CN104897812A - 一种糖化血红蛋白的检测方法及其试剂盒 - Google Patents
一种糖化血红蛋白的检测方法及其试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种糖化血红蛋白的检测方法及其试剂盒。本发明提供的糖化血红蛋白检测的方法为：将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱仪或糖化血红蛋白仪检测。本发明提供的方法可以将血样稀释后直接进样检测，避免了冗长的前处理过程，从而实现对血样的快速、准确检测。经试验证实，本发明提供的方法能够实现1min内完成对血样中的糖化血红蛋白的定量检测。
Description
技术领域
本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种糖化血红蛋白的检测方法及其试剂盒。
背景技术
糖化血红蛋白是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物，它的英文代号为HbA1c。总血红蛋白可以分为A，A2，F三种组分，其中F主要在胎儿期，而成人主要为A，是由两个α链和两个β链构成。A2由两个α链和两个δ链形成，F由两个α链和两个γ链形成。成人HbA占97％，又可分为HbA0和HbA1两种，HbA0为没有被糖基化部分，而HbA1为被糖基化部分。正常人平均HbA1c水平约为5％。总HbA1约占6％左右，而HbA1a和HbA1b总和尚低于1％。血糖和血红蛋白结合生成的糖化血红蛋白是不可逆反应，糖化血红蛋白与血糖浓度成正比，并且保持120天左右。所以，测试糖化血红蛋白可以观测到此前120天的血糖浓度。即患者近8～12周的血糖控制情况。因此，作为糖尿病标志物，在临床检查中进行日常测定作为血糖控制的指标。
目前临床实验室中应用的糖化血红蛋白检测方法主要有两大类：一类方法基于糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白所带的电荷不同，如离子层析法、电泳等方法；另一类方法基于血红蛋白上糖化基团的结构特点，如亲和层析、离子捕获法和免疫法等。其中高效液相离子层析法(HPLC)测定HbA1c使其准确性和重复性得到很大的提高，被公认为金标准。
高效液相层析法(HPLC)是近二十年来发展起来的一项新颖快速的分离技术。它是在经典液相层析法基础上，引进了气相层析的理论具有气相层析的全部优点。由于HPLC分离能力强、测定灵敏度高，可在室温下进行，应用范围极广。但是，高效液相色谱在分析糖化血红蛋白时，为了获得更可靠准确的鉴定结果，往往需要经过较为复杂的前处理过程，从而导致检测周期较长，不能满足临床快速定量检测的要求。而如果前处理不当，则会导致色谱柱寿命缩短、定性定量不准的问题发生。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种糖化血红蛋白的检测方法及其试剂盒。本发明提供的方法色谱柱选择合理，配合适宜的流动相，能够实现对糖化血红蛋白的快速、准确检测，且色谱柱分辨率高、耐受性好。
本发明提供的糖化血红蛋白检测的方法为：将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱仪或糖化血红蛋白仪检测。
在本发明的实施例中，血样与水的比例为1:200。
高效液相色谱可采用等度、二相或三相梯度洗脱。
在本发明的实施例中，高效液相色谱仪检测采用二相或三相梯度洗脱；流动相A相为pH值为2～10的缓冲液；流动相B相为添加无机盐的A相；流动相C相为去离子水或超纯水。
在本发明的实施例中，流动相B相中添加的无机盐为氯化钠、氯化钾、氯化锂、硫酸盐、碳酸盐、醋酸盐、高氯酸盐或磷酸盐中任一种或两者以上的混合物。
在本发明的实施例中，流动相B相中添加的无机盐的浓度为0.1mol/L～2mol/L。
在本发明的实施例中，流动相A相、流动相B相或流动相C相中还包括防腐剂。
本发明所述的防腐剂为叠氮化钠或叠氮化钾。
在本发明的实施例中，流动相A相、流动相B相或流动相C相中防腐剂的质量分数不高于1％。
在本发明的实施例中，流动相A相为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、Bis-Tris/磷酸盐溶液、Bis-Tris/柠檬酸溶液、Bis-Tris/柠檬酸/磷酸盐溶液、柠檬酸/磷酸盐溶液或Tris/磷酸盐溶液中任一种或两者以上的混合物。
在一些实施例中，高效液相色谱仪检测的柱温为4℃～60℃。
作为优选，高效液相色谱检测的柱温为30℃～50℃。
优选的，高效液相色谱检测的柱温为40℃。
在一些实施例中，高效液相色谱检测的波长为210nm～450nm。
作为优选，高效液相色谱检测的的波长为415nm。
在一些实施例中，高效液相色谱检测的流速为1mL/min～5mL/min。
作为优选，高效液相色谱检测的流速为1.5mL/min。
在一些实施例中，高效液相色谱检测的进样量为5μL～50μL。
作为优选，高效液相色谱检测的进样量为10μL。
在一些实施例中，高效液相色谱检测的柱压为30bar～110bar。
