CN105527443A - 一种抗膝沟藻毒素gtx2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条及其制备方法 - Google Patents

一种抗膝沟藻毒素gtx2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条及其制备方法，属于贝类毒素快速检测技术领域；该试纸条应用新方法制备的GTX2,3人工抗原，得到GTX2,3单克隆抗体；该试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为抗GTX毒素单克隆抗体；在硝酸纤维素膜层上设有膝沟藻毒素设有控制线和检测线，其制备方法包括抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记抗体、试纸制备等步骤；该试纸条用新的GTX2.3人工抗原制备方法得到的单克隆抗体制备而成，具有检测快速、准确、简便、灵敏度高，现场可测的优点。

Description

一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条及其制备方法，属于贝类毒素单克隆抗体快速检测技术领域。
背景技术
近年来，由于水体富营养化致使藻类异常增殖，并释放藻毒素（AlgaeToxin），这些次级代谢产物严重危害了人类的用水安全和其他水生生物的安全，其中以膝沟藻（gonyautoxin，GTX）产生的麻痹性贝类毒素引起了更多的重视。膝沟藻毒素GTX2,3为已经发现的60多种膝沟藻毒素异构体的其中一种，是我国南方沿海染毒贝类和有毒赤潮藻的麻痹性贝类毒素的主要成分之一，其特点是相对分子小、毒性大，对人体危害严重，不具备完全抗原特性。
随着对膝沟藻毒素GTX2,3的研究越来越多，专利CN201210325168.0和专利CN201310279284.8分别公开一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法和一种膝沟藻毒素GTX2,3完全抗原的制备方法，其在人工完全抗原制备技术上得到了发展。
在麻痹性贝类毒素的检测技术方面，小鼠生物测试法是常用的检测麻痹性贝类毒素的方法。但此种方法不能确知毒素的组成及含量，且重复性差，灵敏度不高。近儿年发展起来的HPLC法具有灵敏、高效的特点，但成本高，费时，需要较高的仪器设备及分析技术。酶联免疫吸附测定技术(ELISA)具有简便、快速、灵敏、成本低廉等特点，是目前最有前途的检测麻痹性贝类毒素技术。
其中纸条快速检测技术是近年来逐渐发展成熟的一项简便、快速、检测成本低廉的免疫学检测技术。该技术以抗体对抗原的特异性识别和单向免疫膜层析技术为基础。试纸条检测不仅可以进行定性检测，而且也可以实现定量或半定量检测。单克隆抗体为该技术的核心，高亲和力、适合亚型、位点配对、高度特异、识别谱广是对单抗的具体要求。随着快速检测技术的发展，集成多目标，实现高通量、多残留检测的“可视”检测芯片是我们未来试纸条检测发展的方向。多位点抗原测、抗体水平检测、半抗原小分子残留检测是未来发展目标。
因为GTX是贝类毒素中危害严重的毒素之一，误食带有GTX毒素的蟹及贝类会导致人类很高的死亡率。鉴于GTX及GTX毒素目前尚无有效的治疗方法，快速准确的毒素分离检测及其人工抗原的制备技术已成为各国学者研究的焦点及难点之一，迫切需要一种简便、快速准确、现场的检测方法，快速检测试纸条的研制与开发正好有望满足这种需要，但是目前在检测GTX2,3的快速测试纸条的技术上，还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术存在小分子膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备难，因此难以实现其单克隆抗体金标试纸条的问题，应用本发明人制备的GTX2,3人工抗原，得到GTX2,3单克隆抗体，提供一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，针对海洋环境尤其是南方近海污染日益严重导致GTX贝类毒素在贝类及蟹等水生生物体内蓄积，对人体造成危害，迫切需要一种简便、快速、准确的现场检测方法，本发明是依据贝类及蟹等水生生物生理学特点而设计发明的，采用间接ELISA竞争原理制备而成，以达到快速、准确、简便、灵敏度高、现场检测目的。
为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，所述的试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为抗GTX毒素单克隆抗体，该抗体是用本发明人制备的GTX2,3人工抗原，制备得到GTX2,3单克隆抗体；在硝酸纤维素膜层上设有膝沟藻毒素控制线（C）和检测线（T）。
所述的抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，其线性检测范围为0.277～9.852μg/mL。
所述的控制线（C）和检测线（T），分别包被有羊抗鼠二抗和包被GTX2,3-Gly-KLH抗原。
所述的免疫胶体金标记试纸条，其使用方法为检测端充分浸泡于待测液体中，37℃恒温反应；阳性——白色显示区上下呈现两条红线；阴性：白色显示区上呈现一条红色控制线C；无效：10min内无控制线C出现。
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，包括抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记抗体、试纸制备步骤。
