CN110879270A - 氟[18f]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，色谱条件为：色谱柱选用阴离子交换柱；流动相为2.5‑3.5mmol/L Na₂CO₃和0.5‑1.5mmol/L NaHCO₃混合溶液；检测器为串联的紫外检测器和放射性检测器。本发明的色谱柱选用填料为带有丁铵基团的聚乙烯醇阴离子交换柱，该色谱柱具有流动相条件更为温和，且方法操作更加简便，流动相无需严格保护，且主峰与杂质峰具有较好的分离度，优于现有的氟[¹⁸F]化钠放化纯检测方法，具有更好的适用性。

Description

氟[18F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明属于高效液相色谱分析技术领域，具体涉及一种氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法。

背景技术

氟[¹⁸F]化钠是一种利用PET或PET/CT成像的放射性药物，可以沉积在成骨代谢活跃的部位，显像原理与^99mTc-亚甲基二膦酸盐(^99mTc-MDP)相似，但其在骨转移疾病的诊断较后者具有更高的灵敏度，并且伴随着PET/CT在临床上的广泛应用，使用氟[¹⁸F]化钠药物能在一次扫描中同时获得病灶的解剖信息和代谢信息情况，能够提供更为多元、直观的诊断信息，从而更加准确确定患者临床分期，给出个性化的诊疗方式。除此之外，氟[¹⁸F]化钠还可应用于肿瘤、动脉粥样硬化斑块、骨质钙化、关节增生、骨坏死的等多种疾病的鉴别诊断。

氟[¹⁸F]化钠注射液作为一种静脉注射的正电子药物，其质量控制对药品的安全性和有效性具有非常重要的意义。其中放化纯的测量方法有薄层色谱法、离子色谱法和高效液相色谱法(HPLC)，而离子色谱法和高效液相色谱法是一种更为准确的测量方法。HPLC质量控制方法在美国药典、英国药典和欧洲药典均有收录。其采用串联电导检测器或者紫外检测器和放射性检测器，电导检测器和紫外检测器用于氟[¹⁹F]化钠对照溶液的分析并进行氟离子的定位以及对照溶液中氟离子含量测定，放射性检测器主要用于检测氟[¹⁸F]化钠中的放射性[¹⁸F]氟离子。美国药典中采用硫酸水溶液作为流动相，欧洲药典中色谱柱采用强碱性阴离子交换树脂色谱柱，流动相为4g/L NaOH溶液，流速为0.8-1.0mL/min，柱温为20～30℃。尽管上述方法可用于[¹⁸F]氟离子的精确测量，但操作条件苛刻，使用强酸和强碱作为流动相，使用中需要严格采取措施隔绝空气中的CO₂，对色谱柱要求高。因此，建立更为温和条件的高效液相分析方法氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的测量具有非常重要的意义。

发明内容

针对背景技术中的问题，本发明的目的在于提供一种条件更为温和、适用性更好的检测氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的HPLC分析方法，该方法采用多种不同的紫外检测波长、流速、运行时间，最终确定合适的条件，可以有效的将[¹⁸F]氟离子与其他杂质分离，用于氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的检测。

为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：

一种氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，色谱条件为：

色谱柱选用阴离子交换柱；

流动相为2.5-3.5mmol/L Na₂CO₃和0.5-1.5mmol/L NaHCO₃混合溶液；

检测器为串联的紫外检测器和放射性检测器。

作为一种优选的方案，所述色谱柱填料为含有丁铵基团的聚乙烯醇。

作为一种优选的方案，检测波长为190-225nm。

作为一种优选的方案，检测波长为220nm。

作为一种优选的方案，所述交换柱的柱温为20-30℃。

作为一种优选的方案，所述流动相的流速为0.6-0.75mL/min。

作为一种优选的方案，所述流动相的流速为0.7mL/min。

作为一种优选的方案，运行时间为15-20min。

作为一种优选的方案，所述注射液的进样量为20μL。

作为一种优选的方案，所述分析方法的检测线性范围为0.12～7.0mCi/mL。

本发明的有益效果在于：

本发明的色谱柱选用填料为带有丁铵基团的聚乙烯醇阴离子交换柱，该色谱柱具有流动相条件更为温和，且方法操作更加简便，流动相无需严格保护，且主峰与杂质峰具有较好的分离度，优于现有的氟[¹⁸F]化钠放化纯检测方法，具有更好的适用性。