一种糖化血红蛋白的高效检测方法，将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱检测；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为5μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
所述高效液相色谱：
流动相A相为浓度为50mmol/L的磷酸钠缓冲液，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.65mmol/L NaCl的流动相A相；
洗脱梯度为：0min～0.8min流动相B相的体积分数由5％至12％；
0.8min～1.5min流动相B相的体积分数由12％至80％；
1.5min～1.8min流动相B相的体积分数由80％至100％；
1.8min～2.1min流动相B相的体积分数由100％至5％。
该方法可以高效的检测血样中的糖化血红蛋白，色谱图中峰型良好，分辨率高。经实验证实，采用该方法进4000针，色谱柱状态仍良好。
一种糖化血红蛋白的高效检测方法，将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱检测；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为10μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
所述高效液相色谱：
流动相A相为浓度为20mmol/L的柠檬酸盐溶液，其中含有质量分数为0.02％的NaN3，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.4mmol/L NaCl的流动相A相；
洗脱梯度为：0min～1min流动相B相的体积分数由8％至70％；
1min～5min流动相B相的体积分数由70％至60％。
该方法可以高效的检测血样中的糖化血红蛋白，色谱图中峰型良好，分辨率高，并且，该方法柱压较低，能够延长仪器系统和色谱柱的寿命。
一种糖化血红蛋白的高效检测方法，将血样以水稀释后，采用GlyHb色 谱柱，经高效液相色谱检测；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为5μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
所述高效液相色谱：
流动相A相包括50mmol/L的磷酸盐和25mmol/L的Tris，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.5mmol/L NaCl的流动相A相；
洗脱梯度为：0min～0.4min流动相B相的体积分数由6％至15％；
0.4min～0.6min流动相B相的体积分数由15％至28％；
0.6min～1min流动相B相的体积分数由28％至100％。
该方法可以高效的检测血样中的糖化血红蛋白，色谱图中峰型良好，分辨率高，并且洗脱梯度较短，能够实现在1.2min内对血样中的糖化血红蛋白进行定量检测。
一种糖化血红蛋白的快速检测方法，将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱检测；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为5μm，柱长为30mm，柱径为4.6mm；
所述高效液相色谱：
流动相A相为浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为6.0；
流动相B相为含有1.0mmol/L NaCl的流动相A相；
洗脱梯度为：0min～0.5min流动相B相的体积分数由4.1％至13％；
0.5min～0.51min流动相B相的体积分数由13％至80％。
该方法可以高效的检测血样中的糖化血红蛋白，色谱图中峰型良好，分辨率高，并且洗脱梯度较短，能够实现在1.1min内对血样中的糖化血红蛋白进行定量检测。
一种糖化血红蛋白的检测方法，将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱检测；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为10μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
所述高效液相色谱：
流动相A相为浓度为50mmol/L的Bis-Tris缓冲液，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.5mmol/L NaCl的流动相A相；
洗脱梯度为：0min～0.5min流动相B相的体积分数由10％至30％；
0.5min～0.8min流动相B相的体积分数由30％至70％；
0.8min～1.0min流动相B相的体积分数由70％至100％；
1.0min～3.0min流动相B相的体积分数为100％。
该方法可以高效的检测血样中的糖化血红蛋白，色谱图中峰型良好，分辨率高。