所述的膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备，利用专利CN201210325168.0膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原加强免疫后的雌性BALB/C小鼠脾细胞中筛选培育的杂交瘤细胞系4C2，2F10注射预先用无菌石蜡油处理过的BAIB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，一硫酸铵利用辛酸一硫酸铵法对收集的腹水进行柱纯化处理得到抗膝沟藻毒素GTX2,3单抗；
所述的抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被，条件为封闭条件采用0.5~2%明胶37℃封闭20~40min，包被条件为37℃包被0.5~3h，包被浓度为1~2.5μg/mL；
所述的胶体金的制备，为每0.01%氯金酸溶液100lul与0.1%柠檬酸三钠2.5ul混合，加热致100℃制成胶体金溶液，用0.2~0.3%碳酸钾调至8.2~8.4；
所述的胶体金标记抗体，按每1mL胶体金5~10ug抗GTX单抗的添加量加入到制备好的胶体金溶液中，慢搅5~20min，4℃过夜，然后将其在4℃下15000g离心50~70min，弃上清，取其沉淀重悬于0.02%叠氮钠、0.5%Tween-20的0.01MPBS中，真空冷冻干燥，备用；
所述的试纸制备，为硝酸纤维素膜层用将质量浓度为1~3g/L包被GTX2,3-Gly-KLH包被于的检测线（T线），包被量为0.5~2μL/cm；在距离检测线3mm处将质量浓度为10~50g/L的羊抗鼠二抗包被于质控线（C线），包被量为0.5~2μL/cm。包被完毕后将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃烘干50~80min，取出；将样品吸收垫置于浓度为0.1mol/L（pH值为7.2，体积分数0.5%）胶体金标记抗体的磷酸盐缓冲液中浸泡5~7h，37℃烘干；最后吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，再按试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，安装好，按需切割成形，即得。
本发明具有如下优点：
本发明采用间接ELISA竞争原理制备而成，可以在较低的待测抗原浓度达到这一相对结合率，且使用酶标二抗进行系统放大时，因此灵敏度大大提高。该试纸条简便、可靠，可有效应用于现场检验，易于推广应用，具有良好的社会和经济价值。经过性能测试结果表明，本专利提供的抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，灵敏度高，特异性高，稳定性好。
附图说明
图15nm胶体胶体金颗粒标记后的胶体金颗粒。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，所述的试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为抗GTX毒素单克隆抗体；在硝酸纤维素膜层上设有膝沟藻毒素设有控制线（C）和检测线（T）。
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，包括抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记抗体、试纸制备步骤：
膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备：利用专利CN201210325168.0膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原加强免疫后的雌性BALB/C小鼠脾细胞中筛选培育的杂交瘤细胞系4C2，2F10注射预先用无菌石蜡油处理过的BAIB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，利用辛酸一硫酸铵法对收集的腹水进行柱纯化处理得到抗膝沟藻毒素GTX2,3单抗；
抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被：封闭条件采用0.5%明胶37℃封闭20min，包被条件为37℃包被0.5h，包被浓度为1μg/mL；
胶体金的制备：每0.01%氯金酸溶液100lul与0.1%柠檬酸三钠2.5ul混合，加热致100℃制成胶体金溶液，用0.2%碳酸钾调至8.2；
胶体金标记抗体：按每1mL胶体金5ug抗GTX单抗的添加量加入到制备好的胶体金溶液中，慢搅5min，4℃过夜，然后将其在4℃下15000g离心50min，弃上清，取其沉淀重悬于0.02%叠氮钠、0.5%Tween-20的0.01MPBS中，真空冷冻干燥，备用；
试纸制备：硝酸纤维素膜层用将质量浓度为1g/L包被GTX2,3-Gly-KLH包被于的检测线（T线），包被量为0.5μL/cm；在距离检测线3mm处将质量浓度为10g/L的羊抗鼠二抗包被于质控线（C线），包被量为0.5μL/cm。包被完毕后将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃烘干50min，取出；将样品吸收垫置于浓度为0.1mol/L（pH值为7.2，体积分数0.5%）胶体金标记抗体的磷酸盐缓冲液中浸泡5h，37℃烘干；最后吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，再按试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，安装好，按需切割成形，即得。
实施例2
