CN116203143B - 血红蛋白病的标志物组合物及其筛查试剂与应用 - Google Patents
血红蛋白病的标志物组合物及其筛查试剂与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种血红蛋白病的标志物组合物及其筛查试剂与应用。该标志物组合物由血红蛋白中的a珠蛋白链、β珠蛋白链、ζ珠蛋白链、δ珠蛋白链、γ珠蛋白链、ε珠蛋白链中的任两种组成。本发明新报道了ζ、δ、γ、ε等珠蛋白链与a、β地中海贫血及异常血红蛋白病的关系，通过筛查血红蛋白病患者血红蛋白中的各型珠蛋白链，不仅可以早期识别不同类型的红蛋白病，还可以诊断出各年龄段血红蛋白病患者疾病类型。本发明提供的标志物组合物对于血红蛋白病的诊断具有非常重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种血红蛋白病的标志物组合物及其筛查试剂与应用。
背景技术
血红蛋白病包括地中海贫血和异常血红蛋白病。地中海贫血又称珠蛋白生成障碍性贫血，广泛分布于世界多个地区，是非常值得关注的社会问题。本病是由于遗传缺陷导致血红蛋白α、β珠蛋白链合成缺失或不足，α、β珠蛋白链比例失衡，进而造成红细胞寿命缩短或功能异常的一种先天性贫血。地中海贫血根据异常表达的珠蛋白链的不同，主要分为α地中海贫血和β地中海贫血两大类。异常血红蛋白病主要由珠蛋白链单个氨基酸的置换变异引起，常见类型有HbC、HbE、HbS，其中HbE又称为镰状细胞贫血。
作为发病后的诊断，一般通过血常规检查发现为低色素性小细胞贫血。排除缺铁性贫血，结合血红蛋白电泳与基因诊断技术对疑似珠蛋白生成障碍性贫血的病人进行确诊，实验操作复杂，诊断费用昂贵，且不利于筛查普及。目前已有报道利用毛细管电泳对血红蛋白病进行早期筛查，但该方法对样本采样及保存要求高，筛查灵敏度和特异度有限，且常因样本溶血、降解、保存不当以及年龄等因素，造成无法检测，甚至漏筛、漏诊等情况，其临床应用受到限制。目前对血红蛋白病尚缺乏快速、高效的筛查手段。
本专利通过研究发现，a、β、ζ、δ、γ、ε等珠蛋白链与a、β地中海贫血及异常血红蛋白病存在密切联系，通过检测各型珠蛋白链，可识别出各年龄段血红蛋白病患者的疾病类型。
申请号为CN201510618319.5的发明专利公开了一种测定血红蛋白α与β珠蛋白链比率的方法及应用，但并未公开ζ、δ、γ、ε等珠蛋白链与a、β地中海贫血及异常血红蛋白病之间的联系，亦未公开由其组成的标志物组合物在血红蛋白病诊断中的应用。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种血红蛋白病的标志物组合物，该标志物组合物可早期识别不同类型的血红蛋白病。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
血红蛋白病的标志物组合物，所述标志物组合物由血红蛋白中的a珠蛋白链、β珠蛋白链、ζ珠蛋白链、δ珠蛋白链、γ珠蛋白链、ε珠蛋白链中的任两种或多种组成；所述血红蛋白来源于血红蛋白病患者的离体样本；
所述血红蛋白病包括地中海贫血和异常血红蛋白病，所述地中海贫血包括a地中海贫血和/或β地中海贫血，所述异常血红蛋白病包括异常血红蛋白病HbC、异常血红蛋白病HbS和/或异常血红蛋白病HbE。
a、β、ζ、δ、γ、ε珠蛋白链在人体内的表达具有时间特征，不同类型血红蛋白病累及的珠蛋白链不同，一种类型珠蛋白链表达减少时常伴随其它同类型珠蛋白链表达增加，通过液相色谱-质谱技术定性、定量分析受累的珠蛋白链，计算其与其它正常表达珠蛋白链的比率，可实现各型地中海贫血及异常血红蛋白病的鉴别。各型血红蛋白病的鉴别诊断指标为：
正常人、α地中海贫血携带者及患者ζ/α比值参考区间为：
正常人、β地中海贫血携带者、患者γ/β、δ/β比值参考区间为：
正常人、异常血红蛋白病携带者、患者标志肽段/珠蛋白链浓度参考区间为：
进一步，所述标志物组合物为α珠蛋白链和X1，其中X1为β珠蛋白链、γ珠蛋白链、δ珠蛋白链或ζ珠蛋白链；或所述标志物组合物为β珠蛋白链和X2，其中X2为γ珠蛋白链、δ珠蛋白链、ζ珠蛋白链或ε珠蛋白链；或所述标志物组合物为ζ珠蛋白链和γ珠蛋白链。
进一步，所述血红蛋白中各型珠蛋白链经不同蛋白酶消化而产生的肽段片段均可作为对应珠蛋白链的标志物。
不同蛋白酶(胰蛋白酶、羧肽酶、纤溶酶、凝血酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶等)裂解各型珠蛋白链产生的肽段片段会有所不同，然而不论采用上述何种蛋白酶裂解珠蛋白链，其产生的肽段片段均可作为血红蛋白分析的标志物：α珠蛋白链裂解片段均可作为α珠蛋白链的标志肽段；β珠蛋白链裂解片段均可作为β珠蛋白链的标志肽段；ζ珠蛋白链裂解片段均可作为ζ珠蛋白链的标志肽段；δ珠蛋白链裂解片段均可作为δ珠蛋白链的标志肽段；γ珠蛋白链裂解片段均可作为γ珠蛋白链的标志肽段；ε珠蛋白链裂解片段均可作为ε珠蛋白链的标志肽段。这些标志肽段均可用于诊断指标设计。
进一步，所述α珠蛋白链肽段标志物为α珠蛋白链特征肽段αT1～αT14中的任一种或多种，所述α珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：1-14；
或所述β珠蛋白链肽段标志物为β珠蛋白链特征肽段βT1～βT15中的任一种或多种，所述β珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：15-29；
或所述ζ珠蛋白链肽段标志物为ζ珠蛋白链特征肽段ζT1～ζT15中的任一种或多种，所述ζ珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：30-44；
或所述δ珠蛋白链肽段标志物为δ珠蛋白链特征肽段δT1～δT16中的任一种或多种，所述δ珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：45-60；
或所述γ珠蛋白链肽段标志物为γ珠蛋白链特征肽段γ-T1～γ-T14、γA-T15、γ-T16中的任一种或多种，所述γ珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：61-76；
或所述ε珠蛋白链肽段标志物为ε珠蛋白链特征肽段εT1～εT16中的任一种或多种，所述ε珠蛋白链特征肽段序列为SEQ ID NO：77-92。
以上特征肽段均由胰蛋白酶裂解各型珠蛋白链而产生。
进一步，所述a地中海贫血标志物组合物有3种，分别为ζ珠蛋白链和α珠蛋白链，ζ珠蛋白链和γ珠蛋白链，ζ珠蛋白链和β珠蛋白链；
所述β地中海贫血标志物组合物有5种，分别为α珠蛋白链和γ珠蛋白链，γ珠蛋白链和β珠蛋白链，ε珠蛋白链和β珠蛋白链，δ珠蛋白链和α珠蛋白链，δ珠蛋白链和β珠蛋白链；
所述异常血红蛋白病HbC的标志物组合物有3种，分别为βCT1珠蛋白链特征肽段和α珠蛋白链，βCT1 珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链，βCT1珠蛋白链特征肽段和γ珠蛋白链；
所述异常血红蛋白病HbS的标志物组合物有3种，分别为βST1珠蛋白链特征肽段和α珠蛋白链，βST1 珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链，βST1珠蛋白链特征肽段和γ珠蛋白链；
所述异常血红蛋白病HbE标志物组合物有3种，分别为βET3珠蛋白链特征肽段和α珠蛋白链，βET3 珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链，βET3珠蛋白链特征肽段和γ珠蛋白链。
进一步，所述αCS标志物组合物有3种，分别为αCST14珠蛋白链特征肽段和α珠蛋白链，αCST14珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链，αCST14珠蛋白链特征肽段和γ珠蛋白链。
进一步，所述a地中海贫血的标志物组合物ζ珠蛋白链和α珠蛋白链、ζ珠蛋白链和β珠蛋白链来源于0～2个月a地中海贫血患者、2～12个月a地中海贫血患者和/或一岁以上a地中海贫血患者的离体样本；所述a地中海贫血的标志物组合物ζ珠蛋白链和γ珠蛋白链来源于0～2个月新生儿a地中海贫血患者的离体样本；