一种糖化血红蛋白的检测方法，将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱检测；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为10μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
所述高效液相色谱：
流动相A相中包括25mmol/L的Bis-Tris和25mmol/L磷酸盐，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.5mmol/L NaCl的流动相A相；
洗脱梯度为：0min～0.3min流动相B相的体积分数由20％至60％；
0.3min～0.5min流动相B相的体积分数由60％至80％；
0.5min～1.3min流动相B相的体积分数由80％至100％；
1.3min～2.0min流动相B相的体积分数为100％。
该方法可以高效的检测血样中的糖化血红蛋白,色谱图中峰型良好，分辨率高。
一种糖化血红蛋白的检测方法，将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱检测；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为10μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
所述高效液相色谱：
流动相A相中包括10mmol/L的Bis-Tris和50mmol/L磷酸盐，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.5mmol/L NaCl的流动相A相；
洗脱梯度为：0min～0.5min流动相B相的体积分数由7％至20％；
0.5min～0.9min流动相B相的体积分数由20％至50％；
0.9min～1.2min流动相B相的体积分数由50％至100％；
1.2min～3.0min流动相B相的体积分数为100％。
本发明提供的方法可以将血样稀释后直接进样检测，避免了冗长的前处理过程，从而实现对血样的快速、准确检测。经试验证实，本发明提供的方 法能够实现1min内完成对血样中的糖化血红蛋白的定量检测。
本发明还提供了糖化血红蛋白检测试剂盒，其中包括GlyHb色谱柱和流动相。
GlyHb色谱柱为本公司自主研发生产，GlyHb色谱柱的填料基质为无孔、球形、高交联度聚合物树脂颗粒。
在本发明的实施例中，GlyHb色谱柱的填料粒径为1.7μm～30μm；柱长为10mm～300mm；柱径为0.3mm～10.0mm。
在一些实施例中，GlyHb色谱柱的填料粒径为1.7μm、3μm或5μm或10μm，柱长为30mm或50mm，柱径为4.6mm。
在本发明的实施例中，流动相A相为pH值为2～10的缓冲液；流动相B相为添加无机盐的A相；流动相C相为去离子水或含有防腐剂的去离子水。
在本发明的实施例中，流动相A相为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、Bis-Tris/磷酸盐溶液、Bis-Tris/柠檬酸/磷酸盐溶液、柠檬酸/磷酸盐溶液或Tris/磷酸盐溶液中任一种或两者以上的混合物。
在一些实施例中，流动相A相的pH值为6.0；具体为：
浓度为50mmol/L的磷酸钠缓冲液、
浓度为20mmol/L的柠檬酸盐溶液，其中含有质量分数为0.02％NaN3、
浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液，其中含有浓度为25mmol/L的Tris、
浓度为50mmol/L的Tris缓冲液、
浓度为50mmol/L的Bis-Tris缓冲液、
包含浓度为25mmol/L的Bis-Tris和浓度为25mmol/L磷酸盐的缓冲液、或包含浓度为10mmol/L的Bis-Tris和浓度为50mmol/L磷酸盐的缓冲液。
在一些实施例中，流动相A相中还包括防腐剂；所述防腐剂为叠氮化钠或叠氮化钾。
一种糖化血红蛋白的高效检测试剂盒，包括GlyHb色谱柱和流动相A相和流动相B相；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为5μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
流动相A相为浓度为50mmol/L的磷酸钠缓冲液，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.65mmol/L NaCl的流动相A相。
一种糖化血红蛋白的高效检测试剂盒，包括GlyHb色谱柱和流动相A相和流动相B相；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为10μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
流动相A相为浓度为20mmol/L的柠檬酸盐溶液，其中含有质量分数为0.02％的NaN3，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.4mmol/L NaCl的流动相A相。
