CN102768282B - 一种检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的制备及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的制备及检测方法，制备方法是，鲢鱼VTG的诱导和分离制备纯化的鲢鱼VTG冻干粉；制备特异性的抗VTG多克隆抗体，即一抗；将纯化的鲢鱼VTG冻干粉、一抗和酶标记的二抗及酶标板放入试剂盒内，得检测鲢鱼VTG试剂盒。测试方法是，用纯化的鲢鱼VTG冻干粉作为标准蛋白并在酶标板中加入稀释的样品溶液；加入一抗到酶标板保温反应；加入酶标记的二抗到酶标板保温反应；加入3,3,5,5-四甲基联苯胺底物溶液显色反应，用酶标仪测定吸光度值，计算鲢鱼样品中VTG的浓度。本发明能快速测试鲢鱼血清、匀浆液等中VTG的含量，分析灵敏度高，测试时间短，具有省时、省力的优点，适合于大量样品的分析和筛选。
Description
技术领域
本发明属于淡水产品环境分析领域，具体涉及一种检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的制备及检测方法。
背景技术
类雌激素是一类具有雌激素活性, 能够模拟雌激素功能的环境化学物。研究表明人类的许多生殖障碍、发育异常及某些癌症的发生都与类雌激素有关。这些污染物在环境中的最终归宿是各种水体，并通过食物链的传递在鱼体内富集，而卵黄蛋白原（VTG）是鱼体中类雌激素污染的特异性生物标志物。目前对蛋白质进行定量分析主要有高压液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）和液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）等化学分析方法，但由于化学分析需要提取、富集和浓缩等步骤，前处理复杂，费时、费力，灵敏度低，不适合大量样品的分析和筛选。
鲢鱼是我国主要的水产养殖和加工品种，而卵黄蛋白原的主要分子特征在种间都存在较大变异性，因此需要在鲢鱼VTG纯化和特异性多克隆抗体产生基础上制备检测鲢鱼卵黄蛋白原的试剂盒，用来快速测定鲢鱼血清、匀浆液及相关液体样本中VTG的含量，以此评价鲢鱼体内类雌激素污染状况，为我国类雌激素污染控制决策的制定提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种能快速测定鲢鱼血清、匀浆液及相关液体样本中VTG的含量，以此评价鲢鱼体内类雌激素污染状况的检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的制备及检测方法。
本发明目的的实现方式为，一种检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的制备方法，具体步骤如下，
（1）鲢鱼卵黄蛋白原的诱导和分离纯化：
①配制100ng/L 的17α-乙炔基雌二醇充气水溶液，将3-4月龄的鲢鱼幼鱼养殖在配制的水溶液中，暴露10天，断尾采血获得血清；
②血清通过阴离子交换层析柱，所述阴离子交换层析柱填料为DEAE Sepharose CL-6B，阴离子交换层析柱用pH 7.5、0.025M Tris-HCl缓冲液平衡，加入1ｍＬ血清样品，用含0.1-0.5M NaCl 、pH 7.5的0.025M Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，经电泳鉴定，收集含卵黄蛋白原蛋白的洗脱液，透析脱盐后，冷冻干燥制备纯化的鲢鱼VTG冻干粉；
（2）鲢鱼卵黄蛋白原多克隆抗体的制备：
①大白兔先用弗氏完全佐剂进行预免疫，一周后将0.5mg/mL的卵黄蛋白原蛋白液与弗氏完全佐剂按照1:1的比例进行初次免疫，两周后将0.5mg/mL的卵黄蛋白原蛋白液与弗氏不完全佐剂按照1:1的比例进行重复免疫；
②15天后，从兔耳缘静脉抽取少量血液测量抗体的效价；若抗体效价足够高，则从兔颈动脉放血，制备鲢鱼卵黄蛋白原的抗血清，抗血清经辛酸硫酸铵法纯化，透析离心后得到特异性的抗VTG多克隆抗体（即一抗），分装保存；
