CN101196520A - 膝沟藻毒素gtx2,3间接竞争elisa检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种膝沟藻毒素GTX2，3进行检测的间接竞争ELISA方法，该方法包括抗原预包被条的制备和膝沟藻毒素的检测，本发明利用得到的可分泌抗GTX2，3单克隆抗体的阳性细胞可大量制得抗膝沟藻毒素2，3的单克隆抗体，所建立的方法成本低廉，可快速、简便、灵敏地测定样品中GTX2，3的含量。本发明可以大规模地对海洋鱼贝类食品中残留的麻痹性贝类毒素进行快速、灵敏的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种利用抗膝沟藻毒素GTX2，3的单克隆抗体对膝沟藻毒素GTX2，3进行检测的间接竞争ELISA方法。
背景技术
麻痹性贝毒是一种低分子量、高毒性的贝毒，生存于海洋微藻中，主要通过对钠离子通道的影响而抑制神经的传导，为神经毒素的一种。膝沟藻毒素(gonyautoxin，GTX)为麻痹性贝类毒素(Paralytic Shellfish Posoning，PSP)家族中重要的成员之一，是一类含双胍基的三环生物碱化合物，呈碱性，易溶于水，在弱酸和低温条件下比较稳定。调查显示我国南北海区均存在可产生麻痹性贝毒的赤潮藻，且在多个样点发现了多种贝类含有麻痹性贝毒素。曾检测出广东大亚湾贝类养殖区麻痹性贝毒含量达117Mu/g，超过可食用阈值近30倍。已有资料显示，GTX2，3是我国南方沿海染毒贝类和有毒赤潮藻的麻痹性贝毒的主要成分之一。
GTX2的分子结构 GTX3的分子结构
目前麻痹性贝毒的检测方法主要有：
(1)小白鼠生物法：是将藻或贝等生物组织的萃取液注射进小鼠腹腔，根据小鼠死亡时间，查对Sommer表，判断毒性大小。该方法的特点是不需要昂贵的仪器，操作简便，但耗时长、误差大、重现性差，同时有违动物保护条例，在西方国家已不主张使用。
(2)高效液相色谱分析(HPLC)：其原理是样品中的毒素在氧化剂的作用下生成荧光性物质，在荧光检测器上检测。目前使用较多的是柱后氧化法。HPLC检测法的特点是灵敏、准确，能确定样品中毒素的具体成分等，但是该方法需要复杂的仪器设备，专门的分析技术人员，且标准品价格昂贵，前处理麻烦，不能同时检测大量样品，不适合现场及大规模的推广应用。
(3)细胞毒检测技术：根据麻痹性贝类毒素可以阻断Na+内流这一作用机制，在培养的细胞中加入Na+通道活化剂乌本苷，如果没有麻痹性贝毒的存在，细胞会因Na+内流过多而肿胀死亡，而麻痹性贝毒可有效抑制这一过程，从而实现对毒素的检测。但此种方法需要特殊的装置，难以普及。
(4)传统化学分析法：以Bates等(1975)提出的氧化/荧光技术应用最广。其步骤是在碱性条件下用H2O2氧化PSP，使其生成具有荧光的物质，再测定其荧光值。荧光值越高，毒素的毒性越大。许多学者应用近代化学技术对麻痹性贝毒毒素做了进一步的探索研究，已见报道的分离方法有薄层层析法、离子交换柱层析法、电泳法等。这些方法灵敏度高，但很费时，而且不能分离出含量低的组分，限制了它们在日常毒性检测中的应用。
(5)免疫学检测技术：目前较多应用于麻痹性贝类毒素检测的是酶联免疫吸附检测法(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA)和胶体金试纸条检测法，其检测的原理是将PSP毒素与载体蛋白偶联免疫动物，获得针对毒素的抗体，利用样品中的毒素与标准毒素竞争结合抗体并以此对样品中的毒素进行定性或定量分析。该法简便、快速，可同时分析大批量样品。
目前国外已经有商品化的PSP酶免疫学检测试剂盒上市，但是价格昂贵，检测一个样品的价格都是在200元以上，同时这些试剂盒都是利用抗石房蛤毒素抗体所制备，而我国多发的PSP毒素是GTX，故并不适合在我国推广使用。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的不足之处，本发明的目的在于提供一种利用抗GTX2，3单克隆抗体检测GTX2，3的间接竞争ELISA方法，该方法可以大规模地对海洋鱼贝类食品中残留的麻痹性贝类毒素进行快速、灵敏的检测，保障我国海产品食用安全及维护我国在相关国际贸易领域中的利益。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种膝沟藻毒素GTX2，3间接竞争ELISA检测方法，包括如下步骤：分别将鱼贝类样品提取液和系列浓度的GTX2，3标准液加入到抗原预包被条的微孔中；然后加入抗GTX2，3单克隆抗体到每个微孔，混合后孵育；在每个微孔中依次加入生物素化羊抗鼠IgG多抗和辣根过氧化物酶标记亲和素，孵育；在每个微孔加入显色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物工作液反应后，再在每个微孔中加入终止液终止反应；用酶联读数仪测定每个微孔的OD(吸光度)值；对照标准液所得的曲线回归方程，计算出鱼贝类样品中实际的GTX2，3浓度。
