CN1882840A - 用于新生儿筛选的血红蛋白检定 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种适用于新生儿血红蛋白病筛选的检定法,包括定量测定至少一对血红蛋白(Hb)变异体的存在情况,测定从每个变异体得到的信号的比率,然后基于该比率确定受试对象是否患病。
Description
发明领域
本发明涉及新生儿血红蛋白病筛选的方法。更具体地说,本发明涉及血红蛋白病的新生儿筛选的免疫学检定法。也公开了用于这些方法中的试剂组合和试剂盒。
发明背景
人类血红蛋白是围绕血红素基团折叠的珠蛋白链的四聚体。该四聚体的分子量大约为64,500。一个功能性的血红蛋白(Hb)由两条α珠蛋白链和两条非α(β、γ或δ)链组成。总共有8种功能性珠蛋白链在发育的不同阶段被发现,它们产生8种类型的正常Hb四聚体。成年人有占主导地位的HbA(“正常”或“普通”血红蛋白),以及少量的HbA2。新生儿的血红蛋白主要是由胎儿血红蛋白(HbF)组成,其中大约有15~40%的HbA。胎儿血红蛋白只包含水平几乎检测不到的HbA2。
由于编码不同Hb链的基因发生突变,导致了700多种已知的变异型血红蛋白。这些变异体的绝大多数是由于在单一珠蛋白链上发生了氨基酸替换。这些突变体的大多数产生无临床意义的不正常Hb功能。这些变异体中不到10种会引起严重的疾病,即所谓的血红蛋白病。
各种变异型血红蛋白是地区性不平均分布的,而且在不同的地区有不同的发生频率。最早被鉴定的、临床上最有意义的变异体是HbS,它与镰刀型细胞贫血症有关。HbS变异型血红蛋白传统上在非洲和地中海种族的人群中最丰富。由于在许多国家人种多样性的增加,血红蛋白病在欧洲和美国也似乎变得更普遍了。在英国,镰刀型细胞贫血症的出生流行已经是十年增加差不多50%,而且据估计在英国,该病总体流行(1∶2380)甚至高于许多其它的遗传性疾病,如囊性纤维增生或苯丙酮酸尿症。镰刀型细胞贫血症是一种非常严重的疾病,患有该病的儿童大约有20%会在最初的两年内死亡,经常是由于被感染。对这种血红蛋白病的早期新生儿鉴定实质上减少了在生命的最初五年内的死亡率和发病率。杂合子(HbAS)不显示症状。
其它重要的Hb变异体包括HbE,它是第二高发频率的血红蛋白病,主要在亚洲发生。HbC在非洲的西部发生频率最大。其它常见的血红蛋白变异体有HbG和HbD。
一些变异型血红蛋白(如HbS)以如此高的频率发生,使得有人建议进行新生儿常规筛,以鉴定可能的患病(afflicted)对象。在某些地区,如美国的大多数州和巴西,所有的新生婴儿都要做针对可能的镰刀型特征的新生儿检验。其它的国家正在考虑将普遍新生儿筛选程序增加到其国家保健程序中。在如在英国源自非洲的少数民族人种群体超过15%的地区,建议进行普遍新生儿血红蛋白病筛选程序。位于伦敦西北部的米德尔塞克斯郡中心医院(Central MiddlesexHospital),对所有出生在the North Thames(West)healt地区的婴儿进行检测,也就是每年对约50000出生者进行检验(Campbell等,ClinChem,45:7,969-975,1999)。
被考虑纳入常规新生儿筛选的其它血红蛋白变异体有例如HbC,HbD-Punjab和Hb-Barts。所有这些血红蛋白变异体都是以在β链上导致氨基酸替换的突变为特征的。由于α链的突变而致的异常血红蛋白是相对不普遍的。
地中海贫血症是由于血红蛋白α链上的突变而引起的疾病,导致血红蛋白合成速率减慢。α地中海贫血症和β地中海贫血症两者间存在差别。正常情况下,α珠蛋白链是双份拷贝存在的。患α地中海贫血症的个体的α链合成会减少或无合成。α地中海贫血症通常根据Hb-Bart的γ-链存在而在新生儿中被检测到。β地中海贫血症是以β-珠蛋白链合成减少或无合成为特征的。无β-珠蛋白链的新生儿将没有HbA,遭受严重贫血。β0地中海贫血症或β地中海贫血症通常较多地在儿童时期导致死亡。患β珠蛋白合成减少的个体将显示为HbA减少,在某些情况下有轻微升高的HbA2。由于地中海贫血症的流行性高,因此也有必要将地中海贫血症检测纳入常规新生儿筛选。
因此,需要建立价廉且易于使用的筛选方法,该方法可以区别健康的个体与需要进一步检验以诊断可能的血红蛋白病的可能患者。
可是,没有能给出简单的患病(afflicted)/非患病(non-afflicted)答案的临床上可应用的方法。目前检测血红蛋白病可用的方法都是基于分离并鉴别在一个样本中所有不同的变异型血红蛋白的技术。这些方法基于电泳、等电聚焦(IEF)或HPLC,是非常地耗费劳力而且昂贵,因此不适合普通的血红蛋白病的常规新生儿筛选。
电泳方法如IEF,是基于变异型Hb带有不同电荷的事实。基于IEF的一种市售产品是Wallac RESOLVE Neonatal Hemoglogin(新生儿血红蛋白)检验试剂盒。它设计用于在薄层凝胶上分离脐带血血红蛋白,允许将镰刀状细胞贫血症与镰状细胞性状区分开来。从HbA中分离出HbF容许将镰状细胞性状(HbAS)与镰刀状细胞贫血症(HbSS)区分开来。血红蛋白的制备和分离是通过将血红蛋白样本置于含有RESOLVE Ampholytes(分离用两性电解质)(pH 6-8)的预制琼脂糖凝胶上来实现的。RESOLVE Ampholytes由带不同等电点的低分子量两性分子组成。当电流被加在凝胶上,这些分子在凝胶中迁移至在凝胶上它们的等电点处,形成一个稳定的pH梯度。