所述β地中海贫血的标志物组合物α珠蛋白链和γ珠蛋白链、γ珠蛋白链和β珠蛋白链来源于0～2个月β地中海贫血患者、2～12个月的β地中海贫血患者和/或一岁以上β地中海贫血患者的离体样本；所述β地中海贫血的标志物组合物ε珠蛋白链和β珠蛋白链来源于出生0～2个月的β地中海贫血患者的离体样本；所述β地中海贫血的标志物组合物δ珠蛋白链和α珠蛋白链、δ珠蛋白链和β珠蛋白链来源于2～12个月的β地中海贫血患者和/或一岁以上β地中海贫血患者的离体样本；
所述异常血红蛋白病HbC的标志物组合物βCT1珠蛋白链特征肽段和α珠蛋白链、βCT1珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链来源于0～2个月异常血红蛋白病HbC患者、2～12个月的异常血红蛋白病HbC患者和 /或一岁以上异常血红蛋白病HbC患者的离体样本；所述异常血红蛋白病HbC的标志物组合物βCT1珠蛋白链特征肽段和γ珠蛋白链来源于0～2个月新生儿异常血红蛋白病HbC患者的离体样本；
所述异常血红蛋白病HbS的标志物组合物βST1珠蛋白链特征肽段和α珠蛋白链、βST1珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链来源于0～2个月异常血红蛋白病HbS患者、2～12个月的异常血红蛋白病HbS患者和/ 或一岁以上异常血红蛋白病HbS患者的离体样本；所述异常血红蛋白病HbS的标志物组合物βST1珠蛋白链特征肽段和γ珠蛋白链来源于0～2个月新生儿异常血红蛋白病HbS患者的离体样本；
所述异常血红蛋白病HbE的标志物组合物βET3珠蛋白链特征肽段和α珠蛋白链、βET3珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链来源于0～2个月异常血红蛋白病HbE患者、2～12个月的异常血红蛋白病HbE患者和 /或一岁以上异常血红蛋白病HbE患者的离体样本；所述异常血红蛋白病HbE的标志物组合物βET3珠蛋白链特征肽段和γ珠蛋白链来源于0～2个月新生儿异常血红蛋白病HbE患者的离体样本；
进一步，所述αCS标志物组合物αCST14珠蛋白链特征肽段和α珠蛋白链、αCST14珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链来源于0～2个月αCS患者、2～12个月的αCS患者和/或一岁以上αCS患者的离体样本；所述αCS标志物组合物αCST14珠蛋白链特征肽段和γ珠蛋白链来源于0～2个月新生儿αCS患者的离体样本。
本发明的目的之二在于提供一种用于诊断所述标志物组合物的试剂，利用该试剂可筛选出血红蛋白样品中各型珠蛋白链的肽段标志物。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
用于筛查所述标志物组合物的试剂，所述试剂包括红细胞血红蛋白萃取液、蛋白变性剂、蛋白酶解液、复溶液、各型珠蛋白特征肽段的同位素内标物混合液和各型珠蛋白特征肽段的标准品；所述红细胞血红蛋白萃取液为甲醇和水的混合溶液，所述蛋白变性剂为乙腈和甲酸的混合溶液，所述蛋白酶解液为含有 TPCK-Treated胰蛋白酶冻干粉的碳酸氢铵溶液，所述复溶液为含有甲酸的乙腈水溶液。
进一步，所述胰蛋白酶还可以是羧肽酶、纤溶酶、凝血酶、糜蛋白酶和/或木瓜蛋白酶。
内标液为含各型珠蛋白特征肽段的同位素内标物混合液，浓度可根据需要配置，标准浓度已知，用去离子水溶解，本发明所述方案中a、β内标浓度为500ppb，ζ、δ、γ、ε内标浓度为50ppb；标准溶液为含各型珠蛋白特征肽段的高浓度标准品。
进一步，所述红细胞血红蛋白萃取液中甲醇和水按照体积比1:1配置；所述蛋白变性剂由乙腈和甲酸(浓度为12g/L)按体积比5:1配置；所述蛋白酶解液是由TPCK-Treated胰蛋白酶冻干粉溶于1mol/L的碳酸氢铵溶液，制成浓度为5g/L的裂解液；所述复溶液中乙腈和水的体积比为2：1。
进一步，所述试剂还包括阴阳性对照物，以及正常标品、地中海贫血杂合子标品和地中海贫血纯合子标品。
本发明的目的之三在于提供一种所述标志物组合物和/或所述试剂在诊断血红蛋白病中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
所述标志物和/或所述试剂在制备用于早期识别不同类型的红蛋白病的试剂盒中的应用。
进一步，所述标志物和/或所述试剂在制备用于诊断0～2个月血红蛋白病患者、2～12个月血红蛋白病患者和/或一岁以上血红蛋白病患者疾病类型的试剂盒中的应用。
进一步，所述ζ珠蛋白链和所述ε珠蛋白链主要在胚胎期表达，健康儿童出生后表达较少；所述γ珠蛋白链在胚胎发育后期显著表达，出生后逐渐减少，直到被所述β珠蛋白链替代；所述a珠蛋白链和所述β珠蛋白链的表达贯穿新生儿、儿童及成人发育的整个阶段；所述δ珠蛋白链主要在儿童及成人阶段表达。
本发明的目的之四在于提供一种血红蛋白中各型珠蛋白链特征片段的分离方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
血红蛋白中各型珠蛋白链特征片段的分离方法，所述各型珠蛋白链包括a珠蛋白链、β珠蛋白链、ζ珠蛋白链、δ珠蛋白链、γ珠蛋白链和/或ε珠蛋白链；所述血红蛋白来源于血红蛋白病患者；所述分离方法为：采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，将所述血红蛋白中各型珠蛋白链特征片段进行分离；所述流动相A为含有甲酸的去离子水，流动相B含有甲酸的乙腈溶液；所述梯度洗脱程序为：
| 时间(min) | 流速(ml/min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.000 | RUN | - | - |
| 0.000 | 0.420 | 93.0 | 7.0 |
| 0.300 | 0.420 | 90.0 | 10.0 |
| 1.200 | 0.420 | 70.0 | 30.0 |
| 1.500 | 0.420 | 6.0 | 94.0 |
| 2.500 | 0.420 | 5.0 | 95.0 |
| 2.500 | 0.420 | 7.0 | 7.0 |
| 3.500 | Stop Run | - | - |
进一步，所述方法具体包括以下步骤：
S1：取所述血红蛋白病患者的血液样本进行前处理，萃取裂解得到含有所述各型珠蛋白链裂解片段的待测样本；
S2：配置标准溶液；
S3：将S2所得标准溶液、S1所得待测样本进样，进行梯度洗脱，分离得到所述各型珠蛋白链的特征肽段。
进一步，自动进样器参数为：
进一步，所述血液样本为外周血、末梢血、足跟血中的任一种或多种。
本发明的目的之五在于提供一种定性、定量检测血红蛋白中各型珠蛋白链特征片段的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
定性、定量检测血红蛋白中各型珠蛋白链特征片段的方法，所述方法具体包括以下步骤：
S1：采用上述分离方法分离出血红蛋白中所述各型珠蛋白链的特征肽段；
S2：在电喷雾电离阳离子检测模式下，采用SRM/PRM/MRM模式采集数据，得到所述各型珠蛋白链特征肽段的液相色谱-质谱鉴定图谱，碎片离子组成；
S3：将S2所得数据进行转换，得到特异离子对与内标的比值数据；
S4：将S3获取的特异离子对和内标的峰面积比值数据，与特异离子对的标准浓度进行线性分析，制备标准曲线，得到所述各型珠蛋白链特征肽段的含量。
进一步，需要根据选定的肽段标志物，设立质谱仪SRM/PRM/MRM模式检测参数，并根据肽段及其同位素内标肽段质荷比的不同，分别设置其相应的采样窗口及检测电压等参数。
进一步，部分珠蛋白链特征肽段质谱PRM检测参数为：
进一步，异常血红蛋白病特征肽段质谱PRM检测参数为：
进一步，定性、定量检测时，所述各型珠蛋白链标志肽段不同的碎片离子对组合均可用于样本检测。
进一步，所述质谱仪离子源参数为：鞘气流速为40psi，辅助气流速为18arb，喷雾电流为1.7uA，喷雾电压为3.0KV，离子传输管温度为320℃，S-lens视频水平为50，辅助气加热温度为400℃。
进一步，根据所述方法得出各型珠蛋白链标志肽段的含量计算公式如下：
a珠蛋白链标志肽段αT3：Y1＝3.608e-4X1-3.508e-2；
或β珠蛋白链标志肽段βT2：Y2＝6.513e-4X2+6.518e-3；
或ζ珠蛋白链标志肽段ζT8：Y3＝1.165e-2X3+3.033e-2；
或δ珠蛋白链标志肽段δT2：Y4＝1.53e-2X4+1.41e-2；
或γ珠蛋白链标志肽段γT10：Y5＝3.245e-2X5-1.009e-1；
上述公式中Y表示各型珠蛋白链标志肽段特异离子对与内标的峰面积比值，X表示对应珠蛋白链标志肽段特异离子对的标准浓度。
