CN107209189B - 通过糖化血红蛋白质谱对糖尿病和前驱糖尿病的快速筛选和评价 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用直接质谱分析测量血液样品中非糖化和糖化血红蛋白水平的方法。可使用糖化血红蛋白分子的比例来诊断前驱糖尿病或糖尿病。

Description

通过糖化血红蛋白质谱对糖尿病和前驱糖尿病的快速筛选和 评价
本发明涉及使用直接质谱分析测量血液样品中非糖化和糖化血红蛋白水平的方法。可使用糖化血红蛋白分子的比例来诊断前驱糖尿病(pre-diabetes)或糖尿病。
背景
糖尿病，并且尤其是2型糖尿病，现在是发达世界和发展中世界的公共健康问题。代价高的糖尿病并发症包括心血管疾病、视网膜病、神经病变、和肾病。因此，在检测和评价患者中以及针对国家人口筛选早发糖尿病中都存在明显未满足的医学需求。例如，在2011年，在美国估计有2580万儿童和成年人(占人口的8.3％)患有糖尿病。虽然估计有1880万人已经诊断患有2型糖尿病，大约700万人并不知道它们患有该疾病。基于2005-2008年的血糖测量，疾病控制和预防中心(CDC)报道美国成年人口中35％患有前驱糖尿病，即估计7900万美国成年人处于发展2型糖尿病的风险中。类似地，在英国，在2014年，前驱糖尿病的数量声称已从2003年的11.6％上升至2013年的35.3％。即估计1730万英国成年人估计患有前驱糖尿病。仅在美国，与治疗糖尿病相关的2007年总年度成本为1740亿美元。因此，预防并控制糖尿病及其并发症是全球公共健康挑战并且许多国家医疗系统的头等大事。
常规通过测量血液和尿中的葡萄糖水平来进行糖尿病检测。对于前驱糖尿病，进行葡萄糖耐量测试，其中，在口腔葡萄糖刺激之后，测量一段时间上的血糖水平以监测在水平回到正常之前的最大值和幅度。另外，可平行测量胰岛素水平，然而，葡萄糖耐量测试需要患者入院(admittance as a day patient)。
糖化血红蛋白(Hb)在非酶促糖化途径中形成，从中血红蛋白(Hb)与血浆葡萄糖自由反应，即便其包含在血红细胞内。由于血红细胞在体内循环约100-120天，在其组分被脾脏和肝脏回收之前，测量糖化Hb因此反映了对葡萄糖的累积暴露：正常水平的葡萄糖产生正常量的糖化血红蛋白；随着血浆葡萄糖的平均量增加，糖化血红蛋白的分数也增加。因此，其是在治疗前的数个月中平均血糖水平的标记物。与一次性测试不同，这提供了增加的代谢问题如前驱糖尿病的确凿证据。对糖化Hb的实际测量提供了比食物和血糖日志可靠得多的对患者如何控制其糖尿病的测量。
因此，最近青睐的糖化Hb测试是相对于HbA水平测量HbA1C水平。如此命名HbA1C是因为Hb通常通过从反相高压液相色谱中洗脱来测量并分析。总Hb的色谱分离解析(resolve)了不同类型的血红蛋白，主要是A和A2，与胎儿Hb和这两种类型的疾病变体。少量解析的洗脱峰是称为HbA1C的糖化Hb。HbA1C测量是优选的针对糖尿病和代谢疾病发生的测试，因为糖化Hb是累积的且非患者并发症依赖性的测试。美国糖尿病协会推荐了针对HbA1c的护理点测试，因为其是快速的并且使临床医师立即确定患者状态，改善了患者并发症。最近批准血红蛋白A1C用作诊断工具，并且大于或等于6.5％的HbA1C是诊断的截留点。前驱糖尿病状态被引用为HbA1C>5.7-6.4％。最近在患有2型糖尿病的患者中验证了HbA1C与平均葡萄糖浓度的关系。
然而，一个诊断问题是HbA1C并不适于具有变体Hb或血红蛋白病如镰状细胞表型的患者。这可能是因为糖化Hb的洗脱概况可被变体Hb的洗脱概况遮蔽或者干扰HbA1C免疫试验的差异特异性。