一种糖化血红蛋白的高效检测试剂盒，包括GlyHb色谱柱和流动相A相和流动相B相；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为5μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
流动相A相中包括50mmol/L的磷酸盐和25mmol/L的Tris，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.5mmol/L NaCl的流动相A相。
一种糖化血红蛋白的快速检测试剂盒，包括GlyHb色谱柱和流动相A相和流动相B相；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为5μm，柱长为30mm，柱径为4.6mm；
流动相A相为浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH值为6.0；
流动相B相为含有1.0mmol/L NaCl的流动相A相。
一种糖化血红蛋白的快速检测试剂盒，包括GlyHb色谱柱和流动相A相和流动相B相；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为10μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
流动相A相为浓度为50mmol/L的Bis-Tris缓冲液，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.5mmol/L NaCl的流动相A相。
一种糖化血红蛋白的快速检测试剂盒，包括GlyHb色谱柱和流动相A相和流动相B相；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为10μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
流动相A相中包括25mmol/L的Bis-Tris和25mmol/L磷酸盐，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.5mmol/L NaCl的流动相A相。
一种糖化血红蛋白的快速检测试剂盒，包括GlyHb色谱柱和流动相A相和流动相B相；
所述GlyHb色谱柱填料的粒径为10μm，柱长为50mm，柱径为4.6mm；
流动相A相中包括10mmol/L的Bis-Tris和50mmol/L磷酸盐，pH值为6.0；
流动相B相为含有0.5mmol/L NaCl的流动相A相。
本发明提供的糖化血红蛋白检测的方法为：将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱仪或糖化血红蛋白仪检测。本发明提供的方法可以将血样稀释后直接进样检测，避免了冗长的前处理过程，从而实现对血样的快速、准确检测。经试验证实，本发明提供的方法能够实现1.1min内完成对血样中的糖化血红蛋白的定量检测。
附图说明
图1示实施例1的HPLC分析结果；
图2示实施例2的HPLC分析结果；
图3示实施例3的HPLC分析结果；
图4示实施例4的HPLC分析结果。
具体实施方式
本发明提供了一种糖化血红蛋白的检测方法及其试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。
其中，色谱柱由本公司自主研发生产；
流动相的成分会影响物质的分离度、出峰时间和峰型，在一些实施例中，本发明提供的方法或试剂盒中所采用的流动相A相、流动相B相、流动相C相如表1所示：
表1流动相
在本发明的实施例中：
磷酸盐缓冲液为磷酸钾、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠中一者或两者以上混合物配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
柠檬酸盐缓冲液为柠檬酸和/或柠檬酸钠配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
醋酸盐缓冲液为醋酸和/或醋酸酸钠配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
草酸盐缓冲液为草酸和/或草酸钠配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
甲酸盐缓冲液为甲酸和/或甲酸钠配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
二(2—羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(Bis—Tris)缓冲液为Bis—Tris、氢氧化钠、盐酸中一者或两者以上混合物配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液为Tris、氢氧化钠、盐酸中一者或两者以上混合物配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