各变异型血红蛋白也在凝胶中迁移,直到它们到达各自的等电点所对应的胶中pH区域。在该点,各变异体上的净电荷为零,迁移停止。电场中和了扩散,变异型血红蛋白形成一条单个的细带。用Perkin-Elmer的JB-2 Staining System(染色系统)可以使这些血红蛋白带显现。
IEF可能是当今绝大多数临床实验室在检测血红蛋白病时选用的方法。可是,该方法需要对为数众多的胶进行物理处理,易于发生移液错误。此外,结果的解释述是基于对凝胶的具体检查,要求高度熟练的技术人员和专家来解释结果。而且,还要求测试的实验室在一段特定的时间周期内保存这些凝胶,这需要贮存容量和安全贮存用的合适设施。
凝胶电泳方法的一个显著缺陷就是它们无法鉴定出Bart′s血红蛋白。因此,α地中海贫血症在该方法中可能被忽略掉。
另一个可利用的诊断血红蛋白病的方法是基于高效液相色谱法技术,HPLC,该技术在如美国专利4,108,603和美国专利5,719,053有描述。这些方法不象IEF那样耗费劳力,但仍需要相当大的工作负荷量。由于同时分析许多样本是不可能的,所以如果在常规新生儿筛选程序中应用HPLC,其容量可能成为限制因素。
有关涉及血红蛋白病筛选的可用实验室方法和国际指导原则的综述可查阅Clinical Chemistry,46:8(B),1284-1290,2000和Guideline:The Laboratory Diagnosis of Haemoglobinopathies,British J Haematol,101,783-792,1998。
对目前使用的血红蛋白病检验程序所需的绝对费用很难估计。Davies等在Health Technology Assessment 2000上估计,用IEF对50,000新生儿进行检验时每个婴儿的费用是£3.51,用HPLC时是£3.83,也就是500,000个出生者需要£1.7×106。以1∶2000的流行指数计,每例检出病例的费用就高达约£6700。对整个英联邦,每例检出病例的总费用约为£20,000。
Moscoso等在J Clin Lab Anal.,7(4),214-19,1993描述了一种可用于差别诊断血红蛋白病的ELISA检定法。他们描述使用针对正常和变异型血红蛋白的单克隆抗体。这种检验可用于诊断和特异性鉴别血红蛋白变异,但是,该检验需要包括针对检验中所有已知变异体的试剂,因此使其不适用于对新生儿筛选的目的。
Rosenthal等在Screening,3(2),67-76,1994中描述了用于鉴别HbA、HbS、HbC和HbE的单克隆抗体检定法的HemoCard试剂盒。该检验可用于确认变异型血红蛋白的存在,但对于新生儿筛选目的并非有用。
以上描述的用于检测血红蛋白病的各种方法的一个共同特征是,它们实际上提供了太多的信息而不适用于作为筛选检验方法,事实上目前这些方法作为证实性诊断检验是有用的。理想的筛选程序应当是仅仅鉴别有患给定疾病(如镰刀型细胞疾病(SCD))风险的信息。例如,在某些保健系统中允许被报道的血红蛋白病仅有镰刀型细胞疾病。因此,筛选检验应该是主要发现感兴趣的疾病群。因此,需要确立适合于新生儿血红蛋白病筛选的易于使用、价格便宜的检验方法。
发明简述
本发明公开了一种新生儿血红蛋白病筛选的方法。该方法实施于来自新生儿的血液样本,利用至少一对带不同标记的变异型血红蛋白特异性试剂去特异性地识别不同的血红蛋白变异体。任选在该方法使用额外的第3种试剂,以识别血红蛋白中共有的决定簇。让这些试剂同样本中存在的任何血红蛋白结合,利用所述的标记检测所形成的血红蛋白-试剂复合物。然后,计算来自于各标记试剂的信号的比值,基于该比值,可以确定该样本是来自于非患病个体还是来自于需要进一步检验和诊断可能血红蛋白病的可能患病个体。
在一个优选实施方案中,在一个未分割样本中对带不同标记的试剂对进行检测,但是,如果需要,可以将样本分开到两个分离的反应室中,所述试剂对的第1个成员和所述第3种试剂被加到第一个反应室,所述试剂对的第2个成员和所述第3种试剂被加到第二个反应室。
在本发明的一个优选实施方案中,所述变异型血红蛋白特异性试剂对的第1种成员是一种单克隆抗体,识别如HbA;所述变异型血红蛋白特异试剂对的第2种成员是一种单克隆抗体,识别如HbS;而所述第3种试剂是识别血红蛋白α链的单克隆抗体。
进一步公开的是在本发明的方法中使用的试剂组合,包含至少一对带不同标记的血红蛋白特异性的标记试剂,它们能特异性地识别不同血红蛋白变异体;还包含识别新生儿血红蛋白中恒定部分的第3种试剂,所述第3种试剂含有一个捕获部分,或任选地偶联于固体支持物上。
还公开了用于新生儿血红蛋白病筛选的试剂盒,其包含至少一对血红蛋白特异性的不同标记的标记试剂,它们能特异性地识别不同血红蛋白变异体;还有识别新生儿血红蛋白中恒定部分的第3种试剂,所述第3种试剂含有一个捕获部分,或任选地偶联于固体支持物上;以及任选含有缓冲液、冲洗溶液、信号产生和信号放大试剂。
附图简述
图1是用于进行本发明方法的免疫学检验程式的图解式说明。