附图说明

图1为氟离子在不同紫外波长下的吸收峰面积；

图2为浓度和峰面积线性拟合图；

图3为浓度和峰高线性拟合图；

图4为本发明方法氟[¹⁹F]化钠对照溶液HPLC VWD图谱；

图5为本发明方法溶于0.045％NaCl的氟[¹⁹F]化钠对照溶液HPLC VWD图谱；

图6为本发明方法氟[¹⁸F]化钠注射液HPLC放射性图谱；

图7为欧洲药典方法氟[¹⁹F]化钠对照溶液HPLC VWD图谱；

图8为欧洲药典方法溶于0.045％NaCl的氟[¹⁹F]化钠对照溶液HPLC VWD图谱；

图9为欧洲药典方法氟[¹⁸F]化钠注射液HPLC放射性图谱。

具体实施方式

下面结合附图以及实施例，对本发明的具体实施方案作详细的阐述。

本发明所使用仪器与试剂如下：

纯化水，氟化钠，碳酸钠，碳酸氢钠，灭菌注射用水；

安捷伦1260高效液相色谱仪，配有紫外检测器和放射性检测器；

KERN ABS分析天平。

分析方法最优方案的建立

在HPLC系统中采用串联紫外检测器和放射性检测器，色谱柱选用可用于氟离子分析、条件更为温和的填料为含有丁铵基团的聚乙烯醇阴离子色谱柱，结合产品特性进行方法建立。

1、紫外检测器波长的确定

氟离子在不同紫外检测波长的比较：

取20μL 0.2mg/mL的氟化钠对照溶液进色谱系统，流动相流速为0.7mL/min，检测波长为190-225nm，比较得到的HPLC图谱中氟离子的峰面积。

氟离子在不同紫外检测波长的吸收峰如表1和图1所示：195nm检测波长条件下，氟离子峰面积最大，为870.9mAu·s，随着吸收波长的增加，峰面积逐渐减小。

氟离子紫外检测器波长的确定：

虽然氟离子在195nm处有最大吸收，但在该波长条件下存在末端吸收，在对灭菌注射用水和对照溶液的实际检测中也发现有其它未知峰出现，并且220nm条件下虽然不是最大吸收，但可检出氟离子，所以在方法选择时最终采用220nm作为检测波长。

表1氟离子最大吸收波长的确定

波长/nm	190	195	200	205	210	215	220	225
									峰面积/mAu·s	494.0	870.9	704.6	546.2	416.7	227.1	130.5	65.5
保留时间/min	5.220	5.241	5.283	5.286	5.300	5.292	5.295	5.287
									吸收类型	负峰	负峰	负峰	负峰	负峰	负峰	负峰	负峰

2、流速的确定

分别取20μL氟[¹⁸F]化钠注射液或灭菌注射用水稀释后的氟[¹⁸F]化钠注射液、0.2mg/mL溶于灭菌注射用水的氟化钠对照溶液和0.2mg/mL溶于0.045％NaCl溶液的氟化钠对照溶液进色谱系统，得到色谱图与保留时间，并进行计算理论塔板数、氟离子和氯离子色谱峰的分离度、氟[¹⁸F]化钠放射化学纯度、氟[¹⁸F]离子保留时间与氟离子保留时间差值和t_{理论延迟时间}±(t_{氟化钠对照溶液}×10％)值。将流速调为0.6mL/min和0.75mL/min，重复以上试验，计算上述值。

将流速调为0.6mL/min和0.75mL/min，重复以上试验，计算理论塔板数、氟离子和氯离子的分离度、氟[¹⁸F]化钠放射化学纯度、氟[¹⁸F]离子保留时间与氟离子保留时间差值和t_{理论延迟时间}±(t_{氟化钠对照溶液}×10％)，结果如表2所示。