本发明的目的之六在于提供一种测定血红蛋白中各型珠蛋白链比率的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种测定血红蛋白中各型珠蛋白链比率的方法，所述方法具体包括以下步骤：
S1：分离：采用上述分离方法分离出血红蛋白中所述各型珠蛋白链的特征肽段；
S2：定性、定量检测：采用上述定量检测方法测得所述各型珠蛋白链特征肽段的含量；
S3：比率计算：利用S2得到的所述各型珠蛋白链特征肽段的浓度值，以及所述各型珠蛋白链特征肽段对应的同位素内标肽段的已知标准浓度，采用内标法或外标法计算各型珠蛋白链的比率。
进一步，所述各型珠蛋白链的比率由相应珠蛋白链特征肽段的比率表示；所述特征肽段的浓度由其峰面积积分表示。
进一步，所述各型珠蛋白链特征肽段的比率计算方式分为两种：
(1)外标法：通过标准曲线计算，计算通式为：M/N＝CM/CN＝(AM*CMTIS+BM)/(AN*CNTIS+BN)，其中M、 N表示各2种不同珠蛋白链的特征肽段，CMTIS、CNTIS分别为M、N标志肽段对应同位素内标肽段的已知标准浓度；AM、BM为标曲线相关方程的常数部分。
(2)内标法：直接使用所述各型珠蛋白链特征肽段稳定同位素内标校正后进行计算，计算通式为：其中，R为常数，R＝CMTIS/CNTIS，CMTIS、CNTIS分别为M、N标志肽段对应同位素内标肽段的已知标准浓度，MT、NT分别代表M、N珠蛋白链标志肽段的峰面积积分，MTIS、NTIS 代表M、N珠蛋白链标志肽段的同位素内标的对应峰面积积分。
进一步，根据正常人及不同类型血红蛋白病标志物比率的参考值区间建立数据库，所述正常人及不同类型地中海贫血标志物比率的参考值区间为2.5％～97.5％。
更进一步，正常新生儿的ζ/α参考区间为0.04％～0.89％，正常婴幼儿及成人的ζ/α参考区间为 0.00％～0.03％，α+地中海贫血携带者及患者的ζ/α参考区间为0.00％～1.10％，α0地中海贫血携带者及患者的ζ/α参考区间为0.03％～1.70％，HbH携带者及患者的ζ/α参考区间为0.08％～2.20％，正常新生儿的δ/β参考区间为0.5％～1.2％，正常婴幼儿及成人的δ/β参考区间为1.20％～2.11％，β+地中海贫血的δ/β参考区间为 1.00％～6.86％，β0地中海贫血的δ/β参考区间为2.25％～9.78％，正常新生儿的γ/β参考区间为0.45～1.89，正常婴幼儿及成人的γ/β参考区间为0.00％～0.30％，HbE的γ/β参考区间为0.25％～0.95％，HbE/β-地中海贫血的γ/β参考区间为0.22％～0.66％，以此建立数据库。
参考区间可能因不同实验室、不同实验人员、不同仪器、不同试剂批次、不同内标浓度而有差异，实验室可据此建立自己的参考值区间。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明筛查出的患者，至少可以从以下几个方面受益：对于将发展为重型地中海贫血的患儿，及早预防并发症和输血治疗可能带来的感染，可以改善患儿的生存环境；对于轻型地中海贫血的患儿，指导其避免长时间接触低压、缺氧的环境，可避免贫血症状的出现；孕前、产前亲代地中海贫血携带者的检出，有助于遗传咨询及生育决策，减少或避免重型地中海贫血患儿的出生，达到优生优育的目的。本发明具有良好的应用前景和巨大的社会效益；
(2)本发明新报道了ζ、δ、γ、ε等珠蛋白链与a、β地中海贫血及异常血红蛋白病的关系，并提供了各型珠蛋白链的筛查试剂，通过筛查血红蛋白病患者血红蛋白中的各型珠蛋白链，不仅可以早期识别不同类型的红蛋白病，还可以诊断出各年龄段血红蛋白病患者疾病类型，对于血红蛋白病的诊断具有非常重要的意义。
附图说明
图1为各珠蛋白链肽段标志物液相色谱-质谱检测总离子流图谱；
图2为αT3特征肽段质谱鉴定；
图3为βT2特征肽段质谱鉴定；
图4为ζT8特征肽段质谱鉴定；
图5为δT2特征肽段质谱鉴定；
图6为γT10特征肽段质谱鉴定；
图7为标准品肽段标志物内标峰面积积分图示例；
图8为标准品肽段标志物峰面积积分图示例；
图9为基于标准品肽段标志物峰面积积分与内标峰面积积分的比值，同标准品肽段标志物已知浓度之间的相关性计算得到的标准曲线回归方程式；
图10为a珠蛋白链标志肽段αT3的标准曲线法定量；
图11为β珠蛋白链标志肽段βT2的标准曲线法定量；
图12为ζ珠蛋白链标志肽段ζT8的标准曲线法定量；
图13为δ珠蛋白链标志肽段δT2的标准曲线法定量；
图14为γ珠蛋白链标志肽段γT10的标准曲线法定量；
图15为液相色谱-质谱筛选血红蛋白α珠蛋白部分链特征肽段；
图16为液相色谱-质谱筛选血红蛋白β珠蛋白部分链特征肽段。
具体实施方式
下面将结合具体的实施例对本发明的技术方案进行更进一步地清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。
以下为实施例部分涉及的仪器、试剂和耗材：
1.仪器
液相色谱-质谱仪(LC-MS)、3.2mm打孔钳、离心机、计算机、各量程单通道微量移液器及多通道微量移液器、色谱柱(Hypersil GOLDTMC18 UHPLC Columns ThermoScientificTM)；
2.耗材
普通96孔反应板、具有0.22μm孔径过滤功能的96孔酶标板、移液器枪头、96孔板专用铝箔覆膜、 96孔板封口膜、识别条形码；
3.试剂
甲醇、去离子水、乙腈、甲酸、TPCK-Treated胰蛋白酶冻干粉、碳酸氢铵溶液；所有液体试剂均为 HPLC或质谱纯级；
内标液：含各型珠蛋白特征肽段的同位素内标物混合液，标准浓度已知，其中a、β内标浓度为500ppb, ζ、δ、γ、ε内标浓度为50ppb；
标准溶液：含各型珠蛋白特征肽段的高浓度标准品，可配置成至少5个不同的浓度水平，用于标准曲线的制作。
质控品：阴阳性对照物，正常标品、地中海贫血杂合子标品、地中海贫血纯合子标品。
实施例1.检测方法的建立
1.配置试剂
试剂A：红细胞血红蛋白萃取液，由甲醇和水按照体积比1:1配置；
试剂B：蛋白变性剂，由乙腈和甲酸(溶度为12g/L)按体积比5:1配置；
试剂C：蛋白酶解液：TPCK-Treated胰蛋白酶冻干粉溶于1mol/L的碳酸氢铵溶液，制成浓度为5g/L 的裂解液；
试剂D：复溶液，用于样品复溶，为含有甲酸的乙腈水溶液，其中乙腈和水的体积比为2：1；
试剂E：内标液，含各型珠蛋白特征肽段的同位素内标物混合液，标准浓度已知，用去离子水溶解，其中a、β内标浓度为500ppb，ζ、δ、γ、ε内标浓度为50ppb；
试剂F：标准溶液，含各型珠蛋白特征肽段的高浓度标准品。
2.标本采集
取末梢血或静脉血标本一滴，约50μl，滴注于Whatman 滤纸片，自然扩散并晾干，制成干血滤纸片标本，封口膜封存，4℃长期保存、待测。本实施例采用的是干血滤纸片标本进行分析，也可直接取全血标本进行分析。
3.标本前处理及血红蛋白萃取
(1)将干血滤纸片标本用标准打孔器打出直径3.2mm圆形滤纸血片(或相当于3.2μl全血的标本)于96 孔过滤板板中，加入试剂A 200μl，室温低速振摇15分钟，充分溶解血液。
(2)取溶血液20μl，转移至新的96孔板，加入试剂A50μl、试剂B 20μl，快速振摇1分钟，室温静止5分钟。
(3)在上述混合液中加入试剂C10μl，低速振摇混匀，封口膜封存，置37℃孵箱中孵育1小时。
(4)取96孔过滤板，依次加入上述消化液10μl、试剂D 80μl、试剂E10μl，轻微震荡复溶，室温孵育 2分钟，瞬时离心，留取下板样品，待测。
(5)用试剂F配置至少5种不同浓度的标准溶液，前处理方法同(1)～(4)，用于标准曲线的制作。
4.各型珠蛋白(a、β、ζ、δ、γ、ε)特征性肽段质谱测定
(1)各型珠蛋白(a、β、ζ、δ、γ、ε)特征性肽段如表1～表6所示：
表1.α珠蛋白链胰酶消化后的肽段标志物
表2.β珠蛋白链胰酶消化后的肽段标志物
/>
表3.ζ珠蛋白链胰酶消化后的肽段标志物
| 编号 | 位置 | 正常序列 | 单电荷m/z | 双电荷m/z |
| ζT1 | 1-5 | SLTK | 448.24 | 224.64 |
| ζT2 | 6-8 | TER | 405.21 | 203.11 |
| ζT3 | 9-17 | TIIVSMWAK | 1048.59 | 524.80 |
| ζT4 | 18-32 | ISTQADTIGTETLER | 1634.82 | 817.92 |
| ζT5 | 33-41 | LFLSHPQTK | 1070.60 | 535.80 |
