CN107110873B - 检测血红蛋白中异常的方法 - Google Patents

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Abstract

所述方法描述了经过MALDI‑ToF质谱快速筛查全血样品、针刺和血点卡。生成谱并与来自正常健康对照的那些比较。特征性谱表示存在血红蛋白病并且可使用该方法来筛查/诊断所有镰状细胞病、α和β地中海贫血。

Description

检测血红蛋白中异常的方法
该方法描述了快速筛查全血样品、针刺和血点卡，经过以下MALDI-ToF质谱：
1)在蒸馏的去离子水中(或冷冻)中裂解并且以1/10至1/8000的范围在蒸馏的去离子H2O或蒸馏的去离子H2O中的0.1％TFA中大量稀释。所得的谱检验为15000m/z至16200m/z的质/荷比范围的单电荷离子；但优选7550至8200m/z的双电荷离子。
2)用柠檬酸盐缓冲的福尔马林孵育，之后在蒸馏的去离子水中(或冷冻)中裂解并且以1/10至1/8000的范围在蒸馏的去离子H2O或蒸馏的去离子H2O中的0.1％TFA中大量稀释。在15000m/z至100,000m/z的质/荷比范围以单电荷离子检验所得谱。
优选使用芥子酸作为基质生成谱并且特征性的谱表示存在血红蛋白病并且可筛查/诊断所有镰状细胞疾病、α和β地中海贫血。
背景
血红蛋白病是世界上最大的一组遗传人单基因病并且是由于编码形成α2β2-杂四聚体复合物-血红蛋白的球蛋白的基因中的一种或多种中的突变，该杂四聚体复合物在血红细胞中结合氧。患者中产生的结构变化(Hb)可能是临床上温和的，甚至隐藏的，是严重慢性发病甚至新生儿死亡的原因。
在阿拉伯国家，血红蛋白病是最常见的遗传疾病；报道了1-11％的β-地中海贫血，1-58％的α-地中海贫血以及0.3-30％镰状细胞性状的携带者频率。
在印度，最常见的血红蛋白病是镰状细胞性状，Hb D和Hb E。据估计，在2000年，对于10亿人口和千分之25的出生率，在印度每年会有约4500万携带者和约15000个婴儿患有血红蛋白病。
血红蛋白本身应该是含有与2个β基因球蛋白结合的2个α基因球蛋白产物的杂四聚体复合物。组分球蛋白的遗传和蛋白质生物化学是复杂的：人β-球蛋白基因座由位于染色体11的短区域上的5个基因组成，负责产生血红蛋白的β部分。这种基因座不仅含有经典表达的beta(β)球蛋白基因的基因，也含有delta(δ)、gamma-A(Aγ)、gamma-G(Gγ)、和epsilon球蛋白(ε)的基因。人α-球蛋白基因簇发现于染色体16上并且含有表达的球蛋白基因Alpha 1(α1)和Alpha 2(α2)和Zeta(ξ)(参见图1)，但是最近已经鉴定到称为Hb Mu(μ)的新α-球蛋白基因。随着人的生命从早期胎儿到晚期妊娠，出生和婴儿/成年生命，α和β基因配对变化以匹配子宫内和子宫外生命的环境。
例如，妊娠头三个月期间，非常早期的配体由卵黄囊中形成的血红干细胞产生Hb组合ξ2ε2(Gower)；α2ε2(Gower II)和ξ2γ2(Portland)。在中三个月和末三个月期间，其被胎儿肝脏的血红干细胞产生的α2γ2(HbF)迅速代替。在出生之后，这变为主要α2β2(HbA)，一些α2δ2(HbA2)和痕量的HbF(参见图1)。
并不令人意外的是，根据杂四聚体血红蛋白复合物的特性而不是分离的球蛋白的特征来命名鉴定的各种血红蛋白病。在镰状细胞疾病中，血红蛋白Hb S是其中球蛋白基因β在β球蛋白的6位处有特定的氨基酸变化突变β6Glu-Val并且被称为Sβ；并且杂四聚体Hb是α2Sβ2。镰状细胞性状是由杂合性导致的红细胞组成血红蛋白分子内的正常β和Sβ的复合物，并且通常不被注意。
血红蛋白C(HbC)是由β-球蛋白链的6位处的氨基酸取代(β6Glu-Lys)导致的正常血红蛋白(HbA)的结构变体。除了出现在相同位置(HbS；β6Glu-Val)的血红蛋白S和血红蛋白E(HbE，β26Glu-Lys)以外，其是全球最普遍的异常血红蛋白突变之一。在HbC杂合个体(AC)中，这种性状是无症状的。纯合性(CC)导致临床上温和的溶血性贫血，由于可能导致晶体形成的血红细胞的溶解性降低。HbC在与HbS(镰状-血红蛋白C疾病)组合遗传时显示主要临床显著性。