表2放射化学纯度分析方法流速选择结果

三个不同流速条件下检测氟[¹⁸F]化钠时：(1)氟[¹⁸F]化钠放射化学纯度(峰面积％)≥98.5％；(2)色谱柱的理论塔板数≥900；(3)氟离子和氯离子的分离度(R)＞1.5；(4)氟[¹⁸F]离子的保留时间与氟离子的保留时间差值分别为0.562、0.480和0.411，均在相应条件的t_{理论延迟时间}±(t_{氟化钠对照溶液}×10％)范围之内。参照岛津Shodex IC色谱柱说明书中建议的最大流速为0.7mL/min，另外流速0.7mL/min可以满足检测要求，最后确定本方法最优的流速为0.7mL/min。

3、运行时间的确定

在研发过程中，氟[¹⁹F]化钠主峰的保留时间约为5分钟，阴离子杂质的保留时间约为14分钟，参考欧洲和英国药典运行时间采用15分钟(主成分保留时间的3倍)，可以满足实验要求。但在不同实验室中因不同批次色谱柱差异导致阴离子杂质的保留时间延至15分钟之后，故将运行时间延长至20分钟，且不同批次色谱柱的耐用性试验符合要求，故拟定本方法的运行时间为20分钟。

通过上述实验最终确定氟[¹⁸F]化钠注射液放射化学纯度的最优分析方法为：

检测器：紫外检测器和放射性检测器

紫外检测器波长：220nm

色谱柱：含有丁铵基团的聚乙烯醇阴离子色谱柱

流动相：2.5-3.5mmol/L Na₂CO₃和0.5-1.5mmol/L NaHCO₃混合溶液

流速：0.7mL/min

运行时间：20min

进样量：20μL

柱温：20-30℃

供试品溶液的制备：精密量取100μL灭菌注射用水，加入一定体积的氟[¹⁸F]化钠注射液混匀，稀释至放射性浓度在0.12～7.0mCi/mL浓度范围之内作为供试品溶液。

对照溶液的制备：精密称量10mg氟化钠对照品，用少量水溶解，转移至50mL容量瓶中定容，摇匀，即得。

按照上述确定的HPLC分析方法，精密量取供试品溶液和对照溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。紫外检测器和放射性检测器分别记录对照溶液中的氟离子和供试品溶液中氟[¹⁸F]离子，两种检测器之间存在时间差，即延迟时间，因此用氟离子定位氟[¹⁸F]离子，延迟时间应在t_{理论延迟时间}±(t_{氟化钠对照溶液}×10％)范围之内，供试品溶液的放射化学纯度应不低于98.5％。

计算公式：

氟[¹⁸F]离子和氟离子保留时间差＝氟[¹⁸F]离子保留时间－氟离子保留时间

最优分析方法验证

按照上述确定的HPLC分析方法，精密量取供试品溶液和对照溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

(1)专属性

分别取20μL氟[¹⁸F]化钠注射液或灭菌注射用水稀释后的氟[¹⁸F]化钠注射液、0.2mg/mL溶于灭菌注射用水的氟化钠对照溶液和0.2mg/mL溶于0.045％NaCl溶液的氟化钠对照溶液进样分析，并进行数据处理后得色谱分析报告。理论塔板数、氟离子和氯离子的分离度、氟[¹⁸F]化钠放射化学纯度、氟[¹⁸F]离子保留时间与氟离子保留时间差值和t_{理论延迟时间}±(t_{氟化钠对照溶液}×10％)。将流速调为0.75mL/min和0.6mL/min，重复以上试验，对相关数据进行计算。

各项测量标准要求为：氟[¹⁸F]化钠放射化学纯度(峰面积％)≥98.5％，用紫外检测器计算色谱柱的理论板数≥900，氟化钠和氯化钠的分离度(R)＞1.5，氟[¹⁸F]化钠与氟化钠对照品的保留时间差在t_{理论延迟时间}±(t_{氟化钠对照溶液}×10％)范围内。