第二个问题是，如WHO 2011报告WHO/NMH/CHP/CPM/11.1，“糖化血红蛋白(HbA1c)在糖尿病诊断中的用途(Use of Glycated Hemoglobin(HbA1c)in the Diagnosis ofDiabetes Mellitus)”所报告，目前的HbA1c试验“在大部分中低收入国家环境中是难以负担的”。
本发明公开了一种用于通过分析血液样品针对糖尿病和前驱糖尿病代谢综合征筛选人口的快速稳健且可负担的方法。
本发明公开了对血液样品的直接质谱分析，其可经裂解并任选在水中稀释100-1000倍。可通过直接质谱分析，如基质辅助的激光解吸飞行时间质谱来解析样品中存在的Hb物质。可例如通过曲线下标准化面积或峰高度来测量从糖化物质-Hbα-球蛋白Glc解析的Hbα-球蛋白链和/或从Hbβ-球蛋白Glc解析的Hbβ-球蛋白。Hb的变体和血红蛋白病经解析并且不影响对糖化Hb百分数的测量，因为Hbα-链和/或Hbβ-链和相应糖化(Glc)直系系同源物可用作糖尿病糖基化的差异标记物。
本发明描述了通过早期检测和监测，辅助控制并降低对国家的社会经济负担的方法。
该方法公开了对全血样品，如针刺样品和血点卡的快速筛选，其经过直接质谱分析，如MALDI–ToF质谱。可在裂解，例如在蒸馏去离子水中，或通过冷冻，并且任选地在例如蒸馏去离子H2O或含0.1％三氟乙酸(TFA)的蒸馏去离子H2O中进行1/10至1/8000(优选1/2000)的大量稀释后进行分析。所得的谱检验为15,000m/z至16,200m/z的质/荷比范围的单电荷离子；和/或7,550至8,100m/z或7,550至8,200m/z的双电荷离子。
●优选在7,564m/z处测量未糖化α-球蛋白
●优选在7,645m/z处测量糖化α-球蛋白
●优选在7,934m/z处测量未糖化β-球蛋白
●优选在8,017m/z处测量糖化β-球蛋白
使用基质，优选芥子酸来生成谱，并且测量α-球蛋白和糖化α-球蛋白、和/或β-球蛋白和糖化β-球蛋白的特征性解析质量峰并且比率确定了糖化球蛋白的相对百分数。确定的相对百分数指示前驱糖尿病、糖尿病和糖尿病患者对之前2-3个月的累积平均血糖的控制。
因此，本发明提供了监测前驱糖尿病或糖尿病的方法，包括使得获自对象的血液样品经过直接质谱分析并确定糖化血红蛋白(Hb)，例如，样品中存在的糖化α-球蛋白和/或糖化β-球蛋白的比例。
“直接质谱分析”指的是所述方法中采用由质谱分析产生的数据，而非样品中存在的组分的推断质量。
前驱糖尿病，也称为边界糖尿病，通常是糖尿病的先兆。其在血糖水平高于正常但不足够高至患者被认为患有糖尿病时发生。其通常描述为正常血糖和糖尿病水平之间的“灰色地带”。如果患者在一段时间禁食之后比正常血糖水平更高，前驱糖尿病也可称为受损禁食血糖(IFT)，或者如果患者在进食后比正常血糖水平更高，则称为受损葡萄糖耐受(IGT)。
血液样品可以是未处理的样品。或者，血液样品可经稀释或处理(浓缩、过滤等)。
血液样品可以是使用常规静脉切开术方法收集的全血样品。例如，可通过微静脉穿刺(venupuncture)或以针刺样品获得样品，如指穿刺或脚跟针刺。血液样品可以是在滤纸或其他合适的血液点捕获材料上捕获的干燥血液点。
优选处理血液样品以裂解红细胞。这可通过在裂解剂，如去离子蒸馏水中以1/1(即，1份血液对1份裂解剂或蒸馏去离子水)的浓度稀释血液样品来进行。或者，可冷冻样品以裂解细胞。如果血液样品是干燥血液点，其上样品经干燥的血液点捕获材料可置于裂解剂，例如，蒸馏去离子水中以重建该样品。或者，血液点可在裂解前在合适缓冲剂中重建。