| ζT6 | 42-57 | TYFPHFDLHPGSAQLR | 1885.93 | 943.47 |
| ζT7 | 58-62 | AHGSK | 499.26 | 250.13 |
| ζT8 | 63-72 | VVAAVGDAVK | 928.55 | 464.78 |
| ζT9 | 73-83 | SIDDIGGALSK | 1075.56 | 538.29 |
| ζT10 | 84-93 | LSELHAYILR | 1214.69 | 607.85 |
| ζT11 | 94-100 | VDPVNFK | 818.44 | 409.72 |
| ζT12 | 101-113 | LLSHCLLVTLAAR | 1408.82 | 704.91 |
| ζT13 | 114-128 | FPADFTAEAHAAWDK | 1676.77 | 838.89 |
| ζT14 | 129-140 | FLSVVSSVLTEK | 1308.74 | 654.87 |
| ζT15 | 141-142 | YR | 338.18 | 169.59 |
表4.δ珠蛋白链胰酶消化后的肽段标志物
/>
表5.γ-A珠蛋白链胰酶消化后的肽段标志物
| 编号 | 位置 | 正常序列 | 单电荷m/z | 双电荷m/z |
| γ-T1 | 1-8 | GHFTEEDK | 962.43 | 481.71 |
| γ-T2 | 9-17 | ATITSLWGK | 976.54 | 488.77 |
| γ-T3 | 18-30 | VNVEDAGGETLGR | 1316.64 | 658.82 |
| γ-T4 | 31-40 | LLVVYPWTQR | 1274.72 | 637.86 |
| γ-T5 | 41-59 | FFDSFGNLSSASAIMGNPK | 1876.85 | 995.47 |
| γ-T6 | 60-61 | VK | 246.18 | 123.59 |
| γ-T7 | 62-65 | AHGK | 412.23 | 206.61 |
| γ-T8 | 66-66 | K | 147.11 | 74.05 |
| γ-T9 | 67-76 | VLTSLGDATK | 1004.56 | 502.78 |
| γ-T10 | 77-82 | HLDDLK | 740.39 | 370.70 |
| γ-T11 | 83-95 | GTFAQLSELHCDK | 1448.68 | 724.84 |
| γ-T12 | 96-104 | LHVDPENFK | 1098.55 | 549.78 |
| γ-T13 | 105-120 | LLGNVLVTVLAIHFGK | 1694.03 | 847.52 |
| γ-T14 | 121-132 | EFTPEVQASWQK | 1449.70 | 725.35 |
| γA-T15 | 133-144 | MVTAVASALSSR | 1192.63 | 596.82 |
| γ-T16 | 145-146 | YH | 319.14 | 160.07 |
表6.ε珠蛋白链胰酶消化后的肽段标志物
/>
(2)液相色谱-质谱联用仪检测参数设置：
①液相条件
采用Hypersil GOLDTMC18 UHPLC Columns Thermo ScientificTM色谱柱进行样品分离，采用流动相A 和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为含0.2％甲酸的去离子水；流动相B为含0.2％甲酸的乙腈溶液。自动进样器参数如表7所示，梯度进样程序如表8所示：
表7.自动进样器参数
| 参数 | 参数值 | 单位 |
| Injection Volume | 1 | ul |
| Prime Syringe | 3 | cycles |
| Draw Speed | 5 | ul/sec |
| Draw delay | 3 | sec |
| Washing Speed | 20 | ul/sec |
| Washing Needle Extrenally | 100 | ul |
| Rinse Mode | Before and after | - |
| Wash Buffer Loop | 300 | ul |
| Temperature Control | 10 | ℃ |
表8.梯度进样程序
| 时间(min) | 流速(ml/min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0.000 | RUN | - | - |
| 0.000 | 0.420 | 93.0％ | 7.0 |
| 0.300 | 0.420 | 90.0％ | 10.0 |
| 1.200 | 0.420 | 70.0％ | 30.0 |
| 1.500 | 0.420 | 6.0％ | 94.0 |
| 2.500 | 0.420 | 5.0％ | 95.0 |
| 2.500 | 0.420 | 7.0％ | 7.0 |
| 3.500 | Stop Run | - | - |
②质谱条件：
在电喷雾电离(ESI)阳离子(+)检测模式下，采用平行反应监测(PRM)、多反应检测模式(MRM) 或SRM的质谱模式采集数据，离子源参数如表9所示：
表9.质谱仪离子源参数
(3)珠蛋白链肽段标志物质谱仪SRM/PRM/MRM模式检测参数
根据选定的肽段标志物，设立质谱仪SRM/PRM/MRM模式检测参数，并根据肽段及其同位素内标肽段质荷比的不同，分别设置其相应的采样窗口及检测电压等参数，部分珠蛋白链特征肽段质谱PRM检测参数如表10所示，异常血红蛋白病特征肽段质谱PRM检测参数如表11所示。
表10.部分珠蛋白链特征肽段质谱PRM检测参数
表11.异常血红蛋白病特征肽段质谱PRM检测参数
(4)各珠蛋白链肽段标志物液相色谱-质谱鉴定
标本萃取液经胰酶消化，a、β、ζ、δ、γ、ε珠蛋白链水解产物产生不同质荷比的多肽片段。
如表1～表6所示，原理上，各型珠蛋白链裂解片段均可作为血红蛋白分析的标志物：α珠蛋白链裂解片段均可作为α珠蛋白链的标志肽段；β珠蛋白链裂解片段均可作为β珠蛋白链的标志肽段；ζ珠蛋白链裂解片段均可作为ζ珠蛋白链的标志肽段；δ珠蛋白链裂解片段均可作为δ珠蛋白链的标志肽段；γ珠蛋白链裂解片段均可作为γ珠蛋白链的标志肽段；ε珠蛋白链裂解片段均可作为ε珠蛋白链的标志肽段。这些标志肽段均可用于诊断指标设计。
图1为血红蛋白各珠蛋白链肽段标志物液相色谱-质谱检测总离子流图谱；图2～图6分别为αT3、βT2、ζT8、δT2和γT10特征肽段的质谱鉴定。
各型珠蛋白链胰蛋白酶裂解后特征肽段质谱鉴定碎片离子组成如表12～17所示：
表12.αT3特征肽段质谱鉴定碎片离子组成
| 编号 | 单电荷m/z | 序列 | 序列 | 单电荷m/z | 编号 |
| B1 | 72.045 | A | AWGK | 461.251 | Y4 |
| B2 | 143.082 | AA | WGK | 390.214 | Y3 |
| B3 | 329.161 | AAW | GK | 204.135 | Y2 |
| B4 | 386.188 | AAWG | K | 147.113 | Y1 |
表13.βT2特征肽段质谱鉴定碎片离子组成
| 编号 | 单电荷m/z | 序列 | 序列 | 单电荷m/z | 编号 |
| B1 | 88.040 | S | AVTALWGK | 845.489 | Y8 |
| B2 | 159.077 | SA | VTALWGK | 774.451 | Y7 |
| B3 | 258.145 | SAV | TALWGK | 675.383 | Y6 |
| B4 | 359.193 | SAVT | ALWGK | 574.335 | Y5 |
| B5 | 430.230 | SAVTA | LWGK | 503.298 | Y4 |
| B6 | 543.314 | SAVTAL | WGK | 390.214 | Y3 |
| B7 | 729.394 | SAVTALW | GK | 204.135 | Y2 |
| B8 | 786.415 | SAVTALWG | K | 147.113 | Y1 |
表14.ζT8特征肽段质谱鉴定碎片离子组成
| 编号 | 单电荷m/z | 序列 | 序列 | 单电荷m/z | 编号 |
| B1 | 100.076 | V | VAAVGDAVK | 829.478 | Y9 |