由于使β-球蛋白基因(β-地中海贫血)或α-球蛋白基因(α-地中海贫血)中任一个的表达受阻的突变而出现地中海贫血。因此，出现异常杂和纯四聚体Hb配对。
在β-地中海贫血中，β球蛋白合成减少(β+-地中海贫血)或不存在β球蛋白合成(β0-地中海贫血)。临床温和形式的β-地中海贫血被称为中间型地中海贫血。还存在δβ-地中海贫血，其产生自基因融合并且β和δ链的产生都受损。球蛋白链合成中的失衡(α-球蛋白链多于β-链)导致α-球蛋白在红细胞中沉淀，这导致骨髓或外周血中细胞的过早破坏。过量的α-球蛋白对于细胞非常有破坏性；生成活性氧物质(ROS)，其破坏红细胞前体中的细胞蛋白质、脂质和核酸。另外，四聚体-α血红蛋白是结构不稳定的，具有在氧化后变性的趋势，由沉淀的α-球蛋白链、游离血红素、卟啉和铁填充胞质和细胞膜，其进一步扩大ROS产生。红系细胞具有降解过量游离α-球蛋白的蛋白水解途径，但是这些途径可能被破坏。
在α-地中海贫血中，α球蛋白基因的表达缺失；但是由于人具有4个基因拷贝(每个母体染色体上2个，参见图1)，存在更大的耐受能力。然而，这也意味着对携带者而言同等更大的容量，并且因此这造成了在限定人群中α-地中海贫血的更高发生率。因此，这种情况在亚洲非常频繁地发生；从印度到中国，包括东南亚，并且也发生在中东和非洲。
3个α基因有功能-患者是没有症状或迹象的沉默携带者(α-地中海贫血最小α-/αα)。
仅2个α基因有功能-患者是沉默携带者，很少α-地中海贫血或有α-地中海贫血性状，但通常有小红细胞症。这2个基因可出现在相同染色体(顺式)或一对中各自(反式)上。αα/--(α0地中海贫血)或α-/α-(α+地中海贫血)。往往在亚洲血统的个体中发现顺式α0地中海贫血性状，而往往在非洲血统的个体中出现反式α+地中海贫血。如果母亲是α0地中海贫血的携带者，她的后代处于巴氏胎儿水肿综合征的风险中，而α+地中海贫血的母亲的后代的可能最坏结果是一种温和得多的病症，Hb-H疾病。
只有1个α基因有功能(α-/--)。产生过量的β-球蛋白，过量的β-球蛋白形成四聚体并且以β4沉积(HbH)。HbH是不稳定的且是热不稳定的，患者无精打采并且脾肿大。
没有功能性α基因会导致早期胎儿死亡：过量的γ-球蛋白链导致包含4个γ链的四聚体：γ4的沉积(Hb巴氏)。在没有α-球蛋白链的情况下，可能没有HbF或成人血红蛋白(HbA，HbA2)并且产生死胎的胎儿水肿。后代的毒血症风险增加，并且在携带者α0地中海贫血母亲中产后出血的风险增加。
HbCS(Hemoglobin Constant Spring)突变。沉默携带者状态的一种异常情况是携带HbCS突变的个体。这是一种由于终止密码子突变导致的异常延长的α-球蛋白。具有这种突变的个体具有正常的血红细胞指数，但是如果父母的另一方有α-地中海贫血性状，则孩子可能患有HbH-CS病。
因此，特定球蛋白/基因的物理化学特性和分子遗传学是血红蛋白病的分子检测基础。
α球蛋白的分子量是15，128并且β球蛋白是15,868；存在约740da的差异。因此，α或β球蛋白的Hb与其血红素的纯四聚体复合物(60,000至68,000Da)和衍生的三聚体(约47,500Da)和二聚体(30,000至35,000Da)质量上分别差2960、2220和1480Da。这些质量分辨都在MALDI-ToF质谱的范围内。通常，MALDI-ToF质谱的过程将这类血红蛋白复合物解离成3个单体。福尔马林处理通常通过经赖氨酸残基侧链形成内部交联来“固定”蛋白质，该侧链与相邻酰胺键的游离氢形成甲基桥连。然而，福尔马林将仅在蛋白质天然互相非常靠近，并且正确的氨基酸侧链基团紧靠着对齐时在它们之间交联。对于血红蛋白的四聚体复合物而言正是如此。因此，用福尔马林溶液，如柠檬酸盐缓冲的甲醛盐水预处理全血将“固定”Hb复合物，使得其不再解离并被MALDI-ToF MS分辨为四聚体、三聚体和二聚体复合物的特征性m/z。因此，任何特定地中海贫血的质量图案特征可作图并用作本文所述的地中海贫血的诊断/筛查工具。
本申请提供了检测血红蛋白病的方法，包括使获自对象的血液样品经过直接质谱分析。
“直接质谱分析”指的是所述方法中采用由质谱分析产生的数据，而非样品中存在的组分的推断质量。