Bis-Tris/磷酸盐溶液为Bis-Tris和磷酸钾、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠中一者或两者以上混合物配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
Bis-Tris/柠檬酸溶液为Bis-Tris和柠檬酸、柠檬酸钠两者或三者以上混合物配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
Bis-Tris/柠檬酸/磷酸盐溶液为Bis-Tris与柠檬酸钠、柠檬酸与磷酸钾、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠中三者或三者以上混合物配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
柠檬酸/磷酸盐溶液为柠檬酸和磷酸钾、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠中一者或两者以上混合物配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
Tris/磷酸盐溶液Tris和磷酸钾、磷酸钠、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾或磷酸氢二钠中一者或两者以上混合物配制而成的缓冲液，pH值为2～10，优选的，pH值为4～8，更优选的，pH值为6.0。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
(1)样本的准备：准确吸取10μL的全血样本用纯水进行稀释，稀释倍数为200倍。
(2)色谱条件的设定：
a.色谱柱：粒径为5μm，柱长为4.6 X 50mm的GlyHb色谱柱；
b.柱温：40℃；
c.流动相：A相50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0),B相A相+0.65M NaCl
d.洗脱方式两相梯度洗脱，
洗脱梯度为：0min～0.8min流动相B相的体积分数由5％至12％；
0.8min～1.5min流动相B相的体积分数由12％至80％；
1.5min～1.8min流动相B相的体积分数由80％至100％；
1.8min～2.1min流动相B相的体积分数由100％至5％。
e.检测波长：415nm；
f.流速：1.5mL/min；
g.进样量：10μL。
h.柱压：60bar
(3)进样检测：将稀释后的样本至高效液相色谱进行检测。
HPLC分析结果如图1所示，在该方法下，HbA1c可以实现有效、快速分离。结果如表2所示：
表2检测结果
| 化合物名称 | RT(min) | Height | Area％ | Area | Plates | Tailing | Resolution |
| 0.27 | 4 | 0.617 | 12 | 107 | 0.97 | ||
| 0.33 | 2 | 0.475 | 9 | -23.20 | |||
| 0.42 | 1 | 0.231 | 4 | -15.72 | |||
| 0.49 | 3 | 0.844 | 16 | 238 | -9.44 | ||
| 0.69 | 1 | 0.743 | 14 | 59 | -5.77 | 0.81 | |
| 1.09 | 1 | 0.523 | 10 | 392 | -3.04 | 1.36 | |
| HbA1c | 1.31 | 22 | 6.733 | 127 | 1642 | 1.05 | 1.28 |
| 1.56 | 3 | 1.440 | 27 | -5.04 | |||
| 1.98 | 348 | 88.395 | 1670 | 5460 | 0.73 |
结果显示，病人血样中糖化血红蛋白的含量为6.73％。
实施例2
(1)样本的准备：准确吸取10μL的全血样本用纯水进行稀释，稀释倍数为200倍。
(2)色谱条件的设定：
a.色谱柱：粒径为10μm，柱长为4.6×50mm的GlyHb色谱柱；
b.柱温：40℃；
c.流动相：A相20mM柠檬酸盐(pH 6.0)(0.02％NaN3)；B相A相+0.4M NaCl(0.02％NaN3)
d.洗脱方式：两相梯度：
洗脱梯度为：0min～1min流动相B相的体积分数由8％至70％；
1min～5min流动相B相的体积分数由70％至60％。
e.检测波长：415nm；
f.流速：1.5mL/min；
g.进样量：10μL。
h.柱压：40bar
(3)进样检测：将稀释后的样本至高效液相色谱进行检测。分析结果如图2所示。
在该方法下，HbA1c可以实现有效、快速分离，并且该方法柱压低，能够延长色谱柱的寿命。结果如表3示：
表3检测结果
| 化合物名称 | RT(min) | Height | Area％ | Area |
| 0.362 | 20.72 | 2.59 | 44.19 | |