| B2 | 199.145 | VV | AAVGDAVK | 730.410 | Y8 |
| B3 | 270.182 | VVA | AVGDAVK | 659.373 | Y7 |
| B4 | 341.219 | VVAA | VGDAVK | 588.336 | Y6 |
| B5 | 440.287 | VVAAV | GDAVK | 489.267 | Y5 |
| B6 | 497.309 | VVAAVG | DAVK | 432.246 | Y4 |
| B7 | 612.336 | VVAAVGD | AVK | 317.219 | Y3 |
| B8 | 683.373 | VVAAVGDA | VK | 246.182 | Y2 |
| B9 | 782.441 | VVAAVGDAV | K | 147.113 | Y1 |
表15.δT2特征肽段质谱鉴定碎片离子组成
| 编号 | 单电荷m/z | 序列 | 序列 | 单电荷m/z | 编号 |
| B1 | 102.056 | T | AVNALWGK | 858.484 | Y8 |
| B2 | 173.093 | TA | VNALWGK | 787.447 | Y7 |
| B3 | 272.161 | TAV | NALWGK | 688.378 | Y6 |
| B4 | 386.204 | TAVN | ALWGK | 574.335 | Y5 |
| B5 | 457.241 | TAVNA | LWGK | 503.298 | Y4 |
| B6 | 570.325 | TAVNAL | WGK | 390.214 | Y3 |
| B7 | 756.404 | TAVNALW | GK | 204.135 | Y2 |
| B8 | 813.426 | TAVNALWG | K | 147.113 | Y1 |
表16.γT10特征肽段质谱鉴定碎片离子组成
表17.ε特征肽段质谱鉴定碎片离子组成
| 编号 | 单电荷m/z | 序列 | 序列 | 单电荷m/z | 编号 |
| B1 | 114.0919 | L | HVDPENFK | 985.4743 | Y8 |
| B2 | 251.1508 | LH | VDPENFK | 848.4154 | Y7 |
| B3 | 350.2192 | LHV | DPENFK | 749.3470 | Y6 |
| B4 | 465.2462 | LHVD | PENFK | 634.3201 | Y5 |
| B5 | 562.2989 | LHVDP | ENFK | 537.2673 | Y4 |
| B6 | 691.3415 | LHVDPE | NFK | 408.2247 | Y3 |
| B7 | 805.3844 | LHVDPEN | FK | 294.1818 | Y2 |
| B8 | 952.4529 | LHVDPENF | K | 147.1134 | Y1 |
(5)标本检测
利用建立好的检测方案，通过高效液相色谱仪自动快速进样，再通过质谱仪进行快速检测，实现标本的高通量进样检测，每个标本检测时间小于5分钟，一次实验可同批检测至少192个样品。
图15和图16分别为液相色谱-质谱筛选出的血红蛋白α珠蛋白链特征肽段和β珠蛋白链特征肽段。
5.数据分析
(1)数据转化：
质谱仪检测生成的原始数据是仪器对不同浓度多肽片段的响应强度(Intensity)。利用Trace Finder 4.0 软件，以峰面积积分法对特征性肽段及其同位素内标进行自动积分，计算每个多肽片段特异离子对的峰面积分值，用同位素内标峰面积分值进行矫正，获取特异离子对同内标的比值，图7表示标准品肽段标志物内标峰面积积分图，图8表示标准品肽段标志物峰面积积分图，图9表示基于标准品肽段标志物峰面积积分与内标峰面积积分的比值，同标准品肽段标志物已知浓度的相关性计算得到的标准曲线回归方程式，该标准曲线回归方程用于样品中相应肽段标志物的定量分析。
(2)标准曲线制备：
配制7个含有不同浓度a、β、ζ、δ、γ、ε标志肽段特异离子对的标准品，以上述方法检测获取的特异离子对与内标的峰面积比值数据，以及特异离子对的标准浓度做线性分析，制备标准曲线并计算得到相关方程，用于待测样本相关待测物的分析，如图9所示。
如图10所示，a珠蛋白链标志肽段αT3通过标准曲线法进行定量，其回归方程公式为：
Y1＝3.608e-4X1-3.508e-2，R^2＝0.9992；
如图11所示，β珠蛋白链标志肽段βT2通过标准曲线法进行定量，其回归方程公式为：
Y2＝6.513e-4X2+6.518e-3，R^2＝0.9987；
如图12所示，ζ珠蛋白链标志肽段ζT8通过标准曲线法进行定量，其回归方程公式为：
Y3＝1.165e-2X3+3.033e-2，R^2＝0.9992；
如图13所示，δ珠蛋白链标志肽段δT2通过标准曲线法进行定量，其回归方程公式为：
Y4＝1.53e-2X4+1.41e-2，R^2＝0.9999；
如图14所示，γ珠蛋白链标志肽段γT10通过标准曲线法进行定量，其回归方程公式为：
Y5＝3.245e-2X5-1.009e-1，R^2＝0.9995。
图10～图14中，各标准曲线的纵坐标(Y)表示特异离子对与内标的峰面积比值，横坐标(X)表示特异离子对的标准浓度(ppb)。
实施例2.各型地中海贫血的鉴别及参照值区间设定
(1)各型地中海贫血的鉴别
a、β、ζ、δ、γ、ε珠蛋白链在人体内的表达具有时间特征，其ζ、ε主要在胚胎期表达，健康儿童出生后表达较少；γ在胚胎发育后期显著表达，出生后逐渐减少，直到被β替代，a、β的表达贯穿新生儿、儿童及成人发育的整个阶段；δ主要在儿童及成人阶段表达。不同类型地中海贫血累及的珠蛋白链不同，通过定量分析受累的珠蛋白链，计算其与其它正常表达珠蛋白链的比率，可实现各型地中海贫血的鉴别。各型地中海贫血的鉴别诊断指标设计如表18所示。
表18.各型地中海贫血的鉴别诊断指标设计
各型珠蛋白链的比率计算：
原理上所有特征肽段均可用于珠蛋白链比率的计算，方案中所选择为质谱仪响应值高，反应较灵敏的标志肽段，作为代表进行技术方案的设计；每个标志肽段选取一对母离子/子离子组合，并用同位素内标作内部控制。
①通过标准曲线计算：比率计算时首选通过标准曲线计算得到的各特征肽段的浓度值。内标液的配制及有效期需受控，以确保批间误差在要求的范围内，以γ、β珠蛋白链为例，其比率计算公式如下：
γ/β＝CΓT/CβT2＝(Aγ*CγTIS+Bγ)/(Aβ*CβTIS+Bβ)
注：CγTIS、CβTIS分别为γ、β标志肽段对应同位素内标肽段的已知标准浓度；A、B为标曲线相关方程的常数部分。
②通过同位素内标计算：直接使用每种标志肽段稳定同位素内标进行校正后计算各型珠蛋白链的比率，同样以γ、β珠蛋白链为例，其比率计算公式如下：
(R为常数)
注：R＝CγTIS/CβTIS，CγTIS、CβTIS分别为γ、β标志肽段对应同位素内标肽段的已知标准浓度。
使用同位标记内标和标准曲线法可提高检测的稳定性，降低系统误差和随机误差发生的概率。
(2)参照值区间设定
按照本发明上述技术方案，分析600例正常人对照(年龄0天至40岁)及228例地中海贫血及异常血红蛋白病患者，建立参考值区间(双侧95th)如表19～表21所示。参考区间可能因不同实验室、不同实验人员、不同仪器、不同试剂批次、不同内标浓度而有差异，实验室可据此建立自己的参考值区间。
表19.正常人、α地中海贫血携带者及患者ζ/α比值参考区间
/>
表20.正常人、β地中海贫血携带者、患者γ/β、δ/β比值参考区间
表21.正常人、异常血红蛋白病携带者、患者标志肽段/珠蛋白链浓度参考区间
(3)方法评价
1)方法的灵敏度：
本发明所采用的方法对新生儿α地中海贫血静止型(α+)、α地中海贫血中间型(α0)、α地中海贫血 HbH各基因型的平均检出率分别为73％、95％、98％；对儿童及成人α地中海贫血相应类型的检出率均高于新生儿；由于未收集到α地中海贫血重型Hb Bart’s，该型的理论检出水平为100％。
本发明所采用的方法对新生儿β地中海贫血杂合子(β+)各基因型的平均检出率约95％；对β地中海贫血纯合子(β0)各基因型及β突变复合杂合子(β0)的平均检出率大于98％；对儿童及成人β地中海贫血相应类型的检出率高于新生儿。
本发明所采用的方法对HbE及HbE/β复合型地中海贫血的检出率大于95％；特征片段定性检测对HbE 镰刀状细胞贫血的检出率为100％。
2)方法的特异度：
