CN103278574A - 利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测糖化血红蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测待测样品中糖化血红蛋白含量的方法。该方法包括如下步骤：1)将标准品溶液和待测样品分别过固相萃取柱，获得待上机样品；2)用液相色谱串联三重四级杆质谱仪对所得待上机样品进行检测；色谱条件如下：色谱柱为C18色谱柱；采用所述流动相A(乙腈)和所述流动相B(甲酸水溶液)进行梯度洗脱；3)从检测结果中得出所述待测样品中糖化血红蛋白的含量。本发明方法与IFCC推荐的方法相比，整个上机检测时间缩短为12min，仪器运行时间减少50％，本发明保证了良好的特异性和准确性，提高了质谱仪利用率，有望作为测定糖化血红蛋白的参考测量方法。

Description

利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测糖化血红蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测糖化血红蛋白的方法，特别涉及一种利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测待测样品中糖化血红蛋白含量方法。

背景技术

糖化血红蛋白（缩写作hemoglobin A1c、HbA_1c、A1C或HbA1c）是血液红细胞中的血红蛋白与葡萄糖结合的产物，可以反映测定前6-8周患者体内平均血糖水平，通常作为监测糖尿病患者体内血糖控制情况与疗效观察的参考标准，一般来说血红蛋白被糖基化的比例与一段时间内体内血糖浓度的水平呈正比。对应的，非糖化血红蛋白用HbA0表示。目前，国际上定义HbA_1c化学构成为葡萄糖稳定的连接在血红蛋白β链N末端缬氨酸(Val)残基上，即血红蛋白（血液）-N-（1-脱氧果糖基）血红蛋白β链(βN-1-deoxyfructosyl-hemoglobin)。

葡萄糖进入红细胞后与血红蛋白HbA的β链N末端缬氨酸残基缩合，先形成一种不稳定的Schiff碱（醛亚胺结构），即前HbA_1c，再解离或经Amadori分子重排后形成HbA_1c（醛酮结构），此反应的过程是缓慢和不可逆的，并且由于红细胞内没有分解醛酮的酶，因此HbA_1c浓度只与红细胞寿命和该时期体内血糖的平均浓度有关，不受运动或食物的影响，反映的是过去6-8周的平均血糖浓度，是目前国际上公认的用于评估糖尿病患者长期血糖状况的金标准。

目前有超过20种不同的方法用于测量HbA_1c，其主要的检测原理主要有如下3种：

（1）离子交换层析法：它是基于不同组分的电荷差异进行分离的。葡萄糖与Hb的β链N末端Val连接降低了等电点，导致糖化Hb带的正电荷比未糖化Hb的少，与树脂的附着力小，可以分别用不同离子浓度的缓冲液在不同的时间将Hb从阳离子交换柱中洗脱下来，再根据每个峰值下的面积来计算HbA_1c占总Hb的比例。但是该方法中Hb变异体会随HbA_1c一起洗脱，影响HbA_1c值，离子交换层析法受温度、pH值、抗凝剂和柱效的影响较大，从而使结果产生偏差。常规的离子交换HPLC法经过多年技术上的改进，检测精密度（CV）<1%、分辨率及抵抗多种糖化血红蛋白变异体的能力有了明显提高，基本可以达到临床需求，美国糖化血红蛋白标准化计划(NGSP)的参考实验室也是使用Bio-Rex70阳离子交换树脂HPLC作为常规实验标准参考方法，但是非特异性的问题仍然不能完全克服。

（2）亲和层析法：用于分离糖化与非糖化血红蛋白的亲和层析凝胶柱是交联了间氨基苯硼酸的琼脂糖珠。硼酸具有与整合在血红蛋白分子上葡萄糖的顺位二醇基作可逆结合反应的性质，致使HbA_1c选择性地结合于柱上，而非糖化血红蛋白被洗脱，然后变换条件，又可以将HbA_1c重新解离，获得纯化。除葡萄糖外，血液中其他糖类都可与硼酸基结合，因此该方法的检测结果为GHb总量，而不是HbA_1c的含量，该方法不受温度、GHb变异体的影响，通过校准，其结果与离子交换法有良好的相关性，已被临床广泛采用。但该实验测定结果受到除血红蛋白β链N末端缬氨酸残基以外糖基化的影响。

（3）免疫法：利用抗原、抗体反应的原理，使用单克隆或多克隆抗体与血红蛋白β-链上糖基化的N末端的4-8个氨基酸作为抗体识别位点，发生凝集反应，通过吸光度来测定凝集量，可用全自动生化分析仪进行检测。该抗原与IFCC参考系统用于制备一级参考物质的β链N末端6个氨基酸肽端极为相似，其参考范围（2.8%～4.9%）比其他方法更低，而与IFCC推荐的（2.85～3.81%）更为一致。但是，当Hb发生第6位氨基酸变异[HbS(β6glu→val)和HbC(β6glu→lys)]时将不会被识别，有报道对此变异进行实验显示，厂家间的检测结果存在着偏倚。2011年，参加卫生部临床检验中心HbA_1c项目的实验室中，离子交换高效液相色谱和免疫比浊法最为普遍，实验室所占比例超过45%和25%，鉴于此，张传宝等对3个基于高效液相色谱和1个基于免疫比浊法原理的HbA_1c测定系统的精密度和正确度进行验证，免疫法批内精密度CV为0.54％～1.02％，室内精密度CV为0.54％～1.17％；测定标准物质的均值(NGSP值)和标准物质定值的偏倚为-0.34％HbA_1c～0.18％HbA_1c，与IFCC定值导出的NGSP值的偏倚为-0.14％HbA_1c～0.05％HbA_1c，批内精密度和实验室内精密度及正确度性能均符合相关要求，认为可以满足临床工作的需要，具有广阔的应用前景。

尽管HbA1C标准化测定的问题早在1984年即已提出，但直到1993年DCCT的结果发布后，才开始受到关注。美国、日本和瑞典等国家都分别建立了HbA_1c国家标准纲要，其中最为“著名”的是NGSP(National Glycohemoglobin Standardization Program)计划。NGSP参考系统是以DCCT数值为基础，把NGSP参考实验室网络中各种实验方法都校准为DCCT参考方法，并建议各实验室只能采用被NGSP认可的方法来检测HbA_1c，使临床实验室的检测结果与DCCT的检测结果更具有相关性，大大减少了各实验室之间的差异。