表3放射化学纯度分析方法专属性验证结果

由表3可知：氟[¹⁸F]化钠注射液放射化学纯度分析方法，专属性试验验证合格。本方法其它条件保持不变，流动相流速在三个不同条件下，均能够将氟离子和氯离子有效分离；氟[¹⁸F]化钠注射液含有较高浓度氯离子，当改变流速时氟[¹⁸F]离子分析不受干扰，氟[¹⁸F]化钠放射化学纯度分析结果不受影响。

(2)线性和范围、检出限和定量限

选择高浓度的氟[¹⁸F]化钠注射液作为原液(以放射性检测器色谱图不出现平头峰为最高浓度选择标准)用灭菌注射用水稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍。分别取20μL 0.2mg/mL溶于灭菌注射用水的氟化钠对照溶液、氟[¹⁸F]化钠注射液原液和稀释后的氟[¹⁸F]化钠注射液进样分析。稀释后氟[¹⁸F]化钠注射液在进样时间点的放射性浓度(A_浓度，单位mCi/mL)：

式中A₀：¹⁸F活度初始测量值，为6.97mCi/mL；

109.8：¹⁸F的半衰期，单位为min；

t：稀释后样品与高浓度的氟[¹⁸F]化钠注射液的进样时间间隔，单位为min。

各项测量标准要求为：线性范围0.12～7.0mCi/mL，线性相关系数≥98％，检测限0.05mCi/mL，定量限0.27mCi/mL。

表4放射化学纯度分析方法线性和范围、检出限和定量限验证结果

由表4、图2和图3可知：氟[¹⁸F]化钠注射液放射化学纯度分析方法的检测线性范围为0.12～7.0mCi/mL，浓度在该范围内的样品与峰面积呈良好的线性关系，相关系数为0.9995。在该浓度范围内的样品可以直接检测，浓度低于0.12mCi/mL的样品不可以检测，浓度高于7.0mCi/mL样品需要用灭菌注射用水稀释到该浓度范围之内。本方法氟[¹⁸F]化钠的检测限为0.05mCi/mL，定量限为0.27mCi/mL。

(3)精密度

分别取20μL 0.2mg/mL溶于灭菌注射用水的氟化钠对照溶液和氟[¹⁸F]化钠注射液进色谱系统，氟[¹⁸F]化钠注射液平行测定六次，计算氟[¹⁸F]化钠放射化学纯度和峰面积的相对标准偏差，其中峰面积衰变校正至氟[¹⁸F]化钠第一针进样的时间。

各项测量标准要求为：放射化学纯度相对标准偏差应≤2.0％，氟[¹⁸F]化钠放射性峰面积相对标准偏差应≤4.0％，氟[¹⁸F]离子保留时间与氟离子保留时间的差值相对标准偏差应≤4.0％。

表5放射化学纯度分析方法精密度验证结果

由表5可知：对氟[¹⁸F]化钠注射液放射化学纯度分析方法的精密度进行研究，六次平行测试放射化学纯度相对标准偏差为0％；氟[¹⁸F]化钠放射性主峰峰面积相对标准偏差为3.89％；氟[¹⁸F]离子保留时间与氟离子保留时间差值的相对标准偏差为3.54％，均符合要求，验证合格。

(4)耐用性

将现有色谱条件做微小改动，每次试验只改动一个条件。流速调为0.68mL/min或0.72mL/min，柱温调为23℃或27℃，流动相调为2.5mmol/L碳酸钠和1.5mmol/L碳酸氢钠的混合溶液或3.5mmol/L碳酸钠和0.5mmol/L碳酸氢钠的混合溶液，更换同一型号不同批号色谱柱。分别取20μL氟[¹⁸F]化钠注射液或灭菌注射用水稀释后的氟[¹⁸F]化钠注射液和0.2mg/mL溶于灭菌注射用水的氟化钠对照溶液进色谱系统，并进行数据处理。

各项测量标准要求为：氟[¹⁸F]化钠放射化学纯度(峰面积％)≥98.5％，用紫外检测器计算色谱柱的理论板数≥900，氟[¹⁸F]化钠与氟化钠对照品的保留时间差在t_{理论延迟时间}±(t_{氟化钠对照溶液}×10％)范围内。

