的标本,2-ΔΔCt值差异明显,相对拷贝数分析结果可靠,用于缺失型α地贫的分子诊断准确性与灵敏度均达到100%。对于2-ΔΔCt值大于1.25的可疑目的基因多拷贝,所检出的5例α2基因三拷贝均经MLPA验证(准确性为100%),而7例α1基因三拷贝标本,只有3例为经MLPA验证的三拷贝(准确性为42.8%)。由此说明,本发明所建立的定量PCR试剂盒,能实现缺失型α-地贫快速分子诊断,其灵敏度、准确性与实用性能满足当前大规模人群筛查和常规分子诊断要求;并能初步筛检α珠蛋白基因多拷贝。
检测结果详列于表5和表6。
表6:542例盲法标本α-地贫基因缺失诊断结果汇总分析
*敏感度=487/(487+0)×100%=100%特异度=55/(55+0)×100%=100%
Claims (1)
1.一种检测α-珠蛋白基因缺失的荧光定量PCR试剂盒,该试剂盒包括扩增引物和荧光探针,其特征在于,所述的扩增引物为,一对特异性扩增ζ珠蛋白的引物、一对特异性扩增α1珠蛋白的引物、一对特异性扩增α2珠蛋白的引物和一对特异性扩增β-Actin基因的引物;所述的荧光探针为,特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针、特异性检测α1珠蛋白的荧光探针、特异性检测α2珠蛋白的荧光探针和特异性检测β-Actin基因的荧光探针,其中,
(1)所述的一对特异性扩增α1珠蛋白的引物中,
上游引物序列为:5’-CGTCGTGTACTTGTGTGATGGTTAGA-3’(SEQ NO.1),
下游引物序列为:5’-CGTCGTAAACAGGTAAACAAAGCAATAG-3’(SEQ NO.2);
(2)所述的一对特异性扩增α2珠蛋白的引物中,
上游引物序列为:5’-CGTCGTGTACAACTTCCTATTCTCAGTG-3’(SEQ NO.3),
下游引物序列为:5’-CGTCGGGAAGACTTGCTAGGTAAATACT-3’(SEQ NO.4);
(3)所述的一对特异性扩增ζ珠蛋白的引物中,
上游引物序列为:5’-CCGTCCAGGAGGCTGCTTACT-3’(SEQ NO.5),
下游引物序列为:5’-GGTGCTCCTTATTCATTTCAGAATCAC-3’(SEQ NO.6);
(4)所述的一对特异性扩增β-Actin基因的引物中,
上游引物序列为:5’-GGTCCCTACTGTGCACCTACTTAATACAC-3’(SEQ NO.7),
下游引物序列为:5’-GCTGACACTGGCTCGTGTGAC-3’(SEQ NO.8);
(5)所述的特异性检测α1珠蛋白的荧光探针为:
5’-FAM-CTGCCTACCTCCCAGAGGAGGTTGAATGC-BHQ1-3’(SEQ NO.9);
(6)所述的特异性检测α2珠蛋白的荧光探针为:
5’-HEX-TCTCCCCTGCATCCCTTTCAGC-BHQ1-3’(SEQ NO.10);
(7)所述的特异性检测ζ珠蛋白的荧光探针为:
5’-Cy5-CCCTGCTCCTCTGGTTTCCCC-BHQ2-3’(SEQ NO.11);
(8)所述的特异性检测β-Actin基因的荧光探针为:
5’-ROX-CAAGGCCGCTTTACACCAGCCT-BHQ2-3’(SEQ NO.12)。2、根据权利要求1所述的荧光定量PCR试剂盒,其特征在于该试剂盒还包括Premix ExTaqTM、二氯化镁和dNTPS。
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