| 0.495 | 3.23 | 0.87 | 14.84 | |
| 0.575 | 1.82 | 0.75 | 12.77 | |
| 0.797 | 1.06 | 0.37 | 6.38 | |
| HbA1c | 0.980 | 9.43 | 5.52 | 94.02 |
| 1.359 | 2.49 | 1.72 | 29.37 | |
| 1.556 | 3.41 | 1.78 | 30.33 | |
| 1.801 | 6.03 | 3.40 | 57.95 | |
| 2.236 | 107.96 | 83.00 | 1414.96 |
结果显示，病人血样中糖化血红蛋白的含量为5.52％。
实施例3
(1)样本的准备：准确吸取10μL的全血样本用纯水进行稀释，稀释倍数为200倍。
(2)色谱条件的设定：
a.色谱柱：粒径为5μm，柱长为4.6×50mm的GlyHb色谱柱；
b.柱温：40℃；
c.流动相：A相:50mM磷酸盐缓冲液+25mM Tris(pH 6.0),B相:A相+0.5M NaCl
d.洗脱方式：两相梯度洗脱
洗脱梯度为：0min～0.4min流动相B相的体积分数由6％至15％；
0.4min～0.6min流动相B相的体积分数由15％至28％；
0.6min～1min流动相B相的体积分数由28％至100％。
e.检测波长：415nm；
f.流速：1.5mL/min；
g.进样量：10μL。
h.柱压：60bar
(3)进样检测：将稀释后的样本至高效液相色谱进行检测。分析结果如图3所示。
在该方法下，HbA1c可以实现有效、快速分离，并且该方法柱压低，能够延长色谱柱的寿命。结果如表4示：
表4检测结果
结果显示，病人血样中糖化血红蛋白的含量为3.69％。
实施例4
(1)样本的准备：准确吸取10μL的全血样本用纯水进行稀释，稀释倍数为200倍。
(2)色谱条件的设定：
a.色谱柱：粒径为5μm，柱长为4.6 X 30mm的GlyHb色谱柱；
b.柱温：40℃；
c.流动相：A相:50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0),B相:A+1.0M NaCl
d.洗脱方式：两相梯度：
洗脱梯度为：0min～0.5min流动相B相的体积分数由4.1％至13％；
0.5min～0.51min流动相B相的体积分数由13％至80％。
e.检测波长：415nm；
f.流速：1.6mL/min；
g.进样量：10μL。
h.柱压：63bar
(3)进样检测：将稀释后的样本至高效液相色谱进行检测。分析结果如图4所示。
在该方法下，HbA1c可以实现有效、快速分离，并且该方法柱压低，能 够延长色谱柱的寿命。结果如表5：
表5检测结果
| 化合物名称 | RT(min) | Height | Area | Area％ | Plates | Tailing | Resolution |
| 0.17 | 19 | 64 | 2.88 | 43 | 0.96 | ||
| 0.26 | 20 | 118 | 5.30 | 57 | -10.69 | 0.74 | |
| 0.50 | 6 | 32 | 1.46 | -7.74 | |||
| HbA1c | 0.65 | 10 | 71 | 3.20 | 180 | -5.71 | |
| 0.81 | 8 | 45 | 2.03 | -4.63 | |||
| 0.92 | 23 | 117 | 5.27 | 505 | -6.64 | ||
| 1.08 | 572 | 1776 | 79.86 | 2686 | 0.97 | 1.28 |
结果显示，病人血样中糖化血红蛋白的含量为3.20％。
实施例5
(1)样本的准备：准确吸取10μL的全血样本用纯水进行稀释，稀释倍数为200倍。
(2)色谱条件的设定：
a.色谱柱：粒径为10μm，柱长为4.6 X 50mm的GlyHb色谱柱；
b.柱温：40℃；
c.流动相：A相：50mM Bis-Tris缓冲液(pH 6.0),B相:A相+0.5M NaCl
d.洗脱方式：两相梯度：
洗脱梯度为：0min～0.5min流动相B相的体积分数由10％至30％；
0.5min～0.8min流动相B相的体积分数由30％至70％；
0.8min～1.0min流动相B相的体积分数由70％至100％；
1.0min～3.0min流动相B相的体积分数为100％。
e.检测波长：415nm；
f.流速：1.5mL/min；
g.进样量：10μL。
h.柱压：
(3)进样检测：将稀释后的样本至高效液相色谱进行检测。在该方法下，HbA1c可以实现有效、快速分离，并且该方法柱压低，能够延长色谱柱的寿命。
结果显示，病人血样中糖化血红蛋白的含量为6.53％。
实施例6
(1)样本的准备：准确吸取10μL的全血样本用纯水进行稀释，稀释倍数为200倍。
(2)色谱条件的设定：
a.色谱柱：粒径为10μm，柱长为4.6 X 50mm的GlyHb色谱柱；
b.柱温：40℃；
c.流动相：A:25mM磷酸盐+25mM Bis-Tris buffer(pH 6.0),B:A+0.5M NaCl
d.洗脱方式：两相梯度：