图2显示对两种不同标记(图2A是Eu,图2B是Sm)的两条标准曲线,适用于使用在依据本发明的检验法中。
发明详述
本发明基于以下理解,即同时并定量地检测血液样本中至少一对变异型血红蛋白的存在情况,并且测定从每个变异体得到的信号的比率,就可能区别非患病个体与患病个体或可能的患病个体,如携带者。
通过挑选拟检测的一对变异型血红蛋白,可对本发明的筛选检验方法加以修改以解决地理性差异。
在本发明的一个实施方案中,试剂对的第1成员是常见的Hb,如HbA或HbF,优选HbA;试剂对的第2成员选自例如HbS、HbC、HbD、HbE和HbF的一种变异型血红蛋白,其中所述第2种变异型Hb的选择是基于使用该筛选方法的地理区域而决定的。
因此本发明的目标是提供一种检验法,其适合于新生儿血红蛋白病筛选,包括测量至少一对血红蛋白变异体的存在情况(或占总血红蛋白的百分比),计算两种变异体的比率,基于该比率,确定被检验的个体是否是患病个体。在本发明的另一个实施方案中,该检验法可被设计为包括多于一对的待分析变异型血红蛋白,其中,信号比率的比较是针对每一对分别进行的。
在该方法中,所述血红蛋白变异的存在情况可用任何一种可应用的定量方法检定,如免疫检验法、适体(aptamers)或分子印记检测、串联-MS-方法或微阵列法。同样地适合于本发明的其它检验法形式是均相检验法形式,如FRET(Clinical Chemistry 45:6,855-861,2000)。用所获得的测量结果计算变异体间的比率。基于该比率,有可能将携带者同患病者和非患病者区别开。如果是携带者或患病个体,该方法还给出需要进行何种具体检验的初步建议。
可得到的识别变异型血红蛋白的单克隆抗体,如识别Hbα链(普通α链和zeta(ξ)变异体两者)、HbA,、HbS、HbE、HbC和HbF的那些抗体,在本领域中是已知的。这些抗体可以从如PerkinElmerLife Sciences和一般的培养物保藏中心如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得。
根据本发明的一个优选实施方案,提供由一份未分割样本同时检测至少一对变异型血红蛋白的自动免疫检定法。这种免疫检验法优选是夹心型检验法,其中存在于样本中的血红蛋白借助于抗某一特定血红蛋白链(如α链)的抗体而被捕获在微量滴定板的孔中或其它等同的固体支持物(如微珠、毫微型粒子、玻璃和塑料表面、聚合物)上。加入至少一对带不同标记的单克隆抗体,所述对中的每一成员可检测不同血红蛋白变异体,如HbA或HbF,和HbS、HbC或HbE,让其形成抗原-抗体复合物。从抗原-抗体复合物的不同标记得到的信号被定量地记录,如通过DELFIA型仪器,并计算这些信号的比率。使用该优选的自动系统,通过配套的数据-处理系统(MultiCaICTM)基于每一被评估Hb变异体占总Hb的百分比而自动计算该比率。
在计算比率时,优选将它们与来自于纯变异体检验的校准标准曲线作比较。由于使用不同标记而导致的信号强度的可能差异也可被自动校正。另一方面,截止值的确定可以基于具有已知比率的合适Hb变异体的对照。
本领域已知的其它检定形式同样可以应用,如其中变异体特异性抗体在被捕获固体支持物上并通过α-链抗体上的标记进行检测的检定法。在固体支持物上偶联或捕获也可以通过其它结合类型来达到,如通过象生物素-链霉抗生物素的亲和对来捕获。
通过确定用于评价结果的合适的截止值,样本可以被区分为三种各异的类群,非患病者,非患病携带者和患病者。基于这样的分类,就可能决定哪些样本需要进行额外的检验和血红蛋白病种类的具体诊断。
在本发明的一个优选实施方案中,抗体对是抗HbA/抗HbS。基于自动地计算的比率,通过利用两种不同的截止比率,血液样本可以被判读为:
HbA/HbS比率>截止水平A | 非患病者 |
截止水平A>HbA/HbS比率>截止水平B | 镰刀症形状(携带者) |
HbA/HbS比率<截止水平B | 患病者,需要额外检验进行具体变异体的确认 |
当然,如果只需要仅仅筛选出非患病者,也可以只使用一个截止值,该值的选择使其不能区别携带者和患病个体。在一方面,也可能选择额外的截止值以区别出正常新生儿样本(FA)和含有其他(除HbS外)变异体的样本,如FAD或FAC的A比S的比率可能不同于FA样本中的该比率。
除上述所给例子以外,本发明的方法进一步给出有关α-和β-地中海贫血症的指示性信息。在另一方面,HbA和/或HbS信号的缺失或减弱,指示潜在的α-和/或β-地中海贫血症。当无HbS信号得到时,一些其它常见变异体的存在,如样本中的HbC或HbD,但不是HbS,也将给出高的HbA/HbS比率(高于截止值A)。但是,如果这些非S变异体中的一个与HbS相关联时(如SC疾病),它将作为低于截止值B的比率被检测出。在所有这些情况下,患病个体被鉴别出并经进一步诊断。
即使用如上描述的优选方法得到涉及其它血红蛋白病的间接信息,如HbC相关镰刀细胞病,必要时该双重检定法可设计为更集中于地理性变异体,。例如,在亚洲,所选择的血红蛋白对可以是HbA/HbE。因此,适用于依据本发明的血红蛋白病检定法的其他优选的抗体对可以包括例如HbA/HbF、HbA/HbC和HbA/HbD。