本发明所采用的方法对α地中海贫血中间型(α0)、α地中海贫血HbH型、β地中海贫血杂合子(β+)、β地中海贫血纯合子(β0)及β突变复合杂合子(β0)以及各型异常血红蛋白病的诊断特异度大于90％。
3)方法的稳定性：
分别选取一例正常标本、一例β+地贫(CD41-42杂合子)、一例β0地贫(CD17纯合子)、一例-SEA 地贫、一例HbH地贫(-SEA/-α3.7)、一例HbE，做批次内及批次间重复试验，计算均值及标准差。结果如表22～表25所示，本筛查方法的精密度和重复性较高。
表22.所述技术方案批次内、批次间重复性及精密度分析
表23.所述技术方案批次内、批次间重复性及精密度分析
/>
表24.所述技术方案批次内、批次间重复性及精密度分析
表25.所述技术方案批次内、批次间重复性及精密度分析
本发明通过定量分析a、β、ζ、δ、γ、ε珠蛋白链及其比率，可早期识别不同类型的地中海贫血及异常血红蛋白病，能够对α重度、中度及轻度地中海贫血进行有效识别。本发明所述筛查方法对α地中海贫血静止型(α+)检出率为73％，对α地中海贫血中间型(α0)、α地中海贫血HbH各基因型的检出率分别为95％、98％。本发明所描述方法对β地中海贫血杂合子(β+)各基因型的平均检出率约95％；对β地中海贫血纯合子(β0)各基因型及β突变复合杂合子(β0)的平均检出率大于98％；对HbE及HbE/β复合型地中海贫血的检出率大于90％；基于特征片段定性检测对HbE镰刀状细胞贫血的检出率为100％。本方法不仅具有较高的精密度和重复性，还具备较高的灵敏度和特异性。
本发明筛查出的患者，至少可以从以下几个方面受益：对于将发展为重型地中海贫血的患儿，及早预防并发症和输血治疗可能带来的感染，可以改善患儿的生存环境；对于轻型地中海贫血的患儿，指导其避免长时间接触低压、缺氧的环境，可避免贫血症状的出现；孕前、产前亲代地中海贫血携带者的检出，有助于遗传咨询及生育决策，减少或避免重型地中海贫血患儿的出生，达到优生优育的目的。
序列表
<110> 重庆医科大学附属儿童医院
<120> 血红蛋白病的标志物组合物及其筛查试剂与应用
<130> 2022.04.21
<141> 2022-05-11
<160> 92
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Val Leu Ser Pro Ala Asp Lys
1 5
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Thr Asn Val Lys
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ala Ala Trp Gly Lys
1 5
<210> 4
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Val Gly Ala His Ala Gly Glu Tyr Gly Ala Glu Ala Leu Glu Arg
1 5 10 15
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Phe Leu Ser Phe Pro Thr Thr Lys
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu Ser His Gly Ser Ala Gln Val Lys
1 5 10 15
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Gly His Gly Lys
1
<210> 8
<211> 1
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Lys
1
<210> 9
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Val Ala Asp Ala Leu Thr Asn Ala Val Ala His Val Asp Asp Met Pro
1 5 10 15
Asn Ala Leu Ser Ala Leu Ser Asp Leu His Ala His Lys
20 25
<210> 10
<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Leu Arg
1
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Val Asp Pro Val Asn Phe Lys
1 5
<210> 12
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala His Leu Pro Ala
1 5 10 15
Glu Phe Thr Pro Ala Val His Ala Ser Leu Asp Lys
20 25
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Phe Leu Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Thr Ser Lys
1 5 10
<210> 14
<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Tyr Arg
1
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp Gly Lys
1 5
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg
1 5 10
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Leu Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg
1 5 10
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu Ser Thr Pro Asp Ala Val Met Gly
1 5 10 15
Asn Pro Lys
<210> 20
<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Val Lys
1
<210> 21
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Ala His Gly Lys
1
<210> 22
<211> 1
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Lys
1
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp Asn Leu Lys
1 5 10 15
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Gly Thr Phe Ala Thr Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
1 5 10
<210> 25
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg
1 5
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Cys Val Leu Ala His His Phe Gly Lys
1 5 10 15
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Glu Phe Thr Pro Pro Val Gln Ala Ala Tyr Gln Lys
1 5 10
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys
1 5 10
<210> 29
<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Tyr His
1
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Ser Leu Thr Lys
1
<210> 31
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Thr Glu Arg
1