0min～0.3min流动相B相的体积分数由20％至60％；
0.3min～0.5min流动相B相的体积分数由60％至80％；
0.5min～1.3min流动相B相的体积分数由80％至100％；
1.3min～2.0min流动相B相的体积分数为100％。
e.检测波长：415nm；
f.流速：1.5mL/min；
g.进样量：10μL。
h.柱压：40bar
(3)进样检测：将稀释后的样本至高效液相色谱进行检测。
在该方法下，HbA1c可以实现有效、快速分离，并且该方法柱压低，能够延长色谱柱的寿命。
结果显示，病人血样中糖化血红蛋白的含量为6.50％。
实施例7
(1)样本的准备：准确吸取10μL的全血样本用纯水进行稀释，稀释倍数为200倍。
(2)色谱条件的设定：
a.色谱柱：粒径为10μm，柱长为4.6×50mm的GlyHb色谱柱；
b.柱温：40℃；
c.流动相：A:50mM磷酸盐+10mM Bis-Tris缓冲液(pH 6.0),B:A+0.5M NaCl
d.洗脱方式：两相梯度洗脱：
洗脱梯度为：0min～0.5min流动相B相的体积分数由7％至20％；
0.5min～0.9min流动相B相的体积分数由20％至50％；
0.9min～1.2min流动相B相的体积分数由50％至100％；
1.2min～3.0min流动相B相的体积分数为100％。
e.检测波长：415nm；
f.流速：1.5mL/min；
g.进样量：10μL。
h.柱压：40bar
(3)进样检测：将稀释后的样本至高效液相色谱进行检测。
在该方法下，HbA1c可以实现有效、快速分离，并且该方法柱压低，能够延长色谱柱的寿命。
结果显示，病人血样中糖化血红蛋白的含量为6.49％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种糖化血红蛋白检测的方法，其特征在于，将血样以水稀释后，采用GlyHb色谱柱，经高效液相色谱仪或糖化血红蛋白仪检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪检测采用等度或二相或三相梯度洗脱；流动相A相为pH值为2～10的缓冲液；流动相B相为添加无机盐的A相。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪检测的柱温为4℃～60℃。
4.一种糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，包括GlyHb色谱柱和流动相。
5.根据权利要求4所述的糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述GlyHb色谱柱的填料粒径为1.7μm～30μm；柱长为10mm～300mm；柱径为0.3mm～10.0mm。
6.根据权利要求4所述的糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述流动相A相为pH值为2～10的缓冲液；流动相B相为添加无机盐的A相；流动相C相为去离子水或超纯水。
7.根据权利要求6所述的糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述流动相A相为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、草酸盐缓冲液、甲酸盐缓冲液、二(2-羟乙基)亚胺基三(羟甲基)甲烷(Bis-Tris)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、Bis-Tris/磷酸盐溶液、Bis-Tris/柠檬酸盐溶液、Bis-Tris/柠檬酸/磷酸盐溶液、柠檬酸/磷酸盐溶液或Tris/磷酸盐溶液中任一种或两者以上的混合物。
8.根据权利要求6所述的糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述流动相A相、流动相B相或流动相C相中还包括防腐剂；所述防腐剂为叠氮化钠或叠氮化钾。
9.根据权利要求4所述的糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述GlyHb色谱柱的填料粒径为1.7μm、3μm、5μm或10μm，柱长为30mm或50mm，柱径为4.6mm。
10.根据权利要求4所述的糖化血红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述流动相A相的pH值为6.0；具体为：
浓度为50mmol/L的磷酸钠缓冲液、
浓度为20mmol/L的柠檬酸盐溶液，其中含有质量分数为0.02％NaN3、
浓度为50mmol/L的磷酸盐缓冲液，其中含有浓度为25mmol/L的Tris、
浓度为50mmol/L的Tris缓冲液、
浓度为50mmol/L的Bis-Tris缓冲液、
包含浓度为25mmol/L的Bis-Tris和浓度为25mmol/L磷酸盐的缓冲液、或包含浓度为10mmol/L的Bis-Tris和浓度为50mmol/L磷酸盐的缓冲液。
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