可以用于从一个未分割样本中同时检测两种抗体的标记技术可以基于例如荧光、放射性、发光、化学发光、时间分辨荧光检测、吸光度、荧光偏振或荧光共振能量转移。标记还可以基于酶学反应、溶胶或毫微粒子。依据本发明的一个优选方法是利用螯合剂,如铕(Eu)、钐(Sm)、铽(Tb)和镝(Dy)。用自动DELFIA-仪器很容易检测到这些荧光螯合剂,该方法在全球被广泛地用在临床实验室。为了用于均相检定形式,优选的标记包括适合的发光供体/受体对,如铕/花青染料(如Cy3,Cy5,Cy7)、铕/藻胆素蛋白(如APC,C-PC,R-PC)、荧光素/四甲基若丹明。
DELFIA-免疫检定形式是一种高度优选的形式,但任何能够从一个未分割样本中定量测量不同血红蛋白变异体的检定形式可同样用于本发明。这些检定形式的例子包括均相FRET-检定法、串联-MS-方法或微阵列技术的使用。
本发明的一个优点就是通过只检测两种变异体(例如HbA和HbS),就有可能主动鉴定出(positive identification)非患病样本,并给出有关可能需要进一步检验的疾病相关变异体的指示性结果这一事实。如果样本包含了除被测量两种外的其它变异,那么必要时所测量变异体间的比率也将给出指示其它可能疾病-相关变异体的结果。因此,依据本发明的筛选检定法在常规新生儿筛选中是非常有用的,在常规新生儿筛选中,并不需要明确诊断,或者即使需要,也仅需要用以确定哪些受试对象需要进一步的测试和诊断的筛选。
依据本发明的血红蛋白病筛选检定法可以被容易地进一步修订为包括对其它变异体的检验,例如通过包含如上面描述的额外的变异抗体或抗体对。在这些实施方案中,如果需要,可修正筛选检验的指示值。但是,依据许多保健计划指南,优选由该双变异体筛选检定法给出样本的+/-结果。
用于本发明方法和检定法中的血液样本包括干血斑点标本(DBSS),即所谓的Guthrie斑点。这是本发明的一个优点。这些样本在对新生儿作检查时是容易收集到的,并且可以避免可能的脐带血被母体血液的污染。依据本发明的方法和检定法中样本处理非常简单。当检定法形式是对于在微量滴定板孔中的未分割样本进行的免疫检定时,不需要对样本作附加前处理或从滤纸中抽提血液。穿孔取出一小片滤纸,用于收集血液样本,将其放置于微量滴定板孔中,在该处它不会干扰抗体-血红蛋白复合物的形成。
除了样本处理非常简单外,本发明的方法还有更多的优点。血液样本的稳定性是没问题的,Guthrie斑点易于储存。此外,还避开了由于吸取错误而致的任何错误。另外,本发明检定法的结果不会因样本质量的不同而受影响,例如样本中总血红蛋白含量的不同不会影响所测量的比率。
与高度优选检定的形式—免疫检定法相关的一个进一步的优点,是这些方法容易被自动化和运用,除去了目前所用检定法的劳动强度大的缺点。
本发明的另一目标是提供用于新生儿血红蛋白病筛选的试剂和试剂组合。这些试剂和试剂组合可包含用于检测至少两种血红蛋白变异体的至少两种试剂。优选的试剂是例如特异性鉴定一种特定Hb变异体的单克隆抗体。然而,在本发明的方法和检定法中可以使用许多其它的试剂类型,如HB变异体特异性适体或分子印记等等(Analytical Chemistry 69,345A-349A,1997和Journal of Biotechnology,74(1),5-13,2000)。优选试剂组合包括检测HbA/HbS、HbA/HbF、HbA/HbC和HbA/HbD的单克隆抗体对。一种特别优选的试剂组合包含HbA特异性单克隆抗体和HbS特异性单克隆抗体。
用于本发明方法和检定法的试剂盒包括下面的试剂和试剂,它们含有至少两种Hb变异体特异性标记抗Hb抗体(试剂对),和至少一种额外的Hb特异性试剂,如Hbα-链特异性抗体,最好是结合于固体支持物上。该试剂盒可以进一步包括用于试剂温育的必需缓冲液、用于从结合复合物中分离未结合试剂的冲洗溶液、信号产生和/或放大试剂(如离解的荧光增强溶液)、酶底物或化学荧光产生化合物。在本发明的系统中所包括的任选试剂的选择,视血红蛋白特异性试剂的类型、检定法形式和所选择的标记技术而有所不同。
依据本发明的优选试剂盒可以额外地包括书面说明,说明如何例如使用内置的算法,基于测量和计算的信号比率确定区别来自于非患病和可能患病个体的样本间截止线。这种说明也可作为用以进行分类的独立的计算机程序而包括在内。
该新生儿血红蛋白病筛选检定法将在下文中通过具体实施例更详细加以描述。但是,这些实施例不能被诠释为限制本发明的范围。如上所述,其它优选实施例是容易被预见的。
实施例1
抗HbA抗体的标记
Sm-N1螯合剂是从Wallac Oy,Turku,Finland处得到的。将浓度为7.0mg/mL的抗HbA抗体(PerkinElmer Life and Analytical Sciences,Akron,USA)与在pH 9.5的50mmol/L碳酸盐缓冲液中100倍摩尔过量的螯合剂于+4℃温育过夜。然后,用含有9g/L NaCl的50mmol/LTric-HCl(pH 7.75)的缓冲液作为洗脱缓冲液,通过凝胶过滤(蛋白质G琼脂糖)将标记抗体与未反应螯合剂分开。用DELFIA系统和Sm3+校准物测量缀合抗体的Sm3+浓度,从而确定标记程度(Sm3+/IgG)。标记程度达到9.7。发现标记抗体在含有牛血清白蛋白(0.1%)作为稳定剂的Tris缓冲液pH 7.4中于+4℃存储可稳定数月。
实施例2
抗HbS抗体的标记