（3）鲢鱼卵黄蛋白原检测试剂盒制备：将步骤（1）②制备的纯化的鲢鱼VTG冻干粉、步骤（2）②制备的一抗和酶标记的二抗及酶标板放入试剂盒内得检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒。
一种用鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒检测鲢鱼体内VTG的方法，其步骤如下：
（1）用权利要求1步骤（1）②制备的纯化的鲢鱼VTG冻干粉作为标准蛋白，在酶标板中按照100μL/孔量加入0.025M Tris-HCl稀释的样品溶液和梯度稀释的VTG标准蛋白溶液，制作标准曲线，放入湿盒后4℃过夜；
（2）倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔量加入稀释1:2000倍的抗鲢鱼VTG多克隆抗体到酶标板，37℃保温反应0.5h；
（3）倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔量加入稀释1:2000倍的酶标记的二抗到酶标板，37℃保温反应0.5h；
（4）倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次，拍干后，按照100μL/孔量加入配制好的3,3,5,5-四甲基联苯胺底物溶液，37℃下显色反应15min后，按照50μL/孔加入2M硫酸终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸光度值，根据步骤（1）制作的标准曲线来计算鲢鱼样品中VTG的浓度。
本发明通过分离纯化鲢鱼体内的VTG，然后免疫大白兔制备多克隆抗体，从而制备出检测鲢鱼体内VTG的酶联免疫吸附测定试剂盒，采用本检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒能快速测定鲢鱼血清、匀浆液及相关液体样本中VTG的含量，以此评价 鲢鱼体内类雌激素污染的状况，为我国类雌激素污染控制决策的制定提供科学依据。
本发明不需化学分析提取、富集和浓缩等复杂的前处理步骤，可以直接分析鲢鱼血清、匀浆液及相关液体样本中VTG的含量，分析灵敏度高，低至1.95ng/mL，检测时间短，仅需3-4小时，具有省时、省力的优点，适合于大量样品的分析和筛选。
附图说明
图1是EE2诱导的鲢鱼血浆中蛋白质的洗脱图谱，
图2是鲢鱼血浆中蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）图谱，
图3是鲢鱼VTG试剂盒的测试流程图，
图4 是鲢鱼VTG试剂盒测试的标准曲线图，
图5是鲢鱼幼鱼经不同浓度17β-雌二醇暴露后体内卵黄蛋白原的浓度。
具体实施方式
本发明制备检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的方法是，先进行鲢鱼卵黄蛋白原的诱导和分离纯化，制备出纯化的鲢鱼VTG冻干粉；再进行鲢鱼卵黄蛋白原多克隆抗体的制备，制备出特异性的抗VTG多克隆抗体，即一抗；最后将纯化的鲢鱼VTG冻干粉、一抗和市面上已有的酶标记的二抗及市面上已有的酶标板放入试剂盒内，得检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒。
用检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒检测鲢鱼体内VTG的方法按图3所示的流程进行，用纯化的鲢鱼VTG冻干粉作为标准蛋白，并在酶标板中加入稀释的样品溶液；加入稀释的抗鲢鱼VTG多克隆抗体到酶标板，保温反应；加入稀释的酶标记的二抗到酶标板，保温反应；加入3,3,5,5-四甲基联苯胺底物溶液，显色反应15min后，加入2M硫酸终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸光度值，根据标准曲线计算鲢鱼样品中VTG的浓度。