上述膝沟藻毒素GTX2，3间接竞争ELISA检测方法，包括如下步骤：
(1)分别将50μL处理好的鱼贝类样品提取液和50μL系列浓度的GTX2，3标准液加入到抗原预包被条的微孔中；然后加入50μL用稀释液1∶800稀释的抗GTX2，3单克隆抗体到每个微孔，混合，37℃孵育0.5～0.75h；然后用洗涤液洗涤各微孔3～5次；
(2)在每个微孔中加入100μl用稀释液1∶2000稀释的生物素化羊抗鼠IgG多抗，37℃孵育0.5～0.75h；然后用洗涤液洗涤各微孔3～5次；
(3)在每个微孔中加入100μl用稀释液1∶6000稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素，37℃孵育0.5～0.75h；然后用洗涤液洗涤各微孔3～5次；
(4)在每个微孔加入100μL显色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物工作液，反应15～20min；
(5)在每个微孔中加入50μL 2M H2SO4(终止液)终止反应，并振荡混匀；
(6)用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD(吸光度)值；
(7)将所得标准液和鱼贝类样品的吸光度值除以0标准(0μg/L的标准液)的吸光度值再乘以100％，以此标准液计算值为纵坐标，GTX2，3浓度(ppb)的对数为横坐标绘制标准曲线；根据每个样品的B/B0值从标准曲线上读出对应的GTX2，3浓度，再乘以相应的稀释倍数，计算出鱼贝类样品中实际的GTX2，3浓度。
所述的稀释液和洗涤液均为含0.05％(体积百分比)吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液。
为了更好地实现本发明，所述鱼贝类样品提取液按下述方法预处理：将均质后的10g鱼肉或贝肉加入10～20ml 0.1M的HCl，煮沸并搅拌5分钟，4℃3500g离心10分钟，离心后用5N的盐酸调节PH到4.0以下，取100μl上清液，用稀释液1∶10(体积比)稀释。
所述的抗GTX2，3单克隆抗体按下述方法制备而成：用甲醛法将GTX2，3偶联到血蓝蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗GTX2，3单克隆抗体(MAb-GTX2，3)的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化，获得抗GTX2，3单克隆抗体。
所述抗原预包被条是按下述方法制备而成：
(a)包被：用pH9.6的0.05M碳酸钠缓冲液或0.01～0.05M pH7.4磷酸盐缓冲液将GTX2，3-葡萄糖氧化酶稀释至5μg/mL，每孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板微孔中，4℃包被过夜或37℃包被2～3h；
(b)洗涤：倒出微孔板微孔中上述液体后，将200～300μl洗涤液加入微孔中；然后倒出微孔板微孔中的液体，完全除去微孔板微孔中的液体；
(c)封闭：每孔微孔加入150～200μL含0.5～3％牛血清白蛋白的0.01～0.05M pH7.4磷酸盐缓冲液，37℃封闭1.5～0.5h；
(d)洗涤：按步骤(b)洗涤3～5次；
(e)保护：加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时；
(f)干燥：微孔板干燥后，即得到抗原预包被条。
上述膝沟藻毒素GTX2，3进行检测的间接竞争ELISA方法可在检测海洋鱼贝类食品等中的应用。
本发明是将GTX2，3-葡萄糖氧化酶(GTX2，3-GOX)包被96孔酶标板，加入GTX2，3标准品和待测样品，再加入抗GTX2，3单克隆抗体，包被抗原GTX2，3-GOX(GTX2，3-葡萄糖氧化酶)与游离的GTX2，3竞争抗GTX2，3单克隆抗体，洗去游离的GTX2，3与抗GTX2，3单克隆抗体(MAb-GTX2，3)的复合物，与包被抗原GTX2，3-GOX结合的MAb-GTX2，3再与生物素化羊抗鼠IgG多抗结合，然后生物素又可与酶标记的亲和素结合，经底物显色后终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光度(OD)，OD值越大，样品中自由的GTX含量越少，对照标准品所得的曲线回归方程，计算样品中GTX2，3的含量。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