NGSP主要内容为：NGSP管理委员会下设由中心参考实验室、一级参考实验室和二级参考实验室组成的参考实验室网络，其主要的职责为：（1）负责参与生产厂家的仪器校准；（2）负责对实验室和厂家进行正确度认证；（3）对常规实验室进行能力验证（proficiency test，PT）。自NGSP计划建立以来，美国临床实验室间HbA_1c测定的结果“从混乱进入有序”状态，目前参加NGSP活动的实验室室间CV小于5%，HbA1c结果与NGSP靶值的偏倚小于8%，并且自2005年以后，参加美国病理工作者协会（College of American Pathologists，CAP）HbA_1c室间质评的实验室，95%以上均经过了NGSP认证，经过CAP和NGSP两组织的共同监测，推进了临床实验室关于糖化血红蛋白的检测质量。

1995年，日本糖尿病学会(Japanese Diabetes Society，JDS)采用HPLC方法制备了国家级的校准品(JDS Calibrator lot1)，推荐用于所有的常规糖化血红蛋白检测方法的定标，对HbA_1c检测进行标准化，并且经过几年的努力，日本临床化学学会(JapaneseSociety of Clinical Chemistry,JSCC)采用KO500制备了国家二级校准品(JDS/JSCCCalibrator lot2)，实现了标准物质的溯源性。瑞典临床化学学会(Swedish Society ofClinical Chemistry,SFKK)将MonoS HPLC方法作为国家指定参考方法，推荐用于糖化血红蛋白的标准化。具体实施内容为：每月一次，将乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的新鲜全血样本发放至40家使用HPLC方法的临床医院，其中有5家医院采用Mono SHPLC参考方法，从而达到对常规实验室的能力验证，并且作为重点关注的检验仪器，要求所有的医院每2年至少对糖化血红蛋白仪器进行校准一次。

上述国家级参考方法均采用离子交换色谱法，由于受树脂种类、柱子规格、缓冲液组分、洗脱时间和色谱分辨率不同等原因的影响，检测结果也不同，在美国，DCCT和NGSP使用指定的参比方法，应用Bio-Rex70HPLC和瑞典的Mono S HPLC方法检测HbA_1c，在临界值仍有20%的差异，显然在度量学方面，无法满足参考方法的要求。

国际临床化学组织(IFCC)建立了HbA_1c标准化工作组，旨在研究一个可供追溯的参照系统，研发HbA_1c参考物质和参考方法，该工作组历时5年的探索，经过多家实验室的努力，于2002年推出了一套HbA_1c参考方法，即将待测标本溶血后经胞内蛋白酶酶解，然后应用高效液相色谱串联电喷雾质谱仪或高效液相色谱串联毛细管电泳仪，利用信号比例计算出糖基化的B链N末端六肽片段的比例，从而得出HbA_1c在样本中所占的百分比，是检测HbA_1c分子浓度的新方法。此方法已经由包括欧洲、日本和美国在内的11家IFCC参考实验室验证。IFCC推荐的检测HbA_1c方法的结果与DCCT的结果存在一定差异，其检测值较NGSP的HbA_1c检测值低，两个方法相关系数R为1.000，室内CV为0.47%～2.07%，室间CV为1.35%～2.27%。但是IFCC推荐的检测HbA_1c方法，实验操作比较复杂，耗时较长，仪器昂贵、维护和保养成本较高，目前仍只限于糖化血红蛋白标准化的研究。

由于我国目前HbA_1c测定的方法、实验价格、地区医疗水平的差异等原因，HbA_1c的测定并未普及，HbA_1c作为糖尿病诊断指标也存在亟须解决问题，主要是我国HbA_1c检测方法的标准化程度不够，测定的仪器和质量控制尚不能符合目前糖尿病诊断标准的要求，因此目前暂不推荐应用HbA_1c诊断糖尿病，但是为提高我国糖尿病的诊断、治疗、管理水平，2010年3月，中国HbA_1c教育计划在京启动，该计划是国内首次由内分泌和检验界专家共同参与的大型学术活动，旨在提高HbA_1c在糖尿病管理中的重要地位，加强临床医生对HbA_1c的认识和重视。

我国HbA_1c测定标准化工作起步较晚，目前仍处于初级阶段，但是国内的检验界学者越来越重视糖化血红蛋白测定的量值溯源及标准化问题。卫生部临床检验中心王冬环等建立了高效液相色谱串联电喷雾质谱法准确测量糖化血红蛋白的参考方法(不同浓度血样及国际标准物质批内变异系数CV平均为0.70%，总CV为0.85%，测定国际标准物质，测定值与认定值的偏差为-0.8%～0.25%，并研制了基于质谱方法的糖化血红蛋白国家一级标准物质（GBW09181、GBW09182、GBW09183），这为HbA_1c的准确测量和量值溯源提供了有力的物质保障。

发明内容

本发明的目的是提供一种液相色谱串联三重四级杆质谱仪在检测糖化血红蛋白中的应用，以及具体的利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测待测样品中糖化血红蛋白含量的方法。

本发明所提供的利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测待测样品中糖化血红蛋白（HbA_1c）含量的方法，是在国际临床化学组织(IFCC)推荐的检测方法（参见“Approved IFCC reference method for the measurement of HbA1c in human blood．ClinChem Lab Med，2002，40：78-89．”）的基础上，应用液相色谱串联三重四极杆质谱仪对其进行改进后的方法，具体可包括如下步骤：

（1）前处理：将标准品溶液和待测样品经酶解后分别过固相萃取柱，获得待上机标准品和待上机待测样品；

（2）上机检测：用液相色谱串联三重四级杆质谱仪对步骤（1）所得待上机标准品和待上机待测样品分别进行检测；所述检测中采用的色谱条件如下：色谱柱为C18反向色谱柱；流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；流动相A：乙腈；流动相B：甲酸水溶液；