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，所述的试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为抗GTX毒素单克隆抗体；在硝酸纤维素膜层上设有膝沟藻毒素设有控制线（C）和检测线（T）。
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，包括抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记抗体、试纸制备步骤：
膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备：利用专利CN201210325168.0膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原加强免疫后的雌性BALB/C小鼠脾细胞中筛选培育的杂交瘤细胞系4C2，2F10注射预先用无菌石蜡油处理过的BAIB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，利用辛酸一硫酸铵法对收集的腹水进行柱纯化处理得到抗膝沟藻毒素GTX2,3单抗；
抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被：封闭条件采用2%明胶37℃封闭40min，包被条件为37℃包被3h，包被浓度为2.5μg/mL；
胶体金的制备：每0.01%氯金酸溶液100lul与0.1%柠檬酸三钠2.5ul混合，加热致100℃制成胶体金溶液，用0.3%碳酸钾调至8.4；
胶体金标记抗体：按每1mL胶体金10ug抗GTX单抗的添加量加入到制备好的胶体金溶液中，慢搅20min，4℃过夜，然后将其在4℃下15000g离心70min，弃上清，取其沉淀重悬于0.02%叠氮钠、0.5%Tween-20的0.01MPBS中，真空冷冻干燥，备用；
试纸制备，为硝酸纤维素膜层用将质量浓度为3g/L包被GTX2,3-Gly-KLH包被于的检测线（T线），包被量为2μL/cm；在距离检测线3mm处将质量浓度为50g/L的羊抗鼠二抗包被于质控线（C线），包被量为2μL/cm。包被完毕后将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃烘干80min，取出；将样品吸收垫置于浓度为0.1mol/L（pH值为7.2，体积分数0.5%）胶体金标记抗体的磷酸盐缓冲液中浸泡7h，37℃烘干；最后吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，再按试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，安装好，按需切割成形，即得。
实施例3
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，所述的试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为抗GTX毒素单克隆抗体；在硝酸纤维素膜层上设有膝沟藻毒素设有控制线（C）和检测线（T）。
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，包括抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记抗体、试纸制备步骤：
膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备：利用专利CN201210325168.0膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原加强免疫后的雌性BALB/C小鼠脾细胞中筛选培育的杂交瘤细胞系4C2，2F10注射预先用无菌石蜡油处理过的BAIB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，利用辛酸一硫酸铵法对收集的腹水进行柱纯化处理得到抗膝沟藻毒素GTX2,3单抗；
抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被：封闭条件采用1%明胶37℃封闭30min，包被条件为37℃包被2h，包被浓度为2μg/mL；
胶体金的制备：每0.01%氯金酸溶液100lul与0.1%柠檬酸三钠2.5ul混合，加热致100℃制成胶体金溶液，用0.25%碳酸钾调至8.3；
胶体金标记抗体：按每1mL胶体金7ug抗GTX单抗的添加量加入到制备好的胶体金溶液中，慢搅15min，4℃过夜，然后将其在4℃下15000g离心50~70min，弃上清，取其沉淀重悬于0.02%叠氮钠、0.5%Tween-20的0.01MPBS中，真空冷冻干燥，备用；
试纸制备，为硝酸纤维素膜层用将质量浓度为1.5g/L包被GTX2,3-Gly-KLH包被于的检测线（T线），包被量为1μL/cm；在距离检测线3mm处将质量浓度为30g/L的羊抗鼠二抗包被于质控线（C线），包被量为1μL/cm。包被完毕后将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃烘干60min，取出；将样品吸收垫置于浓度为0.1mol/L（pH值为7.2，体积分数0.5%）胶体金标记抗体的磷酸盐缓冲液中浸泡6h，37℃烘干；最后吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，再按试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，安装好，按需切割成形，即得。
实施例4