优选地，血液样品优选在裂解后稀释。血液样品能以1/10(即，一份样品在10份稀释剂中)、1/500、1/1000、1/200、1/2500、1/8000或更大比例稀释。最优选地，所述样品以1/2000，即一份血液样品在2000份稀释剂中，稀释。优选地，稀释剂是含0.1％三氟乙酸的蒸馏去离子水，更优选蒸馏去离子水。
优选地，血液样品在裂解和稀释之间未经处理。换而言之，血液样品仅经裂解和稀释。这类处理包括浓缩感兴趣蛋白质，例如，Hb、α-球蛋白和/或β-球蛋白；通过例如HPLC或用化学剂处理破坏或打断分子内键来分离Hb、α-球蛋白和/或β-球蛋白。具体而言，所述样品优选不用还原剂处理。更优选地，所述样品不用二硫苏糖醇(DTT)处理。
可计算糖化α-球蛋白和/或β-球蛋白的比例，即糖化的α-球蛋白和/或β-球蛋白的百分数。百分数计算如下
≥4％糖化α-球蛋白和≥6％β-球蛋白的水平指示糖尿病。3-4％糖化α-球蛋白和4-6％糖化β-球蛋白的水平指示前驱糖尿病。优选地，在具有血红蛋白病或血红蛋白病性状的患者中计算糖化α-球蛋白的比例。
生成质谱，如MALDI-Tof MS的方法通常不是定量技术。例如，这些质谱中的Y轴是谱中质量峰的“相对强度”的指标，但并不是一个样品与另一样品之间的质量峰之间。为了克服该不足，需要标准化以使样品谱之间的Y轴值相当。因此，从直接质谱分析获得的谱优选经标准化。该谱经过数据处理，其产生标准化的统计学确定的质谱的相对比例指数。这将定性质谱转化成定量值。标准化是产生数据结构以减少数据重复和不一致性的过程。可采用若干种标准化技术。典型的标准化方法包括给定点处的总面积百分数、方差算法和比率差异。百分数差计算如下
百分数差＝(Y1-Y参比/Y参比X 100％)
其中Y参比是谱中最小Y值，而Y1是各点的Y值。
方差计算如下
方差＝(Y1–Y参比)2
比率差异计算如下
比率差异＝(比率1-比率2)
因此，来自质谱的数据经控制以提供对于质谱上所见定性变化的定量度量。
优选地，该谱模型通过数据处理方法产生，所述数据处理方法产生给定范围内质谱的相对比例的标准化的统计学确定指数。这使所有谱相当，从而能够对任何给定质量值的中值和百分位数变化建模。优选地，范围是约7,000-16,500m/z，更优选7,500-16,200m/z，最优选7,500-8,200m/z。可测量单电荷和/或双电荷球蛋白分子。对于单电荷离子，检验了15000m/z至16200m/z的质/荷比范围处的谱。对于双电荷离子，检验了6000至8100m/z，更优选7550至8100m/z或7550至8200m/z的质/荷比范围处的谱。
●优选在7,564m/z±5m/z处测量α-球蛋白
●优选在7,645m/z±5m/z处测量糖化α-球蛋白
●优选在7,934m/z±5m/z处测量β-球蛋白
●优选在8,017m/z±5m/z处测量糖化β-球蛋白
给定范围内质谱的相对比例的标准化的统计学确定指数可采用质谱曲线下总面积来计算。然后，这可用于计算相对强度。
质谱的曲线下面积如下计算：将质谱分为给定数量的m/z的多个箱(bin)。本文中所述的“箱”具有其常规统计学含义，例如，是一系列数值范围之一，其中数据按统计学分析分选。例如，所述箱的大小可以是100m/z、50m/z、25m/z、10m/z或5m/z。所用箱的大小越小，该方法越精确。优选地，箱大小是5m/z。
相对强度(Y轴值)可通过“方差”法计算，因而各箱中给定的Y值相当。在该方法中，从各箱Y值减去谱最小Y值(Y参比)，并且将该差值平方化。用于计算方差的式子＝(y1-y参比)2，并且计算出的方差随后称为“相对强度”。