为确定鲢鱼卵黄蛋白原的诱导和分离纯化，本申请人作了鲢鱼VTG的诱导、分离纯化及鉴定试验。
试验步骤为：
将3-4月龄的鲢鱼幼鱼100条暴露于100ng/L乙炔基雌二醇（EE2）中，诱导鲢鱼幼鱼体内产生VTG，10天后断尾采血用于卵黄蛋白原的分离纯化。结合阴离 子交换介质DEAE- Sephrarose CL-6B和液相层析技术来分离鲢鱼血浆中的卵黄蛋白原。装阴离子交换层析柱后，用0.025M，pH 7.5的Tris-HCl缓冲液预平衡过夜。上1ｍＬ血清样品后，用NaCl-Tris-HCl洗脱缓冲液（0.1-0.5M NaCl，0.025M Tris-HCl，pH 7.5）进行梯度洗脱，为防止卵黄蛋白原的酶解，在洗脱缓冲液中加入酶抑制剂PMSF至终浓度为2mM，洗脱速度为1ml/min，每3分钟收集一管洗脱组分。
由于卵黄蛋白原对热敏感，购买的色谱柱带有冷凝水夹套，且所有的操作都在低温下进行，洗脱缓冲液都要先置于４℃冰箱中预冷。用分光光度计检测每管洗脱组分280nm处的吸光度值，以显示洗脱液中成份的变化和蛋白质的浓度，鲢鱼血浆中蛋白质的洗脱图谱见图1。
分离出的蛋白质组分最终通过电泳确定是否为卵黄蛋白原（见图2），电泳按照Bio-Rad的仪器说明书进行，SDS-PAGE电泳浓缩胶和分离胶的凝胶浓度分别为4%和7%，电压为恒压100V，样品在电泳前，都进行了适当的稀释（100倍稀释的诱导后的鲢鱼血清；50倍稀释的鲢鱼对照血清；10倍和100倍稀释的经纯化后的鲢鱼VTG），以获得最佳的电泳效果，电泳结束后，蛋白质组分用考马斯亮蓝R-250染色。含VTG的洗脱组分集中后在双蒸水中透析48h，然后用于冻干粉或VTG多克隆抗体的制备。
图1是鲢鱼血浆中蛋白质的洗脱图谱，由于卵黄蛋白原是一种磷脂蛋白，它可与阴离子交换介质紧密结合，其洗脱时间较长，可通过色谱柱的长度和改变淋洗缓冲溶液离子强度的变化，将血浆中的卵黄蛋白原与其它杂蛋白分离开来。利用SDS-PAGE电泳检测了图1中的几种主要蛋白组分，结果显示鲢鱼的第三个主峰的蛋白组分分子量很高（图2），都是由两个主要亚基组成的，从图2中可以看到这两条蛋白带在没有诱导的性成熟雄鱼体内没有，仅出现在EE2诱导后的鲢鱼幼鱼血浆中，因此可以确定洗脱图谱的第三个主峰为鲢鱼VTG。
本申请人做了利用制备的试剂盒和测试方法分析鲢鱼幼鱼经不同浓度17β-雌二醇（E2）暴露后体内卵黄蛋白原的浓度试验。
试验步骤为：
将鲢鱼幼鱼暴露于E2的下列几个浓度：空白对照，20，50，100，200ng/L，对照组中仅加入助溶剂二甲基亚砜（DMSO），保证水溶液中DMSO的浓度小于0.01%， 幼鱼暴露实验在10L玻璃缸中进行，每个暴露组随机选取12尾实验鱼进行暴露，每天更换80%暴露溶液, 10天后采样，称重后，采集血样制备血清后于-80℃保存待分析。
卵黄蛋白原含量的测定按照图3的测试流程进行：用纯化的鲢鱼VTG作为标准蛋白，用鲢鱼VTG多克隆抗体作为一抗。在96微孔酶标板中加入0.025M Tris-HCl稀释的样品溶液和梯度稀释的鲢鱼VTG标准样品（100μl/孔），放入湿盒后4℃过夜；倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔加入稀释1:2000倍的抗鲢鱼VTG多克隆抗体到酶标板，37℃保温0.5h；倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔加入稀释1:2000倍的酶标记的二抗到酶标板，37℃保温0.5h；倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔加入配制好的3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，37℃下显色反应15min后，按照50μL/孔加入2M硫酸终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸光度值，根据样品的吸收强度通过图4的鲢鱼VTG试剂盒测试的标准曲线，计算鲢鱼样品中VTG的浓度（μg/g）。图4的标准曲线中，横坐标为鲢鱼VTG浓度，纵坐标为450nm处的吸光度值。