（3）结果获得：从步骤（2）的检测结果中获得所述待测样品中糖化血红蛋白（HbA_1c）的含量。

在上述方法中，步骤（3）中，所述待测样品中糖化血红蛋白的含量为：将所述待测样品中的糖化血红蛋白（HbA_1c）和非糖化血红蛋白（HbA0）均折合成血红蛋白后，“所述糖化血红蛋白（HbA_1c）折合成的血红蛋白”在“‘所述糖化血红蛋白（HbA_1c）折合成血红蛋白’与‘所述非糖化血红蛋白（HbA0）折合成的血红蛋白’之和”中的比例，具体可为如下（I）或（II）：

（I）HbA_1c折合成血红蛋白的质量/（HbA_1c折合成血红蛋白的质量+HbA0折合成血红蛋白的质量）；

（II）HbA_1c折合成血红蛋白的摩尔数/（HbA_1c折合成血红蛋白的摩尔数+HbA0折合成血红蛋白的摩尔数），并用单位mmol/mol表示，该表示方法与IFCC最终结果表示方法一致，即“IFCC-HbA_1C (毫摩尔/摩尔)”。

在上述方法中，步骤（1）是与所述国际临床化学组织(IFCC)推荐的检测方法相比多出的步骤，该步骤的目的是有效去除所述待测样品中的盐分及其他杂质，保证步骤（2）中上机时的所述待上机样品的清洁度，这样在步骤（2）上机检测时各待测样本之间就不需要较长的仪器冲洗时间，从而有效地节约了整个实验的检测时间。

在本发明的一个实施例中，步骤（1）中所述的固相萃取柱具体为oasis HLB固相萃取柱。

在上述方法中，步骤（2）中，所述流动相中，所述甲酸水溶液中甲酸的含量为每1000ml所述甲酸水溶液中含有1g所述甲酸。

在上述方法中，步骤（2）中，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱具体为：0-7min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为5：95；8-9min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为50：50；10-12min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为95：5。

在上述方法中，步骤（2）中，所述色谱条件的流速可为300μl/min。

在上述方法中，步骤（2）中，所述检测中采用的质谱条件如下：扫描类型为二级质谱（MS2SIM）；毛细管电压为4500V；喷雾气体为氮气；喷雾器压力为30psi；气体流速为11L/min；气体温度为300摄氏度；扫描范围为300-2000M/Z。

在上述方法中，步骤（2）中，在对所述待上机标准品和所述待上机待测样品进行检测时用所述液相色谱串联三重四级杆质谱仪所处的环境中，空气相对湿度小于80%，如20%-50%，温度为20℃～25℃（温度变化小于等于3℃/h），电压波动小于5%。

在上述方法中，步骤（2）中，所述色谱条件的进样量为1-5μl，如1μl。

在本发明的一个实施例中，所述液相色谱串联三重四极杆质谱仪具体为安捷伦科技有限公司生产的1260-6410型液相色谱串联三重四极杆质谱仪（Agilent1260-6410HPLC-triple quadrupole(LC-QQQ)MassSpectrometry）。步骤（2）中，所述C18反向色谱柱具体为ZORBAX SB-C18反向色谱柱（2.1×50mm，1.8μm）；Agilent1260为安捷伦科技有限公司生产的1260-6410型液相色谱串联三重四极杆质谱仪（Agilent1260-6410 HPLC-triple quadrupole(LC-QQQ)MassSpectrometry）中的液相色谱仪。

在上述方法中，步骤（2）中的所述色谱条件与所述国际临床化学组织(IFCC)推荐的检测方法相比，应用所述C18反向色谱柱替代了IFCC推荐的丙氰基柱，应用0.1%（0.1g/100mL）的甲酸水溶液（所述流动相B）替代了三氟乙酸。

在上述方法中，所述标准品为国际有证标准物质IRMM/IFCC466（HbA_1c，糖化血红蛋白）和IRMM/IFCC467（HbA0，非糖化血红蛋白）；具体的，所述国际有证标准物质IRMM/IFCC466和IRMM/IFCC467购自比利时的参考物质与测量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements，IRMM）。其中，所述国际有证标准物质IRMM/IFCC466（HbA_1c，糖化血红蛋白）的纯度≥95%，HbA_1c浓度为934±22mmol/mol（即将该物质折合成血红蛋白后，可折合成1mol血红蛋白的该物质中，平均含有可以折合成934mmol血红蛋白的HbA_1c，以及可以折合成66mmol血红蛋白的HbA0）；IRMM/IFCC466 HbA_1c标准物质总血红蛋白26.2±0.9mg/g（即1g该物质折合成血红蛋白后的质量为26.2mg）；所述国际有证标准物质IRMM/IFCC467（HbA0，非糖化血红蛋白）的纯度为≥99%，HbA0浓度为>976mmol/mol（即将该物质折合成血红蛋白后，可折合成1mol血红蛋白的该物质中，平均含有可以折合成>976mmol血红蛋白的HbA0，以及可以折合成<24mmol血红蛋白的HbA_1c），IRMM/IFCC466 HbA_1c标准物质总血红蛋白119.7±3.7mg/g（即1g该物质折合成血红蛋白后的质量为119.7mg）。

所述标准品溶液为如下系列溶液：将所述国际有证标准物质IRMM/IFCC466（HbA_1c，糖化血红蛋白）和IRMM/IFCC467（HbA0，非糖化血红蛋白）按照不同的质量配比配制成系列标准品混合物后，将所述系列标准品混合物分别进行酶解（如胞内蛋白酶GLU-C）后所得的系列溶液。在本发明的一个实施例中，所述系列混合物中IRMM/IFCC466（HbA_1c，糖化血红蛋白）的实际质量百分含量由小到大依次为0%、14.8%、24.4%、30.8%和37.9%，将混合物中IRMM/IFCC466（HbA_1c，糖化血红蛋白）和IRMM/IFCC467（HbA0，非糖化血红蛋白）的质量按照国际认定证书中的记载均折合成血红蛋白的质量后计算“IRMM/IFCC466折合成血红蛋白的质量/（IRMM/IFCC466折合成血红蛋白的质量+IRMM/IFCC467折合成血红蛋白的质量）×100%”（记作“A1C/(A1C+A0)折合Hb质量百分含量”），以上五个百分数对应的“A1C/(A1C+A0)折合Hb质量百分含量”分别为0%、3.67%、6.60%、8.87%和11.76%。