本文使用的血红蛋白病是指由遗传突变导致的任何病症，其导致血红蛋白分子中球蛋白分子之一的异常表达或结构。血红蛋白病的示例包括，但不限于，镰状细胞贫血、α-地中海贫血、β-地中海贫血、HbAG、HbA/Enfield、HbH、HbAF、HbS、HbC、HbE，HbD-Punjab，HbO-Arab、HbG-Philadelphia、Hb Constant Spring、Hb Hasharon、Hb Korle-Bu、Hb Lepore、HbM、和Hb Kansas。优选的血红蛋白病是镰状细胞贫血、α-地中海贫血、β-地中海贫血、HbC、HbE、HbAG、HbA/Enfield、HbH、和HbAF。
血液样品可以是使用常规静脉切开术方法收集的全血样品。例如，可通过微静脉穿刺或以针刺样品获得样品，如指穿刺或脚跟针刺。血液样品可以是在滤纸或其他合适的血液点捕获材料上捕获的干燥血液点。
血液样品可以是未处理的样品。或者，血液样品可经稀释或处理(浓缩、过滤等)。
血液样品优选与裂解剂混合以裂解红细胞或在裂解之前初始与交联剂如柠檬酸盐缓冲的福尔马林混合持续多至24小时。其他合适的裂解剂是本领域技术人员已知的。裂解剂可以合适的浓度如1/1(即，1份血液对1份裂解剂)、1/5、1/10或1/20或更大与样品混合。如果血液样品是干燥血液点，其上样品经干燥的血液点捕获材料可置于裂解剂或柠檬酸盐缓冲福尔马林中以重建该样品。或者，在福尔马林固定之前，血液点可在合适的缓冲液中重建，之后裂解或直接裂解。合适的缓冲液和其他蛋白质交联剂是本领域技术人员已知的。优选的裂解剂是去离子蒸馏水。或者，可冷冻样品以裂解细胞。
优选的交联剂是柠檬酸盐缓冲的甲醛盐水。样品优选以1/5的浓度与含福尔马林的试剂混合(即，1份血液至5份柠檬酸盐缓冲的甲醛盐水)。使样品反应合适的时间以使红细胞的球蛋白分子固定。例如，混合物可放置4、5、6、7、8、10、12、16、20、24小时或更久。样品优选放置最少6小时。
优选地，血液样品优选在裂解后稀释。该稀释步骤从血液的其他组分中有效纯化Hb用于质谱分析，因为Hb是最丰富的蛋白质。血液样品能以1/10(即，一份样品在10份稀释剂中)、1/166、1/333、1/500、1/1000、1/200、1/2500、1/8000或更大比例稀释。最优选地，所述样品以1/2000，即一份血液样品在2000份稀释剂中，稀释。优选地，稀释剂是含0.1％三氟乙酸的蒸馏去离子水，或蒸馏去离子水。
优选地，血液样品在固定、裂解和稀释之间未经处理。换而言之，血液样品仅经裂解和稀释；或固定、裂解和稀释。所述处理包括浓缩感兴趣蛋白质(例如Hb)；通过例如HPLC分离Hb，或用化学剂处理以干扰或断裂分子内键。具体而言，所述样品优选不用还原剂处理。更优选地，所述样品不用二硫苏糖醇(DTT)处理。
优选地，该方法可包括比较来自对样品的所述直接质谱分析的图案与从对来自正常健康对照的血液样品的直接质谱分析获得的质谱图案来确定来自所述样品的所述图案是否指示血红蛋白病。本文所用“正常健康对照”是没有血红蛋白病的对象。
优选地，通过自动化定量法来确定质谱的图案，其可区分来自正常健康对照的血液样品的质谱和来自血红蛋白病对象的血液样品的质谱图案。
本文中所用的“自动化定量法”指的是通过计算机软件程序处理由检测样品的质谱仪直接输出的数据。
生成质谱，如MALDI-Tof MS的方法通常不是定量技术。例如，这些谱中的Y轴是谱中质谱峰的“相对强度”的指标，但并不是一个样品与另一样品之间的质量峰的指标。为了克服该不足，需要标准化以使样品谱之间的Y轴值相当。因此，从直接质谱分析获得的谱优选经标准化。该谱经过数据处理，其产生标准化的统计学确定的质谱的相对比例指数。这将定性质谱转化成定量值。标准化是产生数据结构以减少数据重复和不一致性的过程。可采用若干种标准化技术。典型的标准化方法包括给定点处的总面积百分数、方差算法和比率差异。百分数差计算如下
百分差异＝(Y1-Y参比/Y参比×100％)
其中Y参比是谱中最小Y值，而Y1是各点的Y值。
方差计算如下
方差＝(Y1-Y参比)2
比率差异计算如下
比率差异＝(比率1-比率2)。
因此，来自质谱的数据经控制以提供对于质谱上所见定性变化的定量度量。
优选地，该谱模型通过数据处理方法产生，所述数据处理方法产生给定范围内质谱的相对比例的标准化的统计学确定指数。这使所有谱相当，从而能够对任何给定质量值的中值和百分位数变化建模。优选地，所述范围是约6,000-700,000m/z。