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，所述的试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为抗GTX毒素单克隆抗体；在硝酸纤维素膜层上设有膝沟藻毒素设有控制线（C）和检测线（T）。
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，包括抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记抗体、试纸制备步骤：
膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备：利用专利CN201210325168.0膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原加强免疫后的雌性BALB/C小鼠脾细胞中筛选培育的杂交瘤细胞系4C2，2F10注射预先用无菌石蜡油处理过的BAIB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，利用辛酸一硫酸铵法对收集的腹水进行柱纯化处理得到抗膝沟藻毒素GTX2,3单抗；
抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被：封闭条件采用0.7%明胶37℃封闭25min，包被条件为37℃包被1h，包被浓度为1.2μg/mL；
胶体金的制备：每0.01%氯金酸溶液100lul与0.1%柠檬酸三钠2.5ul混合，加热致100℃制成胶体金溶液，用0.2%碳酸钾调至8.2；
胶体金标记抗体：每1mL胶体金6ug抗GTX单抗的添加量加入到制备好的胶体金溶液中，慢搅8min，加入4℃过夜，然后将其在4℃下15000g离心55min，弃上清，取其沉淀重悬于0.02%叠氮钠、0.5%Tween-20的0.01MPBS中，真空冷冻干燥，备用；
试纸制备：硝酸纤维素膜层用将质量浓度为1.2g/L包被GTX2,3-Gly-KLH包被于的检测线（T线），包被量为0.8μL/cm；在距离检测线3mm处将质量浓度为15g/L的羊抗鼠二抗包被于质控线（C线），包被量为0.8μL/cm。包被完毕后将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃烘干55min，取出；将样品吸收垫置于浓度为0.1mol/L（pH值为7.2，体积分数0.5%）胶体金标记抗体的磷酸盐缓冲液中浸泡5.5h，37℃烘干；最后吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，再按试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，安装好，按需切割成形，即得。
实施例5
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，所述的试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为抗GTX毒素单克隆抗体；在硝酸纤维素膜层上设有膝沟藻毒素设有控制线（C）和检测线（T）。
一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，包括抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被、膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记抗体、试纸制备步骤：
膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备：利用专利CN201210325168.0膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原加强免疫后的雌性BALB/C小鼠脾细胞中筛选培育的杂交瘤细胞系4C2，2F10注射预先用无菌石蜡油处理过的BAIB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，利用辛酸一硫酸铵法对收集的腹水进行柱纯化处理得到抗膝沟藻毒素GTX2,3单抗；
抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被：封闭条件采用1.8%明胶37℃封闭35min，包被条件为37℃包被2.5h，包被浓度为2.2μg/mL；
胶体金的制备：每0.01%氯金酸溶液100lul与0.1%柠檬酸三钠2.5ul混合，加热致100℃制成胶体金溶液，用00.3%碳酸钾调至8.4；
胶体金标记抗体：按每1mL胶体金9ug抗GTX单抗的添加量加入到制备好的胶体金溶液中，慢搅18min，加入4℃过夜，然后将其在4℃下15000g离心65min，弃上清，取其沉淀重悬于0.02%叠氮钠、0.5%Tween-20的0.01MPBS中，真空冷冻干燥，备用；
试纸制备：硝酸纤维素膜层用将质量浓度为1~3g/L包被GTX2,3-Gly-KLH包被于的检测线（T线），包被量为1.5μL/cm；在距离检测线3mm处将质量浓度为45g/L的羊抗鼠二抗包被于质控线（C线），包被量为1.5μL/cm。包被完毕后将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃烘干70min，取出；将样品吸收垫置于浓度为0.1mol/L（pH值为7.2，体积分数0.5%）胶体金标记抗体的磷酸盐缓冲液中浸泡6.5h，37℃烘干；最后吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，再按试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，安装好，按需切割成形，即得。