Eu-N1螯合剂得自Wallac Oy,Turku,Finland。将浓度为2.4mg/mL的抗HbS抗体(PerkinElmer Life and Analytical Sciences,Akron,USA)与在pH 9.5的50mmol/L碳酸盐缓冲液中100倍摩尔过量的螯合剂于+4℃温育过夜。然后,用含有9g/L NaCl的50mmol/L Tric-HCl(pH7.75)的缓冲液作为洗脱缓冲液,通过凝胶过滤(蛋白质G琼脂糖)将标记抗体与未反应螯合剂分开。用DELFIA系统与Eu3+校准物测量缀合抗体的Eu3+浓度,从而确定标记程度(Eu3+/IgG)。标记程度达到11.5。发现标记抗体在含有牛血清白蛋白(0.1%)作为稳定剂的Tris缓冲液(pH 7.4)中于+4℃存储可稳定数月。
实施例3
用抗Hbα链抗体包被微量滴定板
用抗Hbα链抗体(PerkinElmer Life and Analytical Sciences,Akron,USA)包被微量滴定条板的各孔(Nunc IMMUNO STRIPS C 12irradiated,type 4-77178),每孔1.0μg抗体(于0.2M Na2HPO4/0.2MNaH2PO4中),在37℃和pH 7温育过夜。包被板各孔通过与饱和缓冲液(含3%海藻糖、0.1% Germall II和0.1%牛血清白蛋白的50mMNaH2PO4)在室温(~22℃)下温育过夜而被封闭,然后被抽吸干并在37℃至少过夜干燥。发现气密包装的包被微量滴定板于+4℃存储可稳定数月。
实施例4
免疫检验方法原理
该免疫检验方法原理的图解式说明如图1所示。该检验方法是自动(自动DELFIA)HbS/A特异性双重标记免疫检验法,用于从干血斑点标本(DBSS)中检测HbS和HbA变异体。该免疫检验方法在包被的微量滴定条板的孔中进行,特定的Hb变异体用不同标记的抗Hb变异体抗体检测。在第一次温育中,用200μL水洗脱样本(一个3.2mmDBSS)30分钟(缓慢振荡),通过被包被于微量滴定板孔中的抗Hbα链(实施例3)将来自该样本的所有Hb捕获在固体支持物上。在圆片被移去并经过2次冲洗循环后,分别用Eu和Sm标记的抗HbS变异体抗体和抗HbA变异体抗体(实施例1和2),以100ng/孔/标记抗体,Vtot=100μL温育45mins(缓慢振荡),检测HbS和HbA变异体。在6次冲洗循环后,加入增强液(Enhancement Solution),在进行时间分辨荧光测量前,将平板先再温育15分钟(缓慢振荡)。
实施例5
抗HbS抗体的特异性
如果目的是将免疫检验方法原理应用于检测HbS变异体,则所给定的抗HbS抗体的特异性就有首要的重要性。因此,我们采用用于从DBSS中检测HbS和HbA变异的HbS/A特异性双标记免疫检测法,测验了一些已知有不同Hb变异体的新生儿样本。该免疫检验方法在包被微量滴定条板的孔中进行,用不同标记的抗Hb变异体抗体检测特定的Hb变异体。在第一步,在未包被的微量滴定板孔中用200μL水洗脱来自给定样本(一个3.2mm DBSS/样本)的所有Hb达30分钟(缓慢振荡)。然后,将10μL样本洗脱液+90μL酪蛋白缓冲液(CaseinBuffer)加入到抗Hbα链包被微量滴定板孔中(实施例3),室温温育30分钟(缓慢振荡)。经过4次冲洗循环后,分别用Eu和Sm标记的抗HbS和抗HbA变异(实施例1和2),以100ng/孔/标记抗体,Vtot=100μL温育45mins(缓慢振荡),检测HbS和HbA变异体。在4次冲洗循环后,加入增强液被,在进行时间分辨荧光测量前,再将平板温育5分钟(缓慢振荡)。
表1显示了得到的Eu和Sm信号。很清楚,所用的抗HbS抗体(Eu标记)只识别携带者样本,即FAS样本(FAS的信号范围是8514-30202,而其它变异体的均值为3107)。但是,所有被测样本都含有HbA,证据是阳性Sm信号。结论是,该实验说明抗HbS单克隆抗体的特异性。
实施例6
Hb变异体特异性抗体的特异性和交叉反应性
如果运用双标记免疫检验法系统,则必须确保所使用的抗体确实是高特异性识别其靶分子,而且他们不会相互干扰。此处显示的结果是用同实施例5基本相同的检验法原理得到的。少数的修改是,在洗脱后,将20μL样本洗脱液+80μL酪蛋白缓冲液(Casein Buffer)加入到包被微量滴定板中。同样,标记物以不同的浓度和组合使用(见表2)。样本来自正常健康个体,即存在的主要血红蛋白是HbA,带有少量的HbA2。
从表1可以读出,增加HbS特异性Eu-标记抗体不会干扰测量的Sm信号,它保持恒定(范围8884-9418cps)。同样,当两种标记抗体都存在时,Eu-背景保持相对地恒定(范围918-1873cps)。但是,当只有抗HbS抗体存在时,可以看见在HbA和抗HbS抗体间有一些交叉反应。结论是,该实验说明,所用的两种抗体—抗HbS和抗HbA抗体,当联合使用时,识别它们特异性靶分子,即分别是HbS和HbA,两种抗体中的任何一种存在,都不会干扰另一种抗体的结合。
实施例7
校准物的制备和测验