在上述方法中，所述待测样品为将离体的血液先经溶血处理再进行酶解（如胞内蛋白酶）后所得的溶液。

具体的，在本发明的一个实施例中，所述待测样品是按照包括如下步骤的方法对离体的血液进行处理后得到的：取离体的血液（EDTA抗凝的新鲜全血），去除血浆（可8℃3000g离心10min），沉淀细胞，用NaCl水溶液洗涤（两次）后，用细胞孵育液（浓度为0.15mol/L的NaCl水溶液）37℃孵育4小时（将前HbA_1c转化为HbA_1c）。弃上清后加水制成溶血产物，用由浓度为50mmol/l的MES水溶液与浓度为1mmol/l的EDTA水溶液等体积混合后所得的混合溶液对溶血产物进行稀释，使所述溶血产物中的总血红蛋白的终浓度为50mg/ml，调整pH值至6.2，离心（如3000g，20min）后弃细胞碎片，提取上清液。向所述上清液中加入胞内蛋白酶（GLU-C），进行酶解（所述胞内蛋白酶与所述总血红蛋白的配比为1μg：1mg），37℃，孵育18小时，冷冻2小时终止酶解，获得步骤（1）中所述的待测样品。

所述胞内蛋白酶具体为罗氏诊断公司endoproteinase GLU-C，测序等级，其产品目录号为EC3.4.21.19。

在上述方法中，步骤（3）中，所述“从步骤（2）的检测结果中获得所述待测样品中糖化血红蛋白（HbA_1c）含量”的方法与国际临床化学组织(IFCC)推荐的检测方法一致，即先根据步骤（2）所得的所述待上机标准品的检测结果，绘制标准曲线，再将步骤（2）所得的所述待上机待测样品的检测结果代入所述标准曲线，进而得到所述所述待测样品中糖化血红蛋白（HbA_1c）的含量。

在本发明的一个实施例中，步骤（3）中，所述“从步骤（2）的检测结果中获得所述待测样品中糖化血红蛋白（HbA_1c）含量”的方法，具体包括如下步骤：

（a）标准曲线的绘制：包括如下（a1）和（a2）：

（a1）将所述系列标准品混合物各自的“A1C/(A1C+A0)折合Hb质量百分含量”×100后的数值代入公式（I），替代“HbA_1c%”，从而计算出所述系列标准品混合物各自的rconc值：

HbA_1C %=100×rconc/(1+rconc)     公式（I）

式中，HbA_1C%等于“HbA_1C折合成血红蛋白的质量/（HbA_1C折合成血红蛋白的质量+HbA0折合成血红蛋白的质量）×100”。

（a2）以所述步骤（2）上机检测得到的所述标准品溶液质谱图中HbA_1c与HbA0的峰面积比值（rsig）为横坐标，以步骤（a1）中计算得到的所述系列标准品混合物的rconc值为纵坐标，绘制标准曲线；

（b）待测样品中HbA_1c含量的计算：将所述步骤（2）上机检测得到的所述待上机待测样品质谱图中HbA_1c与HbA0的峰面积比值代入步骤（a）所绘制的标准曲线中，计算所述待测样品的rconc值；再将所述rconc值代入公式（I），计算得到“HbA_1c%”，所述“HbA_1c%”即可表示待测样品中HbA_1c含量。也可接着将所得“HbA1c%”【即HbA_1c折合成血红蛋白的质量/（HbA_1c折合成血红蛋白的质量+HbA0折合成血红蛋白的质量）×100】转化为“HbA_1c折合成血红蛋白的摩尔数/（HbA_1c折合成血红蛋白的摩尔数+HbA0折合成血红蛋白的摩尔数）”【可记作“A1C/(A1C+A0)折合Hb的摩尔比”】，并用单位mmol/mol表示，该表示方法与IFCC最终结果表示方法一致，即“IFCC-HbA_1C(毫摩尔/摩尔)”。两者之间的转化关系为：“HbA_1c%”=10דIFCC-HbA_1C(毫摩尔/摩尔)”。

在上述方法中，在步骤（1）所述将标准品溶液和待测样品分别过oasis HLB固相萃取柱后，还包括用真空离心压缩机抽干后用0.1%（0.1g/100mL）甲酸水溶液复溶的步骤。

本发明所提供的利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪测定糖化血红蛋白的方法，是在国际临床化学组织(IFCC)推荐的检测方法的基础上进行改良后的方法，该方法将整个上机检测实验时间缩短为12分钟，较IFCC推荐的方法仪器运行时间减少50%以上，提高了液质联用仪器的利用率，与传统的液相色谱串联质谱的方法相比，经方法学考查，测定样本信号强度、精密度、准确度较高，实验耗时短，色谱柱价格低廉，既保证了良好的特异性和实验的准确性，又提高了质谱仪的利用率，有望将其作为测定糖化血红蛋白的参考测量方法，进一步完善我国糖化血红蛋白标准化工作。

附图说明

图1为液相色谱串联三重四极杆质谱仪测定糖化血红蛋白质谱图的提取。其中，A表示实验中洗脱时间为4.5分钟时提取的质谱峰；B表示洗脱时间为4.5分钟时提取的质荷比429.2的质谱峰；C表示洗脱时间为4.5分钟时提取的质荷比348.2的质谱峰。

图2为液相色谱串联三重四极杆质谱仪测定糖化血红蛋白的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

仪器：

1．AA-6680型原子吸收分光光度计，日本岛津。北京市计量局每年一次强检，厂家定期检修，每天使用前自检。

2．Milli-Q净化水装置，密理博中国有限公司。用于实验室去离子水的制备。

3．瑞士梅特勒十万分之一天平。用于标准物质、贮备液、血清样品的准确加入；容量瓶等的内校。北京市计量局每年一次强检，每天使用前自检。

4.Eppendorf reference移液器。每年送生产厂家校准1次，每月1次内校。

5.液相色谱串联三重四极杆质谱仪为安捷伦科技有限公司生产的1260-6410型液相色谱串联三重四极杆质谱仪（Agilent 1260-6410 HPLC-triplequadrupole(LC-QQQ)MassSpectrometry）。