本发明利用得到的分泌抗GTX2，3单克隆抗体的阳性细胞可大量制得抗膝沟藻毒素2，3的单克隆抗体，所建立的方法成本低廉，可快速、简便、灵敏地测定样品中GTX2，3的含量。该方法可以大规模地对海洋贝类食品中残留的麻痹性贝类毒素进行快速、灵敏的检测，保障我国海产品食用安全及维护我国在相关国际贸易领域中的利益。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
试剂的配制：
稀释液及洗涤液均为PBS-T即含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液(KH2PO4 0.2g，Na2PO4·12H2O 2.9g，NaCl 8g，定容至1000ml，pH7.4，再加0.5ml吐温-20)；显色液为TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物工作液；终止液为2M硫酸溶液即量取111.2ml浓硫酸(18M)稀释定容至1000mL。
实施例1
利用抗GTX2，3单克隆抗体检测GTX2，3的间接竞争ELISA方法，包括如下步骤：
(A)用甲醛法将GTX2，3偶联到血蓝蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗GTX2，3单克隆抗体(MAb-GTX2，3)的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，蛋白A柱纯化，获得抗GTX2，3单克隆抗体。
(B)用高碘酸盐氧化法偶联得到GTX2，3-葡萄糖氧化酶。
(C)抗原预包被条的制备：
(a)包被：用包被缓冲液(0.05M碳酸钠缓冲液，pH9.6)将GTX2，3-葡萄糖氧化酶(GTX2，3-GOX)(Glucose Oxidase，葡萄糖氧化酶)稀释至5μg/mL，每孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板微孔中，4℃包被过夜。
(b)洗涤：倒出微孔板孔中包被缓冲液后，将微孔板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用洗瓶或多通道移液器将250μl洗涤液加入孔中。3分钟后再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体。
(c)封闭：每孔加入150μL含0.5％(w/v)BSA(Bovine serum album，牛血清白蛋白)的0.01M PBS(Phosphate-Buffered Saline，磷酸盐缓冲液，pH7.4)，37℃封闭1.5h；
(d)按步骤(2)洗涤微孔3次；
(e)加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时；
(f)干燥：置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存。
(D)样品预处理(贝肉样品提取液)
除去贝壳，用双蒸水洗净贝肉后均质器均质，称取10g均质后的样品加入10ml 0.1M的HCl，煮沸并搅拌5分钟，4℃ 3500g离心10分钟，离心后用5N的盐酸调节PH到4.0以下，取100μl上清液，用稀释液1∶10(体积比)稀释。
(E)膝沟藻毒素的检测
(1)分别加入50μL系列浓度：0ppb(相当于μg/L、μg/kg)、30ppb、60ppb、120ppb、240ppb、480ppb的GTX2，3标准液和50μL上述处理好的贝肉样品提取液到每个微孔中；
(2)加入50μL用稀释液1∶800稀释的抗GTX2，3单克隆抗体到已有标准液或贝肉样品的每个微孔中，轻轻混合，37℃孵育0.75h；然后用洗涤液洗涤各微孔3次；
(3)在每个微孔中加入100μl用稀释液1∶2000稀释的生物素化羊抗鼠IgG多抗，37℃孵育0.75h；用洗涤液洗涤各微孔3次；
(4)在每个微孔中加入100μl用稀释液1∶6000稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素，37℃孵育0.5h；然后用洗涤液洗涤各微孔3次；
(5)每孔加入100μL显色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物工作液，反应15min；
(6)每孔加入50μL2M H2SO4(终止液)终止反应，并轻轻振荡混匀；