使用所得到的原始数据(直接读数),或者用HbS和HbA特异性校准物将所得读数标准化为血红蛋白的百分比,可以计算比率,即HbA对HbS的比率。第一种选择虽然简单,但有一些缺陷,如每个分子产生不同的信号量。后一种选择给出更好的指示性测量结果(仅仅半定量的),但是相当难以执行。在本实施例中,我们开发了HbS和HbA特异性校准物,使用纯的HbA和HbS血液样本,这些样本是用鸡血(所用的抗体已知对鸡Hb无反应)进行系列稀释而制备的,最后将血液点在滤纸(S&S 903)上。这些系列稀释液包括0、2.5%、5.0%和10.0%的HbA或HbS。此外,制备含0、2.5%、5.0%和10.0%HbA和HbS的相似系列的校准物。这些制备的校准物如实施例4中的描述加以评估。各个HbA和HbS校准物的结果如图2所示。
这些结果说明:所使用的方法可以检测到低至2.5%的Hb比值。即使这些制备的校准物含有特定的总Hb浓度,但只有当计算出比率时,才可根据这些曲线测量出有不同的总Hb浓度的未知样本(比率计算消除了不同的总Hb浓度的影响)。因此,根据这些校准物得到的百分比结果仅仅指示了给定Hb变异体的浓度。
实施例8
可行性检验
为了表明本发明的可行性,采用实施例4中描述的方案,分析了一些已知的新生儿样本(用IEF评估过)同具有HbA和HbS两者的制备校准物。
表3显示了原始数据(每分钟计数)和根据所制备校准物标准化的结果。此外,用两种选择计算出HbA/HbS比率。可以看出,用本发明的方法,镰刀形细胞携带者样本可以容易地被检测出并与其它样本区分开来。当用原始数据计算比率时,最低的非患病比率是1.3,而FAS(镰形携带者)样本的比率范围为0.06-0.25。因此,依据该初始数据,第一个比率(1.3)应该是截止值A,可用0.06的比率作为截止值B。当用校准物来计算比率时,结果会更加清楚:最低的非患病比率是27.9,而FAS(镰形携带者)样本的比率范围为1.9-5.2。这可以理解为如下:27.9将作为截止值A,1.9将作为截止值B。在两种情形中,HbA/HbS比率高于截止值A的任何样本就诠释为正常(就镰刀形细胞疾病SCD而言),该比率介于两个截止值之间被诠释为镰刀形细胞疾病携带者,该比率低于截止值B则被诠释为镰刀形细胞疾病。截止值B被认为是任选的,因为就镰刀形细胞的筛选而言,截止值A最为重要,它能确定应当进行进一步分析的任何样本。
实施例9
临床可行性试验
为了表明本发明的临床可行性,采用实施例4中描述的方案,分析了一些已知的新生儿样本(用IEF评估过)同含有HbA和HbS两者的制备校准物。
评估了总共498份新生儿样本。对每份样本,依据各个(HbS和HbA)百分比结果计算A对S的比率。498份样本的总处理时间为4小时18分钟。在498份样本中,据先前的报告,366份是正常(FA)的,83份是SCD携带者(FAS),4份是SCD(FS或FSC)。在本研究群体中也存在许多其它变异体(见表4)。这些结果已经被IEF和HPLC确认。在本可行性研究中使用初步截止值。比率截止值B(比率<1.0)用以鉴别SCD样本,而比率截止值A(比率介于1和4之间)用以鉴别HbS携带者。如果比率大于4,则这些样本被报告为正常。此外,用一个额外参数以鉴别异常样本,即当HbA%是可疑地低伴随无HbS%的存在时,样本被报告为重复。
表4显示了本临床可行性研究的结果。如果本检验法用于新生儿SCD的初步筛选,则可发现所有受影响的样本。我们鉴别出所有SCD携带者(一份携带者样本被假鉴别为SCD)和SCD样本,而所有正常样本被鉴别为或正常(355/366)或重复(11/366)。
正常样本的总体重复率是11/366,约3%。在其它Hb变异体中,23/29被标注为不正常(重复标注),约59%。其中检测了2/3的FAC样本和1/2的Barts样本,而其它变异体的数目太低以致于无法得出任何结论。
表1
Eu-测量值 | Sm-测量值 | |||||
样本 | 计数 | 平均值 | cv% | 计数 | 平均值 | cv% |
FAS1 | 1818712080 | 15134 | 29 | 52564465 | 4860 | 12 |
FAS2 | 2351620042 | 21779 | 11 | 46103697 | 4154 | 16 |
FAS3 | 452112507 | 8514 | 66 | 11351086 | 1111 | 3.1 |
FAS4 | 132569491 | 11374 | 23 | 30802534 | 2807 | 14 |
FAS5 | 1950823554 | 21531 | 13 | 20201928 | 1974 | 3.3 |
FAS6 | 3186228542 | 30202 | 7.8 | 27773092 | 2934 | 7.6 |
FA Barts 7 | 34273010 | 3219 | 9.2 | 48844195 | 4540 | 11 |
FAC13 | 28303139 | 2985 | 7.3 | 43414124 | 4232 | 3.6 |
FAE19 | 34472935 | 3191 | 11 | 33143829 | 3571 | 10 |
FAG25 | 31574104 | 3631 | 18 | 62227631 | 7927 | 5.3 |
FAD31 | 25642453 | 2509 | 3.1 | 32222734 | 2978 | 12 |
表2