6.ZLNS-1真空离心压缩机，上海青浦仪表厂。

7.MICRO17R低温高速离心机，Thermo Scinetific公司。

8.PHS-3E PH计，上海精科仪表厂。

9.所有玻璃器皿：如移液管；容量瓶等均符合国家A级标准。所有与试剂、水、稀释液或样本接触的玻璃或塑料表面做如下清洗：

(1)使用常规清洗程序（含去污剂的热水浸泡，自来水冲洗）。

(2)在30%硝酸中浸泡过夜，自来水冲洗。

(3)去离子水冲洗5～6min。

(4)无尘环境中倒置自然干燥。

试剂：

1．用于清洁及除盐的oasis HLB固相萃取柱，购买自沃特世waters公司。

2.使用满足计量学特性的国际有证标准物质IRMM/IFCC466(HbA_1c)和IRMM/IFCC467(HbA0)为校准物质（绘制标准曲线时所用的标准品），购买自比利时的参考物质与测量研究所（Institute for Reference Materials and Measurements,IRMM）。随产品附带的国际认定证书中记载：国际有证标准物质IRMM/IFCC466（HbA_1c，糖化血红蛋白）的纯度为≥95%（实际使用时可按纯品计算），HbA_1c浓度为934±22mmol/mol（即将该物质折合成血红蛋白后，可折合成1mol血红蛋白的该物质中，平均含有可以折合成934mmol血红蛋白的HbA_1c，以及可以折合成66mmol血红蛋白的HbA0），IRMM/IFCC466 HbA_1c标准物质总血红蛋白26.2±0.9mg/g（即1g该物质折合成血红蛋白后的质量为26.2mg）；所述国际有证标准物质IRMM/IFCC467（HbA0，非糖化血红蛋白）的纯度为≥99%（实际使用时可按纯品计算），HbA0浓度为>976mmol/mol（即将该物质折合成血红蛋白后，可折合成1mol血红蛋白的该物质中，平均含有可以折合成>976mmol血红蛋白的HbA0，以及可以折合成<24mmol血红蛋白的HbA_1c），IRMM/IFCC466HbA_1c标准物质总血红蛋白119.7±3.7mg/g（即1g该物质折合成血红蛋白后的质量为119.7mg）。在下述实施例中，IRMM/IFCC466和IRMM/IFCC467均按照纯品计算。

3.以中华人民共和国国家一级糖化血红蛋白标准物质（GBW09181，GBW09182，GBW09183）作为质控品，购自卫生部临床检验中心。其中，GBW0181中HbA_1c认定值为38.42±1.6 mmol/mol（即将该物质折合成血红蛋白后，可折合成1mol血红蛋白的该物质中，平均含有可以折合成38.42mmol血红蛋白的HbA_1c，以及可以折合成961.58mmol血红蛋白的HbA0）；GBW0182中HbA_1c的认定值为52.68±2.2mmol/mol（即将该物质折合成血红蛋白后，可折合成1mol血红蛋白的该物质中，平均含有可以折合成52.68mmol血红蛋白的HbA_1c，以及可以折合成947.32mmol血红蛋白的HbA0）；GBW09183中HbA_1c的认定值88.74±3.65 mmol/mol（即将该物质折合成血红蛋白后，可折合成1mol血红蛋白的该物质中，平均含有可以折合成88.74mmol血红蛋白的HbA_1c，以及可以折合成911.26mmol血红蛋白的HbA0）。

4.胞内蛋白酶（endoproteinase GLU-C）为测序等级，购自罗氏诊断，其产品目录号为EC 3.4.21.19。

5.超纯去离子水（≥18.2MΩ.cm），要有充足的水，足够用于试剂溶液配置和对所有玻璃器具的冲洗。

6．有机化学试剂均为HPLC等级,购自默克公司；

下述实施例中标准物质的运输、保存和使用严格按照产品说明书所列要求进行。用干冰包装运输，-20℃贮存条件下可以保存一周，长时间贮存须置于-70℃以下。分析时按说明书要求于室温解冻，取样前缓慢颠倒至少5次。打开后尽快使用。

下述实施例中进行溶液配制及上机检测操作过程中实验室内温度控制在20℃～25℃，变化不大于3℃/h，湿度20%-50%，电压波动小于5%，排风通畅。特别是上机检测中发现上述因素尤其是环境湿度对仪器的稳定性影响甚大，湿度超过80%，基线明显出现漂移。

实施例1、利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪测定糖化血红蛋白

本实施例利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪测定待测样品中糖化血红蛋白（HbA_1c）含量，是在国际临床化学组织(IFCC)推荐的检测方法（参见“Approved IFCCreference method for the measurement of HbA1c in human blood．Clin Chem Lab Med，2002，40：78-89.”一文）的基础上，应用液相色谱串联三重四极杆质谱仪对其进行改进后的方法。具体如下：

一、标准曲线的绘制

以国际有证标准物质IRMM/IFCC466(HbA_1c)和IRMM/IFCC467(HbA0)为标准品，绘制标准曲线，具体操作如下：

1、标准品的酶解及前处理

（1）标准品混合物的制备

将标准品IRMM/IFCC466(HbA_1c)和IRMM/IFCC467(HbA0)按照不同的质量配比制成系列混合物（5份混合物）。表1中显示了所述系列混合物中HbA_1c的实际质量百分含量，以及按照产品随附的国际认定证书的记载，将HbA_1c和HbA0均折合成血红蛋白后，HbA_1c折合而成的血红蛋白的质量占HbA_1c和HbA0一同折合而成的血红蛋白总质量的百分比，即“HbA_1c折合成血红蛋白的质量/（HbA_1c折合成血红蛋白的质量+HbA0折合成血红蛋白的质量）×100%”（记作“A1C/(A1C+A0)折合Hb质量百分含量”）。