可使用市售统计学测试如Stats DirectTM和Origin 8TM来捕获样品中各质量箱处的相对强度。可使用(i)α-球蛋白和糖化α-球蛋白和/或(ii)β-球蛋白和糖化β-球蛋白的质量箱的相对强度来计算存在的糖化球蛋白的比例。
一旦谱已经过产生标准化的统计学确定的质谱的相对比例指数的数据处理方法，可通过测量对应于糖化和未糖化球蛋白的峰的相对高度来确定糖化球蛋白的比例。对于单电荷离子，检验了15000m/z至16200m/z的质/荷比范围处的谱。对于双电荷离子，检验了6000至8100m/z，更优选7550至8200m/z的质/荷比范围处的谱。
●优选在7564m/z±10m/z处测量α-球蛋白
●优选在7645m/z±10m/z处测量糖化α-球蛋白
●优选在7934m/z±10m/z处测量β-球蛋白
●优选在8038m/z±10m/z处测量糖化β-球蛋白
该质谱分析能够采用合适的计算机软件程序而被容易地计算。
优选地，所进行的质谱分析是基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-ToF MS)。
还公开了检测前驱糖尿病或糖尿病的方法，包括
a)从对象获得血液样品；
b)对该样品进行直接质谱分析；
c)计算存在的糖化球蛋白的比例；其中糖化α-球蛋白百分数≥4％并且糖化β-球蛋白百分数≥6％指示糖尿病，并且α-球蛋的3-4％的糖化球蛋白百分数和β-球蛋白的3-6％的糖化球蛋白百分数指示前驱糖尿病。优选地，糖化球蛋白的百分数是糖化α-球蛋的百分数，尤其在患有血红蛋白病的对象中。
在本说明书中，术语“包含(包括)”具有其常规字典含义，以表示非排他性涵盖。即，词语“包含(包括)”(或其任何衍生形式)用于涵盖一个或多个特征，不排除还涵盖其它特征的可能性。词语“优选的”(或其任何衍生形式)指示一个或多个特征是优选但非必需的。
本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有或任意特征和/或如此公开的任意方法或工艺的所有或任意步骤可以任何方式组合，除了其中至少一些此类特征和/或步骤相互排斥的组合。
除非另有说明，本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中所公开的各特征可由具有相同、等同或类似目的替代性特征替换。因此，除非另有说明，所公开的各特征仅仅是一系列等同或相似特征的一个示例。
本发明不限于上述实施方式的细节。本发明延伸至本说明书(包括任何所附的权利要求、摘要和附图)所公开特征的任一新型种类或任何新型组合，或者延伸至如此公开的任何方法或工艺步骤的任一新型种类或任何新型组合。
现参考下述附图，以下述实施例描述本申请：
图1显示了12岁男性中正常血液的谱
图2显示了52岁肥胖男性中正常血液的谱
图3显示了患有镰状细胞病HbSC的患者中血液的谱
图4显示了12岁男孩和52岁男性血液谱的重叠。
图5-在9名成年人和7名患有各种血红蛋白病的患者中糖化α-球蛋白和β-球蛋白以及其他球蛋白分子的计算相对量的表
实施例1
方法
样品处理
在用ddH2O(1:1v/v)初始裂解样品之后，全血或干燥血点的最优稀释为在ddH2O或含0.1％TFA的ddH2O中1/1000至1/2000。该稀释步骤从血液的其他组分中有效纯化Hb用于质谱分析，因为Hb是最丰富的蛋白质。另外，在ddH2O(0.1％TFA/ddH2O)中的稀释解离了组成性球蛋白用于通过MALDI-ToF质谱的解析分析。