对于球蛋白的单价形式，检验的范围是6,000-17000m/z，更优选7,500-16,200m/z。可测量单电荷和/或双电荷红细胞球蛋白分子。对于单电荷离子，检验了15000m/z至16200m/z的质/荷比范围处的谱。对于双电荷离子，检验了5000至8200m/z，优选6000至8100m/z，更优选7550至8200m/z或7550至8200m/z的质/荷比范围处的谱。下标列出了对应于双电荷离子的各种球蛋白的相应峰的位置。
对于球蛋白的单价形式，检验的范围是30000至700000m/z。
给定范围内质谱的相对比例的标准化的统计学确定指数可采用质谱曲线下总面积来计算。然后，这可用于计算相对强度。
通过将质谱分割成多个给定m/z数字的箱来计算质谱的曲线下面积。本文所用的“箱”具有其通用统计学意义，例如，是一系列范围的数值之一，在统计学分析中，数据被分选到其中。例如，所述箱的大小可以是100m/z、50m/z、25m/z、10m/z或5m/z。所用箱的大小越小，该方法越精确。
相对强度(Y轴值)可通过“方差”法计算，因而各箱中给定的Y值相当。在该方法中，从各箱Y值减去谱中最小Y值(Y参比)，并且将该差值平方化。用于计算方差的式子＝(y1-y参比)2，并且计算出的方差随后称为“相对强度”。
可使用市售统计学测试如Stats DirectTM和Origin 8TM来捕获样品中各质量箱处的相对强度。
一旦谱已经过产生标准化的统计学确定的质谱的相对比例指数的数据处理方法，可通过测量对应于各种球蛋白的峰的相对高度来确定存在的球蛋白的水平。优选地，所述范围是约6,000-700,000m/z。对于球蛋白的单价形式，检验的范围是5,000-8,200m/z，优选6,000-17000m/z，更优选7,500-16,200m/z。对于双电荷离子，检验了5,000-8,200m/z或6000至8100m/z，更优选7550至8100m/z或7,550至8,200m/z的质/荷比范围处的谱。
优选地，从对样品的直接质谱分析获得的谱与从来自正常健康对照的血液样品集合的统计学分析确定的约6000-700000m/z或6000-100000m/z的预期质量的参考谱模型比较。“参考谱模型”是从正常健康对照获得的血液样品集合的统计学分析确定的设定范围内的预期质量。优选地，所述范围是约6,000-700,000m/z。对于球蛋白的单价形式，检验的范围是6,000-17000m/z，优选7,500-16,200m/z，更优选5,000-8,200m/z。对于双电荷离子，检验了5,000-8,200m/z或6000至8100m/z，更优选7550至8100m/z或7,550至8,200m/z的质/荷比范围处的谱。优选地，从来自正常健康对照的血液样品集合的统计学分析确定约5,000-8,200m/z或6,000-8,100m/z的预期质量的谱模型。
优选地，该谱模型通过数据处理方法产生，所述数据处理方法产生给定范围内质谱的相对比例的标准化的统计学确定指数。这使所有谱相当，从而能够对任何给定质量值的中值和百分位数变化建模。优选地，所述范围是约6,000-700,000m/z。更优选地，范围是5,000-8,200m/z或6000至8100m/z，最优选7550至8100m/z或7,550至8,200m/z。
优选地，从对样品的直接质谱分析获得的谱与从来自患有血红蛋白病的对象的血液样品集合的统计学分析确定的约6000-300000m/z的预期质量的疾病模型比较。平行“疾病”模型是从已经患有血红蛋白病的对象获得的血液样品产生的设定范围内标准化的统计学确定的质谱的相对比例指数生成。优选地，所述范围是约6,000-700,000m/z。更优选地，范围是5,000-8,200m/z或6000至8100m/z，最优选7550至8100m/z或7,550至8,200m/z。
在应用标准化技术之后，比较了从正常健康对照获得的样品和来自患有血红蛋白病的对象的样品的谱值。由于球蛋白内突变导致的质量偏移，血红蛋白病的存在导致标准化的谱的峰图案的变化。
患有镰状细胞贫血的对象具有7920m/z处的Sβ的峰，其明显与7934m/z处的β-球蛋白和约7933m/z的Cβ清晰分辨。因此，在7920m/z处存在Sβ峰指示镰状细胞贫血。