表1系列混合物中HbA_1c的质量百分含量（单位：%）

（2）标准品酶解液的制备

将以上所得的5份混合物分别进行酶解，应用HPLC等级水配制胞内蛋白酶GLU-C浓度为200μg/ml，取50μl酶溶液，以及相当于1mg血红蛋白的混合物，应用消化缓冲液（浓度为50mmol/l的乙酸铵水溶液，pH4.3）最后配制成500μl/瓶的酶解反应体系，酶解温度为37℃，酶解时间为18小时，之后置于-20℃冷冻2小时终止酶解反应，获得5份标准品酶解液。

（3）待上机标准品溶液的制备

为了得到清洁度较高，满足以下步骤中液相色谱串联三重四极杆质谱仪检测所需条件的标准品酶解液，将以上所得的5份标准品酶解液分别过oasis HLB C18固相萃取柱（按说明书所列方法进行操作），除去其中的盐和其他杂质。然后用真空离心压缩机抽干，再用100μl浓度为0.1%（0.1g/100mL）的甲酸水溶液进行复溶，获得5份不同浓度的待上机的标准品溶液。

2、液相色谱串联三重四极杆质谱仪检测

用安捷伦科技有限公司生产的1260-6410型液相色谱串联三重四极杆质谱仪（Agilent 1260-6410 HPLC-triple quadrupole(LC-QQQ)MassSpectrometry）对以上步骤1获得的5份不同浓度的待上机的标准品溶液分别进行分析。主要参数如表2所示。

表2液相色谱和质谱条件

3、定标

已知血红蛋白β链N末端1-6的六肽链的质荷比为348.2，糖化血红蛋白的β链N末端1-6的六肽链的质荷比为429.2（以上各质荷比均是从带2个电荷的质谱峰中提取的信号）。根据步骤2中对步骤1获得的5份不同浓度的待上机的标准品溶液的检测结果，由液相色谱串联三重四极杆质谱仪分析软件分别自动提取5份待上机的标准品溶液中HbA_1c和HbA0质荷比的信号强度与峰面积（质谱图见图1）。根据公式rsig=area(glc1–6)/area(1–6)计算出5份待上机的标准品溶液的5个rsig值。上述公式中，area(glc1–6)表示质谱图中HbA_1C的峰面积，area(1–6)表示质谱图中HbA0的峰面积，rsig表示质谱图中HbA1c与HbA0的峰面积比值。

将步骤1（1）中5份标准品混合物各自的“A1C/(A1C+A0)折合Hb质量百分含量”×100后的数值代入公式（I），替代“HbA1c%”，从而计算出5份标准品混合物各自的rconc值：

HbA1c%=100×rconc/(1+rconc)     公式（I）

式中，HbA1c%表示“HbA_1C折合成血红蛋白的质量/（HbA_1C折合成血红蛋白的质量+HbA0折合成血红蛋白的质量）×100”。

按照上述方法，经液相色谱串联三重四极杆质谱仪检测分析，最终得到所述5份待上机的标准品溶液的5个rsig值分别为0、0.0333、0.0609、0.0768、0.1048，计算所得的5个对应rconc值分别为0、0.0381、0.0707、0.0973、0.1333。以rsig为横坐标，以rconc值为纵坐标，绘制标准曲线。实验设3次重复，结果取平均值。

标准曲线如图2所示，从图中可以看出，rsig与rconc值两者之间线性关系良好，其线性回归方程具体为y=1.279x-0.002（R²=0.997）。

二、血液样品中HbA_1c含量的测定

（一）血液样品中HbA_1c含量的测定方法

1、血液样品的收集

血液样品：来自朝阳医院健康体检患者，空腹采集新鲜抗凝静脉血，经筛查人类免疫缺陷病毒抗体（HIV），乙型肝炎表面抗原（HBV），丙型肝炎表面抗原（HCV）均为阴性。

血液样品的收集：完全遵照ISO指南34及WHO关于制备标准物质原料的收集指南，收集EDTA抗凝的新鲜全血1.5毫升，离心（8℃，3000g，10min），弃血浆，沉淀细胞用10ml的NaCl水溶液（生理盐水）洗涤两次后，用10ml细胞孵育液（浓度为0.15mol/L的NaCl水溶液）37℃，孵育4小时以除去前HbA_1c（将前HbA_1c转化为HbA_1c）。弃上清，加入1ml水制得溶血产物。检测总血红蛋白的浓度（氰化高铁血红蛋白法，氰化高铁血红蛋白参比液，目录号：ZD303847）后，用由浓度为50mmol/l的MES水溶液与浓度为1mmol/l的EDTA水溶液等体积混合后所得的混合溶液对溶血产物进行稀释，使溶血产物的总血红蛋白的终浓度稀释到50mg/ml，再加入4mol/l氢氧化钠，调整pH值至6.2，离心（3000g，20min），弃细胞碎片，提取上清液，等量分装，获得溶血标本（其中血红蛋白的终浓度按照50mg/ml，调节pH时加入的NaOH用量甚微，体积不计），-70℃储存，可以储存3年。

2、待测样本酶解液的制备

将以上步骤1所得的各溶血标本分别加入胞内蛋白酶GLU-C进行酶解，具体如下：应用HPLC等级水配制胞内蛋白酶GLU-C浓度为200μg/ml，取50μl酶溶液，以及相当于1mg血红蛋白的溶血标本，应用消化缓冲液（浓度为50mmol/l的乙酸铵水溶液，pH4.3）最后配制成500μl的酶解反应体系，酶解温度为37℃，酶解时间为18小时，之后置于-20℃冷冻2小时终止酶解反应，获得相应的待测样本酶解液。

3、待上机待测样品的制备

为了得到清洁度较高，满足以下步骤中液相色谱串联三重四极杆质谱仪检测所需条件的待测样本酶解液，将以上步骤2所得的各待测样本酶解液分别过oasis HLB C18固相萃取柱，除去其中的盐和其他杂质。然后用真空离心压缩机抽干，再用100μl浓度为0.1%（0.1mL/100mL）的甲酸水溶液进行复溶，获得待上机待测样品。