高于1/8000的稀释产生逐渐变弱的质谱信号。
MALDI ToF质谱分析
最优基质是芥子酸(SA)、阿魏酸(FA)和α4-氰基羟基肉桂酸(CHCA)。芥子酸作为优选的基质混合或者作为1/1000至1/8000稀释的样品(最优1/2000)的混合液滴的预涂层。
MALDI钢板(384孔)如下制备：吸移0.5μl基质溶液(芥子酸-20mg/ml，溶解于50/50v/v乙腈(ACN)/ddH2O和0.1％三氟乙酸(TFA))，并使其干燥。0.5μl样品与SA混合并点样到干基质上。允许其室温干燥1小时，然后进行MALDI TOF MS分析。
采用Shimadzu Axima plus MALDI质谱仪进行质谱分析：氮脉冲激光器(λ最大＝337nm)以75-80％任意单位功率喷射。所示离子以20kV电场以1.2m线性管向下加速，并用微通道板探测器以500MHz的取样速率进行检测。光谱通过加和20-30个激光射击来产生。采用延迟引出的正线性模型，以获取谱。
该设备经内部校准，其中用10皮摩尔/ul细胞色素C(1:2，v/v)掺入1/1000稀释的血液样品。产生的两点校准在[M+H]+＝12 361m/z和[M+2H]2+＝6181m/z处。
收集并分析6000至17000m/z的质谱区域，并且尤其检验7500至8200m/z的区域中双电荷球蛋白。
这些都相对于质心质量分配和相对峰强度而表征为检验的谱范围中相对标准化峰高度或标准化峰面积。
结果
图1，来自12岁男孩的血液球蛋白的谱。
来自正常12岁男孩的血液样品证明具有对应于α和β球蛋白以及相应基质(芥子酸-SA)加合物(参见图1和表1)的明显峰的谱。几乎没有检测到其他球蛋白加合物和其他球蛋白(δ、Gγ、Aγ和ε)(参见表1)。此外，糖化α和β-球蛋白直系同源物在<1％的起源(parent)球蛋白下几乎是不可见的(图1所示)。
图2，来自52岁男性的血液球蛋白的谱。
正常但是肥胖的成年人血液样品显示α-球蛋白和β-球蛋白及其相关的SA加合物的峰。另外，注意到升高的δ-球蛋白与其他α和β-球蛋白加合物，而几乎没有检测到其他球蛋白(Gγ、Aγ和ε)(参见图2和表1)。血液样品显示占起源球蛋白3％和5％的糖化α-球蛋白和β-球蛋白峰。
图3，来自患有HbSc-镰状细胞疾病的患者的血液球蛋白谱。
血液样品来自患有镰状细胞疾病(HbSC)的患者。图3显示了正常和糖化α-球蛋白峰并且从7934m/z处的β-球蛋白和约7933m/z处的Cβ清楚地解析在7920m/z处Sβ的峰。对7965和7996m/z处的δ和Gγ球蛋白的基线升高是明显的，如8023m/z处的新峰。血液样品显示正常且糖化α-球蛋白峰并且强度比较％为1.8％，而糖化β-球蛋白为起源β-球蛋白的6.3％。
图4，52岁男性和12岁男孩的血液球蛋白的比较。
在来自12岁男孩的血液谱上叠加52岁成年男性的血液谱，显示在成年人样品中循环的糖化α和β球蛋白的升高(图4)。
图5，9个成年人谱峰强度与来自7个判定的血红蛋白病患者的谱峰强度的列表比较。
在所有样品中检测到糖化α-链并在表型正常的样品和患有血红蛋白病，包括镰状细胞疾病的那些中清楚解析。糖化β-球蛋白在所有正常样品中明显可区分，但被胎儿球蛋白表达削弱，其通常在所有血红蛋白病中升高(图5)。表示为α-球蛋白强度百分数，对于表型正常的成年人，糖化直系同源物占0.5-3％(平均1.78％，SD 0.79％)；并且对于患有血红蛋白病的那些，包括携带者，糖化直系同源物占1-2.7％(平均2.1，SD 0.57％)。表示为β-球蛋白强度百分数，对于表型正常的成年人，糖化直系同源物占2-5.2％(平均3.15％，SD1.07％)；并且对于患有血红蛋白病的那些，包括携带者，糖化直系同源物占0-9.1％(平均5.1％，SD 2.78％)(参见图5)。