在具有遗传持续的胎儿血红蛋白的血液样品，HbAF的对象中，7934m/z处的β-球蛋白强度显著降低，并且对应于8005m/z处的Aγ的峰显著升高。也可看到7965和7996m/z处的δ和Gγ球蛋白的基线升高。因此，存在8005m/z处对应于Aγ的峰指示HbAF。
在HbAG中，在α68Asn-Lys处存在突变。这产生了7612和7645m/z处的额外峰，其可表示α-球蛋白ξ和新发现的μ。在7993m/z处也可能存在升高的Gγ。因此，在7612和7645m/z处存在峰，任选地与在7993m/z处升高的Gγ一起可指示HbAG。
HbA/Enfield是α89His-Glu突变。具有这种病症的对象具有7612和7645m/z处的额外峰，其可表示α-球蛋白ξ和新发现的μ-球蛋白。7963m/z处的δ和7993m/z处的Gγ也可能升高。因此，在7612和7645m/z处存在峰，任选地与7963m/z处的δ和7993m/z处Gγ的升高一起可指示HbA/Enfield。
具体地，从正常健康对照获得的样品与来自患有血红蛋白病的对象的那些样品的标准化的谱值之比可比较并且进行统计学分析，使得能计算各种测量值，例如，平均值、标准偏差、偏度、上四分位数和下四分位数、中值、峰度以及第95和第5百分位数。
可使用市售统计学测试如Stats DirectTM和Origin 8TM来获取从正常健康对照获得的样品和从患有血红蛋白病的对象获得的那些样品之间在各质量箱处的相对强度差异。
然后通过绘图比较参比谱模型和疾病模型，以鉴定“热点”，即，两种模型之间的差异点。这可以是峰大小的减小或增大，或峰的外观。然后能用差异点确定存在血红蛋白病。优选地，这采用合适算法完成。
该质谱分析能够采用合适的计算机软件程序轻松计算。也可采用合适的算法对计算机编程，以提供存在血红蛋白病的指示。
优选地，所进行的质谱分析是基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-ToF MS)。
当使用交联剂时，可采用存在的四聚体、五聚体和三聚体与二聚体相比的相对百分比丰度来诊断存在血红蛋白病。存在两种形式的四聚体-仅含球蛋白的S-四聚体以及含有血红素和球蛋白的L-四聚体。固定的S-四聚体与固定的二聚体相比的平均相对丰度≥10，优选≥15和/或固定的L-四聚体与固定的二聚体相比的平均相对丰度≥6，优选≥10指示存在血红蛋白病。一旦实现这一结果，患者可经过进一步研究以鉴定存在的特定血红蛋白病。
还描述了检测血红蛋白病的方法，包括：
a)从对象获得血液样品
b)对所述样品进行稀释和裂解；或固定、稀释和裂解
c)对该样品进行直接质谱分析
d)检验来自所述分析的图案以确定来自对象的所述样品的所述图案是否指示血红蛋白病。
优选地，来自分析的谱图案与从正常健康对照的血液样品的获得的质谱图案比较。
在本说明书中，术语“包含”具有其常规字典含义，以表示非排他性涵盖。即，词语“包含(包括)”(或其任何衍生形式)用于涵盖一个或多个特征，不排除还涵盖其它特征的可能性。词语“优选的”(或其任何衍生形式)指示一个或多个特征是优选但非必需的。
本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有或任意特征和/或如此公开的任意方法或工艺的所有或任意步骤可以任何方式组合，除了其中至少一些此类特征和/或步骤相互排斥的组合。
除非另有说明，本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的各特征可由具有相同、等同或类似目的替代性特征替换。因此，除非另有说明，所公开的各特征仅仅是一系列等同或相似特征的一个示例。
本发明不限于上述实施方式的细节。本发明延伸至本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)所公开特征的任一新型种类或任何新型组合，或者延伸至如此公开的任何方法或工艺步骤的任一新型种类或任何新型组合。
现参考下述附图，以下述实施例描述本申请。
图1显示了在人中发现的以有功能的方式表达的β和α-球蛋白基因的简化图示(省去了基因簇内的已知假基因)。
图2显示了HbA全血的谱
图3显示了HbAS的谱
图4显示了HbAC的谱
图5显示了HbAC的谱
图6显示了HbAE的谱
图7显示了HbF的谱
图8显示了HbH的谱
图9显示了HbAG的谱
图10显示了HbA/Kenya的谱