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Thr Ile Ile Val Ser Met Trp Ala Lys
1 5
<210> 33
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Ile Ser Thr Gln Ala Asp Thr Ile Gly Thr Glu Thr Leu Glu Arg
1 5 10 15
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Leu Phe Leu Ser His Pro Gln Thr Lys
1 5
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Thr Tyr Phe Pro His Phe Asp Leu His Pro Gly Ser Ala Gln Leu Arg
1 5 10 15
<210> 36
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Ala His Gly Ser Lys
1 5
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
Val Val Ala Ala Val Gly Asp Ala Val Lys
1 5 10
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Ser Ile Asp Asp Ile Gly Gly Ala Leu Ser Lys
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
Leu Ser Glu Leu His Ala Tyr Ile Leu Arg
1 5 10
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
Val Asp Pro Val Asn Phe Lys
1 5
<210> 41
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
Leu Leu Ser His Cys Leu Leu Val Thr Leu Ala Ala Arg
1 5 10
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Phe Pro Ala Asp Phe Thr Ala Glu Ala His Ala Ala Trp Asp Lys
1 5 10 15
<210> 43
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
Phe Leu Ser Val Val Ser Ser Val Leu Thr Glu Lys
1 5 10
<210> 44
<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
Tyr Arg
1
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
His Leu Thr Pro Glu Glu Lys
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Thr Ala Val Asn Ala Leu Trp Gly Lys
1 5
<210> 47
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
Val Asn Val Asp Ala Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly Arg
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
Leu Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg
1 5 10
<210> 49
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 49
Phe Phe Glu Ser Phe Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asp Ala Val Met Gly
1 5 10 15
Asn Pro Lys
<210> 50
<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Val Lys
1
<210> 51
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 51
Ala His Gly Lys
1
<210> 52
<211> 1
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52
Lys
1
<210> 53
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
Val Leu Gly Ala Phe Ser Asp Gly Leu Ala His Leu Asp Asn Leu Lys
1 5 10 15
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Gly Thr Phe Ser Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
1 5 10
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Arg
1 5
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 56
Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Cys Val Leu Ala Arg
1 5 10
<210> 57
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Asn Phe Gly Lys
1
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Glu Phe Thr Pro Gln Met Gln Ala Ala Tyr Gln Lys
1 5 10
<210> 59
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Val Val Ala Gly Val Ala Asn Ala Leu Ala His Lys
1 5 10
<210> 60
<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Tyr His
1
<210> 61
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Gly His Phe Thr Glu Glu Asp Lys
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Ala Thr Ile Thr Ser Leu Trp Gly Lys
1 5
<210> 63
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Val Asn Val Glu Asp Ala Gly Gly Glu Thr Leu Gly Arg
1 5 10
<210> 64
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Leu Leu Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg
1 5 10
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn Leu Ser Ser Ala Ser Ala Ile Met Gly
1 5 10 15
Asn Pro Lys
<210> 66
<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Val Lys
1
<210> 67