(7)在15分钟内用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD(吸光度)值。标准液读数依次为1.516、1.198、1.031、0.834、0.606和0.334，样品读数为1.102。
(F)结果判定标准
将所得标准液和样品吸光度值除以0标准(0μg/L的标准液)的吸光度值再乘以100％，以此标准液计算值为纵坐标，GTX2，3浓度(ppb)的对数为横坐标绘制标准曲线。
根据每个样品的B/B0值就可以从上述标准曲线上读出对应的GTX2，3浓度，再乘以相应的稀释倍数，最终计算出样品中实际的GTX2，3浓度为46.99ppb。样品中GTX2，3的含量测定结果为939.8μg/kg。
实施例2
利用抗GTX2，3单克隆抗体检测GTX2，3的间接竞争ELISA方法，包括如下步骤：
(A)用甲醛法将GTX2，3偶联到血蓝蛋白(KLH)上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗GTX2，3单克隆抗体(MAb-GTX2，3)的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，蛋白A柱纯化，获得抗GTX2，3单克隆抗体。
(B)用高碘酸盐氧化法偶联得到GTX2，3-葡萄糖氧化酶。
(C)抗原预包被条的制备：
(a)包被：用包被缓冲液(0.05M碳酸钠缓冲液，pH9.6)将GTX2，3-葡萄糖氧化酶(GTX2，3-GOX)(Glucose Oxidase，葡萄糖氧化酶)稀释至5μg/mL，每孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板微孔中，37℃包被3h。
(b)洗涤：倒出微孔板孔中包被缓冲液后，将微孔板倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用洗瓶或多通道移液器将300μl洗涤液加入孔中。3分钟后再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体。
(c)封闭：每孔加入200μL含3％BSA(Bovine serum album，牛血清白蛋白)的0.01M PBS(Phosphate-Buffered Saline，磷酸盐缓冲液，pH7.4)，37℃封闭0.5h；
(d)按步骤(b)用洗涤液洗涤微孔5次；
(e)加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时；
(f)干燥：置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装袋中保存待用。
(D)样品预处理(鱼肉样品提取液)
用双蒸水洗净鱼肉后均质器均质，称取10g均质后的鱼肉加入10ml 0.1M的HCl(如果样品为较干燥的鱼肉则加入20ml 0.1M的HCl，稀释系数等同)，煮沸并搅拌5分钟，4℃ 3500g离心10分钟，离心后用5N的盐酸调节PH到4.0以下，取10μl上清液，用稀释液1∶10(体积比)稀释。
(E)膝沟藻毒素的检测
(1)分别加入50μL系列浓度：0ppb(相当于μg/L、μg/kg)、30ppb、60ppb、120ppb、240ppb、480ppb的GTX2，3标准液和50μL上述处理好的鱼肉样品提取液到每个微孔中；
(2)加入50μL用稀释液1∶800稀释的抗GTX2，3单克隆抗体到已有标准液或鱼肉样品的微孔中，轻轻混合，37℃孵育0.75h；然后按步骤(b)用洗涤液洗涤各微孔5次；
(3)在每个微孔中加入100μl用稀释液1∶2000稀释的生物素化羊抗鼠IgG多抗，37℃孵育0.5h；然后用洗涤液洗涤各微孔5次；
(4)在每个微孔中加入100μl用稀释液1∶6000稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素，37℃孵育0.75h；然后用洗涤液洗涤各微孔5次；
(5)每孔加入100μL显色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物工作液，反应20min；
(6)每孔加入50μL2M H2SO4(终止液)终止反应，并轻轻振荡混匀；
(7)在15分钟内用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD(吸光度)值。标准液读数依次为1.435、1.179、0.947、0.779、0.568和0.315，样品读数为0.899。
(F)结果判定标准
将所得标准液和样品吸光度值除以0标准(0ppb(μg/L)的标准液)的吸光度值再乘以100％，以此标准液计算值为纵坐标，GTX2，3浓度(ppb)的半对数为横坐标绘制标准曲线。