图11显示了表型正常和异常的样品的谱的列表比较。
图12显示了福尔马林固定的纯化的HbA和福尔马林固定的全血HbA的30000至70000m/z的质谱图案。
图13显示了福尔马林固定的镰状细胞疾病(SSD)血液样品的谱。
图14显示了表型正常和异常的样品的福尔马林固定的谱的列表比较。
实施例1
方法
样品处理
在用ddH2O(1∶1v/v)初始裂解样品之后，全血的最优稀释为在ddH2O或含0.1％TFA的ddH2O中1/1000至1/2000。该稀释步骤从血液的其他组分中有效纯化Hb用于质谱分析，因为Hb是最丰富的蛋白质。另外，在ddH2O(或0.1％TFA/ddH2O)中的稀释解离了组成性球蛋白用于通过MALDI-ToF质谱的分辨分析。
高于1/8000的稀释产生逐渐变弱的质谱信号。
MALDI ToF质谱分析
最优基质是芥子酸(SA)、阿魏酸(FA)和α 4-氰基羟基肉桂酸(CHCA)。芥子酸作为优选的基质混合或者用作1/1000至1/8000稀释的样品(最优1/2000)的混合液滴的预涂层。
MALDI钢板(384孔)如下制备：吸移0.5μ1基质溶液(芥子酸-20mg/ml，溶解于50/50v/v乙腈(ACN)/ddH2O和0.1％三氟乙酸(TFA))，并使其干燥。0.5μ1样品与SA混合并点样到干基质上。允许其室温干燥1小时，然后进行MALDI TOF MS分析。
采用Shimadzu Axima plus MALDI质谱仪进行质谱分析；氮脉冲激光器(λ最大＝337nm)以75-80％任意单位功率喷射。所示离子以20kV电场以1.2m线性管向下加速，并用微通道板探测器以500MHz的取样速率进行检测。谱通过加和20-30个激光射击来产生。采用延迟引出的正线性模型，以获取谱。
该设备经内部校准，其中用10皮摩尔/ul细胞色素C(1∶2，v/v)掺入1/1000稀释的血液样品。产生的两点校准在[M+H]+＝12361m/z和[M+2H]2+＝6181m/z处。
收集并分析6000至17000m/z的质谱区域，并且具体检验6000至8100m/z或6000至8200m/z的范围中双电荷球蛋白。
这些都相对于质心质量分配和相对峰强度而表征为检验的谱范围中相对标准化峰高度或标准化峰面积。
结果
鉴定球蛋白
在对应于[M＝2H]2+离子的6000-8100的m/z范围中实现最佳分辨。
病理样品谱图案
作为在存在血红蛋白病的所有样品中的普遍发现，观察到对应于突变或胎儿球蛋白基因的峰。对于不受影响的血液样品而言并非如此。
正常成年Hb样品显示α-球蛋白和β-球蛋白的峰，很少检测到在HbA2和HbF中发现的其他球蛋白(δ，Gγ和Aγ)。(图2)。
HbS-镰状细胞病(图3和4)
来自患有镰状细胞性状(HbAS)的患者的血液样品显示了正常和SA加合的α-球蛋白峰并且从7934m/z处的β-球蛋白和约7933m/z处的Cβ清楚地分辨7920m/z处Sβ的峰。对7965和7996m/z处的δ和Gγ球蛋白的基线升高是明显的，如8023m/z处的新峰。
HbAC(图5)
来自携带HbC性状的患者的血液样品显示单个正常和SA加合的α-球蛋白峰。7965和7996m/z处的δ和Gγ球蛋白的基线升高是明显的，但是7934m/z处β-球蛋白无法从约7933m/z的Cβ分辨。
HbAE(图6)
来自携带HbE性状的患者的血液样品显示单个正常和SA加合的α-球蛋白峰。7965和7996m/z处的δ和Gγ球蛋白的基线升高是明显的，但是7934m/z处β-球蛋白无法从约7933m/z的βE分辨。
HbAF(图7)
遗传持续的胎儿血红蛋白血液样品，HbAF，显示单个正常和SA加合的α-球蛋白峰。7934m/z处的β-球蛋白的强度显著降低并且8005m/z处的Aγ显著升高。也看到7965和7996m/z处的δ和Gγ球蛋白的基线升高。
HbH病(α-/--)α-地中海贫血(图8)
来自HbH的血液样品显示在7564和7667m/z处的单个正常和SA加合的α-球蛋白峰。β-球蛋白在7934m/z处明显并且7996和8017m/z处的Gγ和Aγ球蛋白的基线升高是明显的。
表达的α-和β-球蛋白突变(图9和10)
由α球蛋白在α68Asn-Lys处的突变导致HbAG。在7564m/z处看到α-球蛋白，在7667m/z看到SA加合的α，但在7612(未知)和7645m/z(糖化α-球蛋白)处看到其他峰。7933m/z处的β球蛋白伴随这7993m/z处Gγ升高。