4、液相色谱串联三重四极杆质谱仪检测

用安捷伦科技有限公司生产的1260-6410型液相色谱串联三重四极杆质谱仪（Agilent1260-6410 HPLC-triple quadrupole(LC-QQQ)MassSpectrometry）对以上步骤1获得的各待上机待测样品分别进行分析。主要参数如表2所示。

5、计算

根据步骤4中对步骤3获得的各待上机待测样品的检测结果，由液相色谱串联三重四极杆质谱仪分别自动提取各待上机待测样品中HbA_1c和HbA0质荷比的信号强度与峰面积。根据公式rsig=area(glc1–6)/area(1–6)计算出各待上机待测样品的rsig值。然后将其代入步骤一所得的标准曲线y=1.279x-0.002（R²=0.997）中，计算各待上机待测样品的rconc值。再将所得rconc值代入以上公式（I），计算得到“HbA1c%”，所述“HbA1c%”即可表示所述待测样品中糖化血红蛋白（HbA_1c）的含量。也可接着将所得“HbA1c%”【即HbA_1c折合成血红蛋白的质量/（HbA_1c折合成血红蛋白的质量+HbA0折合成血红蛋白的质量）×100】转化为“HbA_1c折合成血红蛋白的摩尔数/（HbA_1c折合成血红蛋白的摩尔数+HbA0折合成血红蛋白的摩尔数）”【可记作“A1C/(A1C+A0)折合Hb的摩尔比”】，并用单位mmol/mol表示，该表示方法与IFCC最终结果表示方法一致，即“IFCC-HbA_1C(毫摩尔/摩尔)”。两者之间的转化关系为：“HbA_1c%”=10דIFCC-HbA_1C(毫摩尔/摩尔)”。

实验中，每个标本重复测定3次，取平均值。

实际的实验操作中，步骤一绘制标准曲线与步骤二对待测血液样本进行HbA_1c含量测定是在同日相同的实验条件下进行的，以减小实验中外界因素带来的实验误差。

6、本发明测定待测血液中HbA₁方法用时统计

由于在质谱检测前，经SPE（固相萃取）方法对待侧标本进行清洁及除盐，该步骤的目的是有效去除待测样品中的盐分及其他杂质，保证上机时的待测样品的清洁度，这样在上LC-QQQ质谱仪检测时各待测样本之间就不需要较长的仪器冲洗时间，从而有效地节约了整个实验的检测时间，较IFCC推荐方法（参见“Approved IFCC referencemethod for the measurement of HbA1c in human blood．Clin Chem Lab Med，2002，40：78-89．”）仪器运行时间减少50%。两种方法上机检测时间如表3所示。

表3本发明方法与IFCC推荐方法上机检测时间比较

（二）精密度实验

一个月内，在四个独立的工作日内，将5份血液样本（表4中标本1-5）每份分为四批，按照上述步骤（一）中所述的方法测定其中糖化血红蛋白（HbA_1c）的含量。每批重复测定3次，每批结果取平均值。计算每份血样样本四批的平均值、批内变异系数（批内CV）、批间变异系数（批间CV）与总变异系数（总CV）。

结果见表4。四批血样样本测定值批内CV为0.5985%～1.0628%；批间CV为0.9528%～2.0564%；总CV为1.2307%～2.0813%。

表4精密度实验结果（HbA1c%）

标本	第一批	第二批	第三批	第四批	均值	批内CV	批间CV	总CV
									1	3.4732	3.4747	3.4392	3.3554	3.4356	0.9281%	1.6275%	1.6902%
2	5.6757	5.6836	5.6674	5.4449	5.6179	1.0628%	2.0564%	2.0813%
									3	5.7388	5.6600	5.6913	5.4919	5.6455	0.9542%	1.9023%	1.9593%
4	7.9725	7.9504	7.8088	7.9525	7.9210	0.9144%	0.9528%	1.2307%
									5	9.5013	9.6161	9.6823	9.3015	9.5253	0.5985%	1.7522%	1.6740%

（三）准确度验证实验

选用国家一级糖化血红蛋白标准物质GBW0181，GBW082，GBW083来评价步骤（一）建立的参考方法的准确性。已知GBW0181中HbA_1c认定值为38.42±1.6mmol/mol；GBW0182中HbA_1c的认定值为52.68±2.2mmol/mol；GBW09183中HbA_1c的认定值88.74±3.65 mmol/mol。将以上三种糖化血红蛋白标准物质经上述步骤（一）中所述的方法测定其中“HbA_1c折合成血红蛋白的摩尔数/（HbA_1c折合成血红蛋白的摩尔数+HbA0折合成血红蛋白的摩尔数）”，并用单位mmol/mol表示，即“IFCC-HbA_1C(毫摩尔/摩尔)”。每种标准物质重复测定3次，结果取平均值。计算变异系数和相对偏差。

结果见表5。测定国家一级糖化血红蛋白标准物质三个水平的糖化血红蛋白浓度，结果与认定值的偏差分别为+0.78%，+3.04%，+1.74%，三个水平HbA1c浓度的总CV分别为2.03%，0.76%，1.77%。

表5三种糖化血红蛋白标准物质中的HbA_1c测定结果（单位：mmol/mol）

（四）回收率验证实验

以表4中的标本1、3和4（经步骤二测定其中的糖化血红蛋白（HbA_1c）的HbA1c%测定均值分别为3.4356，5.6455，7.9210）为研究对象。分别取19.4μL、17.0μL、19.6μL血红蛋白浓度为50mg/ml的由表4中的标本1、3和4按照以上步骤二（一）1中所述方法进行溶血处理后的溶血标本，在本实验中分别记为L、M和H。向标本L中加入0.0109g的标准物质IRMM/IFCC466（HbA_1c），向标本M中加入0.0097g的标准物质IRMM/IFCC466（HbA_1c），向标本H中加入0.0095g的标准物质IRMM/IFCC466（HbA_1c）。