图5为雌激素E2暴露对鲢鱼幼鱼体内卵黄蛋白原的诱导。从图5可见, 鲢鱼幼鱼体内卵黄蛋白原的诱导与E2暴露浓度有很好的相关性。在暴露前鲢鱼幼鱼体内VTG的含量很低，经E2暴露后，100ng/L暴露组鲢鱼幼鱼体内VTG就开始有显著诱导，说明本试剂盒可以对鲢鱼体内VTG的含量能进行快速定量测定，并用来评价鲢鱼体内类雌激素污染的状况。
Claims (3)
1.一种检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的制备方法，其特征在于具体步骤如下，
(1)鲢鱼卵黄蛋白原的诱导和分离纯化：
①配制100ng/L的17α-乙炔基雌二醇充气水溶液，将3-4月龄的鲢鱼幼鱼养殖在配制的水溶液中，暴露10天，诱导鲢鱼幼鱼体内产生大量VTG，断尾采血获得血清；
②血清通过阴离子交换层析柱，所述阴离子交换层析柱填料为DEAESepharose CL-6B，阴离子交换层析柱用pH7.5、0.025M Tris-HCl缓冲液平衡，加入1mL血清样品，用含0.1-0.5M NaCl、pH7.5的0.025M Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，洗脱缓冲液中加入酶抑制剂PMSF至终浓度为2mM，洗脱速度为1ml/min，每3分钟收集一管洗脱组分，透析脱盐后，冷冻干燥制备纯化的鲢鱼VTG冻干粉；
(2)鲢鱼卵黄蛋白原多克隆抗体的制备：
①大白兔先用弗氏完全佐剂进行预免疫，一周后将0.5mg/mL的卵黄蛋白原蛋白液与弗氏完全佐剂按照1:1的比例进行初次免疫，两周后将0.5mg/mL的卵黄蛋白原蛋白液与弗氏不完全佐剂按照1:1的比例进行重复免疫；
②15天后，从兔耳缘静脉抽取少量血液测量抗体的效价；若抗体效价高，则从兔颈动脉放血，制备鲢鱼卵黄蛋白原的抗血清，抗血清经辛酸硫酸铵法纯化，透析离心后得到特异性的抗VTG多克隆抗体，即一抗，分装保存；
(3)鲢鱼卵黄蛋白原检测试剂盒制备：将步骤(1)②制备的纯化的鲢鱼VTG冻干粉、步骤(2)②制备的一抗、酶标记的二抗及酶标板放入试剂盒内，得检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒。
2.根据权利要求1所述的一种检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒的制备方法，其特征在于将3-4月龄的鲢鱼幼鱼100条暴露于100ng/L的17α-乙炔基雌二醇充气水溶液中。
3.一种用权利要求1所述的检测鲢鱼卵黄蛋白原试剂盒检测鲢鱼体内VTG的方法，其特征在于其步骤如下：
(1)用权利要求1步骤(1)②制备的纯化的鲢鱼VTG冻干粉作为标准蛋白，在酶标板中按照100μL/孔量加入0.025M Tris-HCl稀释的样品溶液和梯度稀释的VTG标准蛋白溶液，制作标准曲线，放入湿盒后4℃过夜；
(2)倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔量加入稀释1:2000倍的抗鲢鱼VTG多克隆抗体到酶标板，37℃保温反应0.5h；
(3)倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次拍干后，按照100μL/孔量加入稀释1:2000倍的酶标记的二抗到酶标板，37℃保温反应0.5h；
(4)倒出剩余的溶液，用洗板液清洗4次，拍干后，按照100μL/孔量加入配制好的3,3,5,5-四甲基联苯胺底物溶液，37℃下显色反应15min后，按照50μL/孔加入2M硫酸终止反应，用酶标仪测定450nm处的吸光度值，根据步骤(1)制作的标准曲线来计算鲢鱼样品中VTG的浓度。
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