HbA/Kenya表型是类似显示的Gγ和β的融合体。在7564m/z处看到α-球蛋白，在7667m/z处看到SA加合的α，但在7961m/z处看到其他峰，这与7963m/z处的δ峰一致，可能表示融合β球蛋白。7933m/z处的β球蛋白伴随7993m/z处Gγ的升高。
表型正常和异常样品的比较(图11)
检验了另外9个表型正常的血液样品和9个表型异常的血液样品(纯合HBS镰状细胞病，杂合HBSC镰状细胞病，2个表型α地中海贫血性状，β-地中和贫血和β-地中海贫血性状和HbE病)。
所有血红蛋白病患者和携带者的特征是与不受影响的个体相比升高比例的δ-球蛋白、γ-(G和A)球蛋白和标记物m/z 8088(可能ε-球蛋白)。另外，与不受影响的表型正常的血液样品(参见表3)平均相比，在受影响者和携带者中β-球蛋白与α-球蛋白的比率较低。这可能反映了从β-球蛋白基因簇中产生的转录变化，从而如证明的那样额外表达δ和胎儿球蛋白。
可通过主要β-球蛋白峰质量偏移至7921m/z来检测到典型sβsβ纯合子，而sβcβ镰状细胞病显示明显较低的7921m/z峰但β(cβ)球蛋白的7936m/z处的主要峰，这与镰状携带者相似。然而，sβcβ镰状细胞病具有升高的δ和γ-球蛋白以及标记物质量(即，8088m/z，可能ε-球蛋白)。
表型β-地中海贫血和β-地中海贫血性状样品都表征为8088m/z处升高的异常峰(可能ε-球蛋白)，中等升高的δ-球蛋白和降低的β/α球蛋白比率。这种图案与HbE病相似，但是看到更明显的δ-球蛋白升高。
α地中海贫血性状的2个表型样品都显示在8088m/z处升高的异常峰(可能ε-球蛋白)，升高的δ和γ球蛋白。
实施例2-福尔马林固定的样品
方法
样品处理
全血样品以1份对5份与柠檬酸盐缓冲的甲醛盐水混合最少6小时。然后在ddH2O或含0.1％TFA的ddH2O中以1/166至1/333稀释。该稀释步骤从血液的其他组分中有效纯化Hb用于质谱分析，因为Hb是最丰富的蛋白质。
高于1/8000的稀释产生逐渐变弱的质谱信号。
MALDI ToF质谱分析
最优基质是芥子酸(SA)、阿魏酸(FA)和α4-氰基羟基肉桂酸(CHCA)。芥子酸作为优选的基质混合或者用作1/1000至1/8000稀释的样品(最优1/2000)的混合液滴的预涂层。
MALDI钢板(384孔)如下制备：吸移0.5μl基质溶液(芥子酸-20mg/ml，溶解于50/50v/v乙腈(ACN)/ddH2O和0.1％三氟乙酸(TFA))，并使其干燥。0.5μl样品与SA混合并点样到干基质上。允许其室温干燥1小时，然后进行MALDI TOF MS分析。
采用Shimadzu Axima plus MALDI质谱仪进行质谱分析；氮脉冲激光器(λ最大＝337nm)以80-100％任意单位功率喷射。所示离子以20kV电场以1.2m线性管向下加速，并用微通道板探测器以500MHz的取样速率进行检测。谱通过加和20-30个激光射击来产生。采用延迟引出的正线性模型，以获取谱。
30,000至70,000m/z的质谱区域被收集并分析。这些都相对于质心质量分配和相对峰强度而表征为检验的谱范围中相对标准化峰高度或标准化峰面积。
样品谱图案
作为普遍发现，发现了对应于分离的单体球蛋白、二聚体、三聚体和四聚体以及复合物如五聚体的峰。对应于组合的二聚体、三聚体、四聚体和较大复合物的宽峰的质量分布或单个峰，对应于各种球蛋白对(即对于二聚体而言，αβ、αα、ββ、αδ、αAγ、αGγ等)的相对质量表示。类似地，在宽峰内的大复合物质量分布代表单个球蛋白的三聚、四聚、五聚和其他复合物组合的相对组成。
福尔马林固定的HbA和全血样品(图12)。
正常纯化的成年HbA样品显示α-球蛋白和β-球蛋白的峰，没有检测到在HbA2和HbF中发现的其他球蛋白(δ，Gγ和Aγ)。检测到球蛋白的聚体寡聚配对，二聚体中心最大31396m/z对应于α-β；47308m/z的三聚体中心最大对应于ααβ和αββ；四聚体中心最大62858m/z对应于αβββ；并且包括77732m/z的无中心质量最大的五聚体复合物对应于ααααα。