一方面，理论上计算向各标本中加入标准物质IRMM/IFCC466（HbA_1c）后，L、M和H三个标本中糖化血红蛋白的含量分别为25.40%、27.36%和26.57%（对应表6中的添加值）。以标本L为例，说明计算方法，如下：

1）加标前，HbA1c%测定均值为3.4356，计算加标前HbA_1C折合成血红蛋白的质量：

19.4μL×50mg/ml×3.4356%=33.325μg；

2）根据IRMM/IFCC466的国际认定证书记载，计算加入0.0109g的标准物质IRMM/IFCC466（HbA_1c）折合成血红蛋白的质量：

0.0109g×26.2mg/g=285.58μg；

3）根据步骤1）和2）计算加标后“HbA_1C折合成血红蛋白的质量/（HbA_1C折合成血红蛋白的质量+HbA0折合成血红蛋白的质量）×100”，即加标后HbA1c%：

（33.325μg+285.58μg）/（19.4μL×50mg/ml+285.58μg）×100=25.40。

另一方面，按照上述步骤（一）中所述的方法测定加标后的糖化血红蛋白（HbA_1c）的含量，以考察本发明所提供方法的回收率。其中，回收率=（测定值－加标前均值）÷添加值×100%（以L为例：(29.6501－3.4356)÷25.40×100%=103.2%）。三个标本水平分别进行了2次回收率实验。结果取平均值。

结果见表6，回收率为97.8%～103.2%。

表6糖化血红蛋白测定的回收率实验（HbA1c%）

注：添加值即为通过直接计算所得的加入标准物质IRMM/IFCC466（HbA_1c）后标本L、M和H中糖化血红蛋白（HbA_1c）的HbA1c%；测定值为采用上述步骤（一）中所述的方法测定加标后的糖化血红蛋白（HbA_1c）的HbA1c%。

（五）测量不确定度分析（以标本L为例）

以步骤（四）中的加标前的标本L为例，进行测量不确定度分析，主要包括重复测量引起的不确定度，该相对不确定度为1.69%（L为步骤（二）精密度实验中的1号标本，其重复测量的总CV为1.69%，即相对不确定度为1.69%）；标准溶液引起的不确定度，IRMM/IFCC466(HbA1c)含量为934±22mmol/mol，该标准物质的不确定度即为2.2%（国际认定证书中记载）；万分之一的分析天平引起的称量不确定度，该称量不确定度为0.0058%（计算方法见下文：万分之一的天平精度为0.1mg，按均匀分布计算，取k=√3，其不确定度为0.000l／√3=0.000058）。

计算合成不确定度，见公式（II）

Uc²(y)=(u1)²+(u2)²+…+(un)²     公式（II）

Uc²(y)=（1.69%）²+（2.2%）²+（0.0058%）²

转换为相对标准不确定度c×Uc(y)=34.356mmol/mol×2.77%=0.95（mmol/mol）

相对扩展不确定度U95%=2×c×Uc(y)=1.9（mmol/mol）；由此可知，样本L、M、H相对扩展不确定度分别为1.9mmol/mol，3.33mmol/mol，3.99mmol/mol。

（六）定值

以以步骤（四）中的标本L为例，进行定值。具体如下：将标本分6批，按照上述步骤（一）中所述的方法测定其中“HbA_1c折合成血红蛋白的摩尔数/（HbA_1c折合成血红蛋白的摩尔数+HbA0折合成血红蛋白的摩尔数）”，并用单位mmol/mol表示，即“IFCC-HbA_1C(毫摩尔/摩尔)”。每批测定3次，共得18个数据，取中间值。结果显示，其中间值为32.47mmol/ mol。按照步骤（五）中的公式计算标本L的扩展不确定度（扩展不确定度=1/2相对扩展不确定度），结果为0.95mmol/mol，则标本L的定值为32.47±0.95mmol/mol。

综合本实施例的全部结果，可见，本发明方法与IFCC推荐的传统液相色谱串联质谱的方法相比，整个上机检测实验时间缩短为12分钟，仪器运行时间减少50%以上，经方法学考查，测定样本信号强度、精密度、准确度较高，色谱柱价格低廉，既保证了良好的特异性和实验的准确性，又提高了质谱仪的利用率，有望将其作为测定糖化血红蛋白的参考测量方法，进一步完善我国糖化血红蛋白标准化工作。

Claims (9)

1.液相色谱串联三重四级杆质谱仪在检测糖化血红蛋白中的应用。

2.一种利用液相色谱串联三重四级杆质谱仪检测待测样品中糖化血红蛋白含量方法，包括如下步骤：

（1）将标准品溶液和待测样品分别过固相萃取柱，分别获得待上机标准品和待上机待测样品；

（2）用液相色谱串联三重四级杆质谱仪对步骤（1）所得待上机标准品和待上机待测样品分别进行检测；所述检测中采用的色谱条件如下：色谱柱为C18色谱柱；流动相为如下流动相A和流动相B，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱；流动相A：乙腈；流动相B：甲酸水溶液；

（3）从步骤（2）的检测结果中得出所述待测样品中糖化血红蛋白的含量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述流动相中，所述甲酸水溶液中甲酸的含量为每1000ml所述甲酸水溶液中含有1ml所述甲酸。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，采用所述流动相A和所述流动相B进行梯度洗脱为：0-7min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为5：95；8-9min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为50：50；10-12min，所述流动相中所述流动相A和所述流动相B的体积比为95：5。

5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述色谱条件的流速为300μl/min。

6.根据权利要求2-5中任一所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述检测中采用的质谱条件如下：扫描类型为二级质谱；毛细管电压为4500V；喷雾气体为氮气；喷雾器压力为30psi；气体流速为11L/min；气体温度为300摄氏度；扫描范围为300-2000M/Z。

7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，在对所述待上机样品进行检测时用所述液相色谱串联三重四级杆质谱仪所处的环境中，空气相对湿度小于80%，如20%-50%，温度为20℃～25℃，电压波动小于5%。

8.根据权利要求2-7中任一所述的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述色谱条件的进样量为1-5μl。

9.根据权利要求2-8中任一所述的方法，其特征在于：所述标准品为国际有证标准物质IRMM/IFCC466和IRMM/IFCC467。

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