样本Ke549,稀释1∶5,(20μl+80μl)
Sm-荧光产生 | Eu-荧光产生 | ||||||||
计数 | 平均值 | cv% | 计数 | 平均值 | cv% | ||||
Sm-HbA100ng/w | Eu-HbS10ng/w | 92519584 | 9418 | 2,5 | Sm-HbA100ng/w | Eu-HbS10ng/w | 910925 | 918 | 1,2 |
Eu-HbS25ng/w | 88089091 | 8950 | 2,2 | Eu-HbS25ng/w | 26291014 | 1822 | 63 | ||
Eu-HbS50ng/w | 85549814 | 9184 | 10 | Eu-HbS50ng/w | 14492117 | 1783 | 28 | ||
Eu-HbS75ng/w | 95998817 | 9208 | 6,0 | Eu-HbS75ng/w | 82361505 | 4871 | 98 | ||
Eu-HbS100ng/w | 88618916 | 8884 | 0,5 | Eu-HbS100ng/w | 20231723 | 1873 | 11 | ||
Eu-HbS100ng/w | 338330 | 334 | 1,7 | Eu-Hbs100ng/w | 54725836 | 5654 | 4,6 |
表3
样本 | HbS cps | % HbS | HbA cps | % HbA | RATIO cps | RATIO% | 结果 |
FAS | 296938 | 6.9 | 38984 | 21.6 | 0.12 | 3.1 | 携带者 |
FAS | 251710 | 6.2 | 44240 | 32.4 | 0.18 | 5.2 | 携带者 |
FAS | 114163 | 3.8 | 22136 | 9.4 | 0.19 | 2.5 | 携带者 |
FAS | 141319 | 4.3 | 35976 | 20.4 | 0.25 | 4.7 | 携带者 |
FAS | 275151 | 6.6 | 37372 | 22.1 | 0.14 | 3.3 | 携带者 |
FAS | 627029 | 13.9 | 40155 | 25.8 | 0.06 | 1.9 | 携带者 |
FABart’6 | 20387 | 0.5 | 41224 | 37.4 | 2.02 | 74.8 | 非患病者 |
FABart’6 | 21265 | 0.5 | 48955 | 42.2 | 2.30 | 84.4 | 非患病者 |
FABart’6 | 20645 | 0.5 | 51877 | 49.6 | 2.63 | 99.2 | 非患病者 |
FABart’6 | 19056 | 0.4 | 47541 | 39 | 2.49 | 97.5 | 非患病者 |
FABarr’6 | 29107 | 0.9 | 43601 | 31.3 | 1.50 | 34.8 | 非患病者 |
FABart’6 | 19693 | 0.4 | 46585 | 36.9 | 2.37 | 92.3 | 非患病者 |
FAC | 18149 | 0.4 | 47359 | 38.6 | 2.61 | 96.5 | 非患病者 |
FAC | 18172 | 0.4 | 33298 | 17.6 | 1.83 | 44.0 | 非患病者 |
FAC | 18369 | 0.4 | 40146 | 26.8 | 2.19 | 64.5 | 非患病者 |
FAC | 17203 | 0.3 | 36318 | 20.8 | 2.11 | 69.3 | 非患病者 |
FAC | 19048 | 0.4 | 41836 | 28.3 | 2.20 | 70.8 | 非患病者 |
FAC | 14411 | 0.2 | 22381 | 9.6 | 1.55 | 48.0 | 非患病者 |
FAE | 19493 | 0.4 | 50064 | 44.9 | 2.57 | 112.3 | 非患病者 |
FAE | 22608 | 0.6 | 46401 | 36.6 | 2.06 | 61.0 | 非患病者 |
FAE | 18912 | 0.4 | 40487 | 26.3 | 2.14 | 65.8 | 非患病者 |
FAE | 22529 | 0.6 | 45790 | 36.3 | 2.03 | 58.8 | 非患病者 |
FAE | 27160 | 0.8 | 47136 | 38.1 | 1.74 | 47.6 | 非患病者 |
FAE | 24201 | 0.6 | 45063 | 33.9 | 1.86 | 66.5 | 非患病者 |
FAG | 21789 | 0.5 | 75371 | 184.1 | 3.46 | 368.2 | 非患病者 |
FAG | 21214 | 0.5 | 47601 | 38.9 | 2.24 | 77.8 | 非患病者 |
FAG | 29447 | 0.9 | 45046 | 33.9 | 1.53 | 37.7 | 非患病者 |
FAG | 27793 | 0.8 | 37667 | 22.3 | 1.36 | 27.9 | 非患病者 |