用福尔马林固定，然后裂解的全血类似地显示单体球蛋白(15000至17000m/z)，Hb二聚体(31000-33000m/z)，Hb三聚体(45,000-45800m/z)，Hb四聚体(61000-64000m/z)和四聚体加4个血红素辅单元(66,000-68000m/z)。
表型正常和异常样品的比较(图13和14)
检验了另外9个表型正常的血液样品和9个表型异常的血液样品(纯合HBS镰状细胞病，杂合HBSC镰状细胞病，2个表型α地中海贫血性状，β-地中和贫血和β-地中海贫血性状和HbE病)。
全部血红蛋白病的特征是改变的福尔马林固定的二聚体球蛋白与四聚体/寡聚体的相对强度比的改变的概况(图13)。这在镰状细胞病中是最显著的(参见图14)，但也在β-和α-地中海贫血中观察到，其包括四聚体/寡聚体之比是未受影响的情况的两倍这一性状。
讨论
临床实验室在鉴定血红蛋白病中所面临的主要问题是结果通常是假定的而不是确定的，因此需要用一种测试来确认或区分来自另一种测试的阳性结果。为了完全筛查人群以确认具体诊断，使用来自以下的几种方法的集合：红细胞镰变测试、血涂片的显微镜检验、Hb电泳、毛细管电泳和高效液相色谱。这些都要消耗大量样品体积、耗费时间和资源。需要更快且低成本的测试，尤其是如果需要引入国家筛查政策时。
结论
可通过MALDI-ToF质谱针对镰状细胞和其他潜在血红蛋白病快速筛查针刺和印迹点。样品经裂解并在水中稀释1000倍或更多。组分球蛋白的双电荷离子被MALDI-ToF MS充分且可重复地分辨以显示Sβ的特征性m/z。此外，通过检测来自胎儿球蛋白的升高的m/z信号来表征其他血红蛋白病。可在应激条件下表达这些胎儿球蛋白，以尝试补偿缺陷型α和β球蛋白基因表达并用作血红蛋白病的生物标记物。然而，如果被福尔马林或其他合适的交联剂固定，并然后被裂解，则显示了组分球蛋白的四聚、二聚配对和任何其他寡聚聚合(示例是三聚体和五聚体)并且可表示α和β地中海贫血的过量和异常α或β球蛋白寡聚配对特征。

Claims (9)

1.获自对象的血液在制备检测血红蛋白病的样品中的用途，包括使所述血液样品经过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-ToF MS)，其中所述谱用于检测双电荷球蛋白,且在5,000-8,200m/z范围中检验获自所述质谱法的谱。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在质谱法之前，所述血液样品与裂解剂混合。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述裂解剂包括福尔马林。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，在质谱法之前，所述样品经稀释。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述血红蛋白病选自镰状细胞贫血、α-地中海贫血、β-地中海贫血、HbAG、HbA/Enfield、HbH、HbAF、HbS、HbC、HbE、HbD-Punjab、HbO-Arab、HbG-Philadelphia、Hb Constant Spring、Hb Hasharon、Hb Korle-Bu、Hb Lepore、HbM、和Hb Kansas。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，获自所述质谱法的谱经标准化。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述用途包括比较来自对所述样品的所述质谱法的图案与从对来自正常健康对照的血液样品的质谱法获得的质谱图案来确定来自所述样品的所述图案是否指示血红蛋白病。
8.如权利要求1-7中任一项所述的用途，其特征在于，从对所述样品的质谱法获得的谱与从来自正常健康对照的集合血液样品的统计学分析所确定的5,000-8,200m/z的预期质量的参考谱模型比较。
9.如权利要求1-7中任一项所述的用途，其特征在于，从对所述样品的质谱法获得的谱与从来自患有血红蛋白病的对象的集合血液样品的统计学分析所确定的5,000-8,200m/z的预期质量的疾病模型比较。
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