实施例6
利用实施例3制备出的金标试纸条进行各项性能测试，结果如下：
灵敏度分析结果为金标试纸条对GTX毒素抗原检测的灵敏度为l×106cfu/mL。随着检测菌浓度的下降显色深度减弱，到l×105cfu/mL浓度时看不到检测，见表1。
特异性分析结果为，测试各浓度的待测抗原发现与TTX、OA、微囊藻毒素-LR、Nodularin、BrevetoxinB(PbTx-2)和DA等贝类毒等无交叉反应测试结果均为阴性，见表2。
稳定性分析结果为，为期6个月的测试，试纸条对GTX毒素阳性样品和PBS阴性样品均能正常显色没有出现假阳性及假阴性情况，见表3。
以上性能测试结果表明，本专利提供的抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，灵敏度高，特异性高，稳定性好。

Claims (10)

1.一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，其特征在于：试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，金标抗体纤维层中的金标抗体为抗GTX毒素单克隆抗体，该抗体是用本发明人制备的GTX2,3人工抗原，制备得到GTX2,3单克隆抗体；在硝酸纤维素膜层上设有膝沟藻毒素控制线和检测线。
2.根据权利要求1所述的一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，其特征在于：所述的抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，其线性检测范围为0.277～9.852μg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，其特征在于：所述的控制线和检测线，分别包被有羊抗鼠二抗和包被GTX2,3-Gly-KLH抗原。
4.根据权利要求1所述的一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条，其特征在于：所述的免疫胶体金标记试纸条，其使用方法为检测端充分浸泡于待测液体中，37℃恒温反应；阳性—白色显示区上下呈现两条红线；阴性：白色显示区上呈现一条红色控制线C；无效：10min内无控制线C出现。
5.一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，其特征在于：包括一种新的人工抗原GTX2,3-Gly-KLH制备后的包被、膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备、胶体金的制备、胶体金标记抗体、试纸制备步骤。
6.根据权利要求5所述的一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，其特征在于：所述的膝沟藻毒素GTX2,3的单克隆抗体的制备是利用专利CN201210325168.0膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原加强免疫后的雌性BALB/C小鼠脾细胞中，筛选培育的杂交瘤细胞系4C2，2F10注射预先用无菌石蜡油处理过的BAIB/C小鼠，收集该小鼠的腹水，一硫酸铵利用辛酸—硫酸铵法对收集的腹水进行柱纯化处理得到抗膝沟藻毒素GTX2,3单抗。
7.根据权利要求5所述的一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，其特征在于：所述的抗原GTX2,3-Gly-KLH的包被，条件为封闭条件采用0.5~2%明胶37℃封闭20~40min，包被条件为37℃包被0.5~3h，包被浓度为1~2.5μg/mL。
8.根据权利要求5所述的一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，其特征在于：所述的胶体金的制备，为每0.01%氯金酸溶液100lul与0.1%柠檬酸三钠2.5ul混合，加热致100℃制成胶体金溶液，用0.2~0.3%碳酸钾调至pH8.2~8.4。
9.根据权利要求5所述的一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，其特征在于：所述的胶体金标记抗体，按每1mL胶体金5~10ug抗GTX单抗的添加量加入到制备好的胶体金溶液中，慢搅5~20min，4℃过夜，然后将其在4℃下15000g离心50~70min，弃上清，取其沉淀重悬于0.02%叠氮钠、0.5%Tween-20的0.01MPBS中，真空冷冻干燥，备用。
10.根据权利要求5所述的一种抗膝沟藻毒素GTX2,3单克隆抗体的免疫胶体金标记试纸条的制备方法，其特征在于：所述的试纸制备，为硝酸纤维素膜层用质量浓度为1~3g/L包被GTX2,3-Gly-KLH包被于检测线，包被量为0.5~2μL/cm；在距离检测线3mm处将质量浓度为10~50g/L的羊抗鼠二抗包被于质控线，包被量为0.5~2μL/cm；包被完毕后将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃烘干50~80min，取出；将样品吸收垫置于浓度为0.1mol/L胶体金标记抗体的磷酸盐缓冲液中浸泡5~7h，37℃烘干；最后吸附层从测试端依次为吸附纤维层、硝酸纤维素膜层及末端的吸水材料层，再按试纸条底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，安装好，按需切割成形，即得；所述的胶体金标记抗体的磷酸盐缓冲液pH值为7.2，体积分数0.5%。
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