FAG | 19628 | 0.4 | 34834 | 19.2 | 1.77 | 48.0 | 非患病者 |
FAG | 22391 | 0.6 | 42606 | 29.6 | 1.90 | 49.3 | 非患病者 |
FAD | 25424 | 0.7 | 46358 | 34.5 | 1.78 | 49.3 | 非患病者 |
FAD | 25743 | 0.7 | 48267 | 40.6 | 1.87 | 58.0 | 非患病者 |
FAD | 30082 | 0.9 | 41359 | 27.6 | 1.37 | 30.7 | 非患病者 |
FAD | 25016 | 0.7 | 39468 | 24.8 | 1.58 | 35.4 | 非患病者 |
FAD | 24626 | 0.7 | 46402 | 36.6 | 1.88 | 52.3 | 非患病者 |
FAD | 31410 | 1 | 45323 | 34.4 | 1.44 | 34.4 | 非患病者 |
表4
报告的标注
样本 | 正常 | 重复 | 携带 | SCD |
FAC | 9 | 17 | ||
FAS | 82 | 1 | ||
Barts | 7 | 6 | 2 | |
FA | 355 | 11 | ||
FAC Barts | 1 | |||
FAD | 1 | |||
FC | 1 | |||
FS | 2 | |||
FSC | 2 | |||
G-Philly | 1 |
Claims (20)
1.一种用于新生儿血红蛋白病筛选的方法,包括如下步骤:
i)获得来自于新生儿的血液样本;
ii)加入至少一对带标记的血红蛋白特异性试剂,其中所述试剂对的每一成员带有不同的标记并特异性地识别一种不同的血红蛋白变异体,和可任选地
加入识别血红蛋白中特定珠蛋白链的试剂;
iii)让这些试剂结合存在于样本中的血红蛋白;
iv)通过所述标记检测所形成的血红蛋白/试剂复合物;
v)计算由标记试剂获得的信号之间的比率;并
vi)将所述比率同至少一种预选择截止值进行比较;并
vii)依据所述比较,确定该样本是来自于非患病对象还是来自需要进一步测试和诊断可能的血红蛋白病的可能患病对象。
2.权利要求1的方法,其中所述样本被分开加入两个分离的反应室中,所述试剂对的第1成员和第3种试剂被加入到第一个反应室中,所述试剂对的第2成员和第3种试剂被加入到第二个反应室中。
3.权利要求1或2的方法,其中在步骤vii)中的确定是基于两个截止值,将检验结果划分为三类:非患病对象、携带者和可能患病对象。
4.权利要求1至3中任何一项的方法,其中所述第1、2、3种试剂选自单克隆抗体、适体和分子印记。
5.权利要求4的方法,其中所述试剂对中的一个成员是HbA特异性单克隆抗体,所述试剂对中的另一个成员是HbS特异性单克隆抗体。
6.权利要求5的方法,其中所述第3种试剂是识别血红蛋白α链的单克隆抗体。
7.权利要求5的方法,其中所述第3种试剂结合在固体支持物上,或包含用于在固体支持物上进行捕获的结合部分。
8.权利要求1~6的方法,其中所述第1种和第2种标记是荧光标记、发光标记、化学发光标记、放射性标记、酶、溶胶或毫微粒子。
9.权利要求8的方法,其中所述第1和第2种标记选自铕、钐、铽或镝螯合剂。
10.权利要求1-5的方法,其中所述第1种和第2种标记物是发光物能量接受体分子,所述第3种试剂用发光物能量供体分子进行标记。
11.权利要求9的方法,其中所述接受体/供体对选自镧系/花青染料、镧系/藻胆素蛋白以及荧光素/四甲基若丹明。
12.一种适用于新生儿血红蛋白病筛选的试剂组合,其包含:
至少一对标记的血红蛋白特异性试剂,其中所述试剂对的每一成员带有不同的标记并特异性地识别一种不同的血红蛋白变异体;和
可识别新生儿血红蛋白中恒定部分的第3种试剂,所述第3种试剂包含捕获部分,或任选地偶联于固体支持物上。
13.权利要求11的试剂组合,其中所述第1、2、3种试剂是单克隆抗体。
14.权利要求12的试剂组合,其中所述第1种试剂是HbA特异性单克隆抗体,所述第2种试剂是HbS特异性单克隆抗体。
15.权利要求13的试剂组合,其中所述第3种试剂是识别血红蛋白α链的单克隆抗体。
16.权利要求14的试剂组合,其中所述第3种试剂结合在固体支持物上,或带有用于在固体支持物上进行捕获的结合部分。
17.权利要求11-15的试剂组合,其中所述第1种和第2种标记是荧光标记。
18.权利要求16的试剂组合,其中所述第1种标记是铕,所述第2种标记是钐。
19.一种用于新生儿血红蛋白病筛选的试剂盒,其包含:
至少一对标记的血红蛋白特异性试剂,其中所述对的每一成员带有不同的标记并特异性地识别一种不同的血红蛋白变异体;和
识别新生儿血红蛋白中恒定部分的第3种试剂,所述第3种试剂包含捕获部分,或任选地偶联于固体支持物上;
缓冲液、冲洗溶液、信号产生和信号放大试剂;和
有关如何计算截止值以确定样本被诠释为源自非患病对象还是源自可能患病对象的说明。
20.权利要求19的试剂盒,其中所述确定是基于包含在所述说明中的预选择截止值。
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