讨论
升高的血红蛋白糖化与血糖调控较弱相关。HbA1c首先在1971年被鉴定为血红蛋白的色谱部分，并且表征为血红蛋白的β-N-1-脱氧果糖基组分的量度。正常水平的葡萄糖产生正常量的糖化血红蛋白。随着血浆葡萄糖的平均量增加，糖化血红蛋白的分数以可预测的方式增加。这用作在测量前3个月的平均血糖水平的标记物，因为这是红细胞的半衰期。
在糖尿病中，表明较弱控制的血糖水平的较高量的糖化血红蛋白已经与心血管疾病、肾病、和视网膜病相关。也已采用监测1型患者中的HbA1c作为改善结果的量度。几种测量“HbA1c”的方法，包括HPLC、免疫试验和毛细管电泳正处于临床应用中。β-球蛋白糖化的量度被大量关注，其测量被胎儿β-状球蛋白表达和β-球蛋白基因突变(如镰状细胞疾病和β-地中海贫血、以及这类突变的携带者中)削弱。然而，最近已经显示升高的糖化与这种血红蛋白病相关并且可能反映了这类受影响的血细胞中对糖化的化学易感性的增加。
本发明的方法清楚地解析了α-和β-球蛋白各自的糖化形式以及相应的非糖化起源。这给出了对血红蛋白糖化的更精细甄别并且不受存在突变或异常球蛋白基因表达的削弱，这可能对测量Hb糖化的其他方法有不利影响。
结论
在ddH2O中1/2000稀释后对液滴或干燥点全血的MALDI-Tof MS谱分析显示解析的球蛋白以及对α和β球蛋白的糖化直系同源物的清楚解析。比较糖化α-球蛋白峰与起源α-球蛋白峰的信号强度代表了针对糖尿病和前驱糖尿病的快速、经济的筛选和监测测试方法。
表1.球蛋白鉴定-在对应于[M＝2H]2+离子的7500-8100的m/z范围中实现最佳解析。

Claims (7)

1.获自对象的血液在制备用于检测前驱糖尿病或糖尿病的样品中的用途，所述检测包括使血液样品经过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-ToF MS)并且确定所述样品中存在的糖化α-球蛋白和/或糖化β-球蛋白的比例，所述确定包括测量糖化α-球蛋白和未糖化α-球蛋白和/或糖化β-球蛋白和未糖化β-球蛋白的双电荷离子的水平，其中获自质谱的谱在6000-8100m/z范围中检验。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述血液样品在所述质谱之前裂解。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述血液样品在质谱之前稀释。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，除裂解和/或稀释以外，经过质谱的样品未经处理。
5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，获自直接质谱的谱经标准化。
6.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，3-4％的糖化α-球蛋白百分数和/或3-6％的糖化β-球蛋白百分数指示前驱糖尿病。
7.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，糖化α-球蛋白的百分数≥4％和/或糖化β-球蛋白的百分数≥6％指示糖尿病。
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