表6放射化学纯度分析方法耐用性验证结果

由表6看出：氟[¹⁸F]化钠注射液放射化学纯度分析方法，耐用性试验验证合格，当测定方法发生小的变动时，测定结果不受影响。

综上所述，本发明氟[¹⁸F]化钠注射液放射化学纯度分析方法的专属性、精密度、耐用性均符合要求。用该方法测定分析方法验证用六个批次的自制氟[¹⁸F]化钠注射液，放射化学纯度检验结果均符合规定，证明该方法能够准确有效的测定本品的放射化学纯度。

通过上述实验确定的放射化学纯度检验方法如下：

检测器：紫外检测器和放射性检测器

紫外检测器波长：220nm

色谱柱：含有丁铵基团的聚乙烯醇阴离子色谱柱

流动相：2.5-3.5mmol/L Na₂CO₃和0.5-1.5mmol/L NaHCO₃混合溶液

柱温：20-30℃

流速：0.7mL/min

运行时间：15min

进样量：20μL

现有欧洲药典放射化学纯度检验方法：

检测器：紫外检测器和放射性检测器

紫外检测器波长：220nm

色谱柱：强碱性阴离子交换色谱柱

柱温：20～30℃(选用25℃)

流动相：0.1mol/L NaOH溶液

流速：1mL/min

运行时间：15min

进样量：20μL

分别取20μL 0.2mg/mL溶于灭菌注射用水的氟化钠对照溶液、0.2mg/mL溶于0.045％NaCl溶液的氟化钠对照溶液和氟[¹⁸F]化钠注射液进色谱系统。比较本发明方法和欧洲药典方法对氟[¹⁸F]化钠注射液放射化学纯度检验结果的影响。

实验结果：

表7两种方法放射化学纯度检验结果比较

项目	本发明方法	欧洲药典方法
			氟离子保留时间(min)	5.258	1.402
氯离子保留时间(min)	8.147	1.500
			[<sup>18</sup>F]氟离子平均保留时间(min)(n＝3)	5.786	1.932
[<sup>18</sup>F]氟离子平均保留时间与[<sup>19</sup>F]氟离子保留时间差值(min)	0.528	0.530
			放射化学纯度(％)	100	100

从表7以及图4-图9中可以看出，用本发明氟[¹⁸F]化钠注射液放射化学纯度检验方法，两种方法中，[¹⁸F]氟离子平均保留时间与氟离子保留时间差值分别为0.528和0.530，无明显差异；但是，在本发明方法中，氟离子保留时间为5.258min，氯离子保留时间为8.147min，氟离子与氯离子能够实现较好的分离，而用欧洲药典氟[¹⁸F]化钠注射液放射化学纯度检验方法氟离子保留时间为1.402min，氯离子保留时间为1.500min，氟离子与氯离子无法分离。由此，说明本发明方法更适用于本品放射化学纯度的检验。

以上内容是结合具体实施方式对本发明所做的具体说明，不能认定本发明的具体实施方式仅限于这些说明。对本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和变换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，其特征在于，色谱条件为：

色谱柱选用阴离子交换柱；

流动相为2.5-3.5mmol/L Na₂CO₃和0.5-1.5mmol/L NaHCO₃混合溶液；

检测器为串联的紫外检测器和放射性检测器。

2.根据权利要求1所述的氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述色谱柱填料为含有丁铵基团的聚乙烯醇。

3.根据权利要求1所述的氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，其特征在于，检测波长为190-225nm。

4.根据权利要求1所述的氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，其特征在于，检测波长为220nm。

5.根据权利要求1所述的氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述交换柱的柱温为20-30℃。

6.根据权利要求1所述的氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.6-0.75mL/min。

7.根据权利要求1所述的氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.7mL/min。

8.根据权利要求1所述的氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，其特征在于，运行时间为15-20min。

9.根据权利要求1所述的氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述注射液的进样量为20μL。

10.根据权利要求1所述的氟[¹⁸F]化钠注射液放化纯的高效液相色谱分析方法，其特征在于，所述分析方法的检测线性范围为0.12～7.0mCi/mL。

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