根据每个样品的B/B0值就可以从上述标准曲线上读出对应的GTX2，3浓度，再乘以相应的稀释倍数，最终计算出样品中实际的GTX2，3浓度为75.19ppb。样品中GTX2，3的含量测定结果为1.504mg/kg。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种膝沟藻毒素GTX2，3间接竞争ELISA检测方法，其特征在于包括如下步骤：分别将鱼贝类样品提取液和系列浓度的GTX2，3标准液加入到抗原预包被条的微孔中；然后加入抗GTX2，3单克隆抗体到每个微孔，混合后孵育；在每个微孔中依次加入生物素化羊抗鼠IgG多抗和辣根过氧化物酶标记亲和素，孵育；在每个微孔加入显色液TMB底物工作液反应后，再在每个微孔中加入终止液终止反应；用酶联读数仪测定每个微孔的OD值；对照标准液所得的曲线回归方程，计算出鱼贝类样品中实际的GTX2，3浓度。
2.根据权利要求1所述的一种膝沟藻毒素GTX2，3间接竞争ELISA检测方法，其特征在于：
(1)分别将50μL处理好的鱼贝类样品提取液和50μL系列浓度的GTX2，3标准液加入到抗原预包被条的微孔中；然后每孔加入50μL用稀释液1∶800稀释的抗GTX2，3单克隆抗体到每个微孔，混合，37℃孵育0.5～0.75h；用洗涤液洗涤各微孔3～5次；
(2)在每个微孔中加入100μl用稀释液1∶2000稀释的生物素化羊抗鼠IgG多抗，37℃孵育0.5～0.75h；用洗涤液洗涤各微孔3～5次；
(3)在每个微孔中加入100μl用稀释液1∶6000稀释的辣根过氧化物酶标记亲和素，37℃孵育0.5～0.75h；用洗涤液洗涤各微孔3～5次；
(4)在每个微孔加入100μL显色液TMB底物工作液，反应15～20min；
(5)在每个微孔中加入50μL终止液2M H2SO4终止反应，并振荡混匀；
(6)用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD值；
(7)将所得标准液和鱼贝类样品的吸光度值除以0标准的吸光度值再乘以100％，以此标准液计算值为纵坐标，GTX2，3浓度的对数为横坐标绘制标准曲线；根据每个样品的B/B0值从标准曲线上读出对应的GTX2，3浓度，再乘以相应的稀释倍数，计算出鱼贝类样品中实际的GTX2，3浓度；
所述的稀释液和洗涤液均为含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求2所述的一种膝沟藻毒素GTX2，3间接竞争ELISA检测方法，其特征在于：所述鱼贝类样品提取液按下述方法预处理：将均质后的10g鱼肉或贝肉加入10～20ml 0.1M的HCl，煮沸并搅拌5分钟，4℃ 3500g离心10分钟，离心后用5N的盐酸调节PH到4.0以下，取100μl上清液，用稀释液1∶10体积比稀释。
4.根据权利要求2所述的一种膝沟藻毒素GTX2，3间接竞争ELISA检测方法，其特征在于：所述的抗GTX2，3单克隆抗体按下述方法制备而成：用甲醛法将GTX2，3偶联到血蓝蛋白上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗GTX2，3单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化，获得抗GTX2，3单克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的一种膝沟藻毒素GTX2，3间接竞争ELISA检测方法，其特征在于：所述抗原预包被条是按下述方法制备而成：
(a)包被：用pH9.6的0.05M碳酸钠缓冲液或0.01～0.05M pH7.4磷酸盐缓冲液将GTX2，3-葡萄糖氧化酶稀释至5μg/mL，每孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板微孔中，4℃包被过夜或37℃包被2～3h；
(b)洗涤：倒出微孔板微孔中上述液体后，将200～300μl洗涤液加入微孔中；然后倒出微孔板微孔中的液体，完全除去微孔板微孔中的液体；
(c)封闭：每孔微孔加入150～200μL含0.5～3％牛血清白蛋白的0.01～0.05M pH7.4磷酸盐缓冲液，37℃封闭1.5～0.5h；
(d)洗涤：按步骤(b)洗涤3～5次；
(e)保护：加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时；
(f)干燥：微孔板干燥后，即得到抗原预包被条。
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