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Ala His Gly Lys
1
<210> 68
<211> 1
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Lys
1
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
Val Leu Thr Ser Leu Gly Asp Ala Thr Lys
1 5 10
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
His Leu Asp Asp Leu Lys
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Gly Thr Phe Ala Gln Leu Ser Glu Leu His Cys Asp Lys
1 5 10
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<213> Homo sapiens
<400> 72
Leu His Val Asp Pro Glu Asn Phe Lys
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<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 73
Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Thr Val Leu Ala Ile His Phe Gly Lys
1 5 10 15
<210> 74
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
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1 5 10
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<213> Homo sapiens
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1 5 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
Tyr His
1
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<211> 8
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<213> Homo sapiens
<400> 77
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<213> Homo sapiens
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Ala Ala Val Thr Ser Leu Trp Ser Lys
1 5
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<213> Homo sapiens
<400> 79
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1 5 10
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 81
Phe Phe Asp Ser Phe Gly Asn Leu Ser Ser Pro Ser Ala Ile Leu Gly
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
Val Lys
1
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1
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<211> 1
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Lys
1
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<213> Homo sapiens
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Val Leu Thr Ser Phe Gly Asp Ala Ile Lys
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Asn Met Asp Asn Leu Lys Pro Ala Phe Ala Lys
1 5 10
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
<400> 88
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<211> 2
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
Tyr His
1
Claims (6)
1.血红蛋白病的标志物组合物，其特征在于，血红蛋白来源于血红蛋白病患者的离体样本；所述血红蛋白病包括地中海贫血和异常血红蛋白病，所述地中海贫血包括a地中海贫血和/或β地中海贫血，所述异常血红蛋白病包括异常血红蛋白病HbE和/或HbE/β复合型地中海贫血；
所述a地中海贫血的标志物组合物为ζ珠蛋白链和α珠蛋白链；所述β地中海贫血的标志物组合物为γ珠蛋白链和β珠蛋白链、δ珠蛋白链和β珠蛋白链中的任一种或多种；所述异常血红蛋白病的标志物组合物为γ珠蛋白链、β珠蛋白链和βET3珠蛋白链特征肽段；
所述α珠蛋白链为氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的αT3珠蛋白链特征肽段，所述β珠蛋白链为氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示的βT2珠蛋白链特征肽段；所述ζ珠蛋白链为氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示的ζT8珠蛋白链特征肽段；所述δ珠蛋白链为氨基酸序列如SEQ IDNO：46所示的δT2珠蛋白链特征肽段；所述γ珠蛋白链为氨基酸序列如SEQ ID NO：70所示的γT10珠蛋白链特征肽段；所述βET3珠蛋白链特征肽段的氨基酸序列为：VNVDEVGGK。
2.根据权利要求1所述的标志物组合物，其特征在于，所述a地中海贫血的标志物组合物ζ珠蛋白链和α珠蛋白链来源于0~2个月a地中海贫血患者、2~12个月a地中海贫血患者和/或一岁以上a地中海贫血患者的离体样本；
所述β地中海贫血的标志物组合物γ珠蛋白链和β珠蛋白链来源于0~2个月β地中海贫血患者、2~12个月的β地中海贫血患者和/或一岁以上β地中海贫血患者的离体样本；所述β地中海贫血的标志物组合物δ珠蛋白链和β珠蛋白链来源于2~12个月的β地中海贫血患者和/或一岁以上β地中海贫血患者的离体样本。
3.用于诊断权利要求1-2任一项所述标志物组合物的试剂，其特征在于，所述试剂包括红细胞血红蛋白萃取液、蛋白变性剂、蛋白酶解液、复溶液、各型珠蛋白特征肽段的同位素内标物混合液和各型珠蛋白特征肽段的标准品；所述红细胞血红蛋白萃取液为甲醇和水的混合溶液，所述蛋白变性剂为乙腈和甲酸的混合溶液，所述蛋白酶解液为含有TPCK-Treated胰蛋白酶冻干粉的碳酸氢铵溶液，所述复溶液为含有甲酸的乙腈水溶液。
4.根据权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述试剂还包括阴阳性对照物，以及正常标品、地中海贫血杂合子标品和地中海贫血纯合子标品。
5.权利要求1所述的标志物组合物或权利要求3所述的试剂在制备用于早期识别不同类型的血红蛋白病的试剂盒中的应用。
6.权利要求1所述的标志物组合物或权利要求3所述的试剂在制备用于诊断0~2个月血红蛋白病患者、2~12个月血红蛋白病患者和/或一岁以上血红蛋白病患者疾病类型的试剂盒中的应用。
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