CN102680693B - 软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条及其制备方法；所述试纸条包括粘附在支撑板上并依次相互部分重叠的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫；所述胶体金结合垫上含有抗软骨藻酸单克隆抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有软骨藻酸-牛血清蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。本发明的软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条，具有特异性强、检测灵敏度高，检测快速,前处理简单等优点；检测时不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。

Description

软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物检测技术领域的试纸条及其制备，具体是一种用于快速检测软骨藻酸的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

记忆缺失性贝毒（ASP）是有毒赤潮硅藻分泌产生的毒素，其主要活性成分软骨藻酸（Domic Acid,DA）是一种氨基酸类毒素。海洋贝类通过食物链的传递作用可在体内累积DA，有毒藻类也可以直接释放DA到海水中，人和海洋哺乳动物中毒之后，会干扰中枢神经系统，发生暂时性失去记忆甚至死亡。虽然目前在我国贝类食品中还未检测出软骨藻酸，但由于水污染的不断加剧，近年来赤潮频繁发生，极有可能伴随软骨藻酸的污染。所以在我国开展记忆缺失性贝毒快速检测技术研究具有特殊的意义，这既关系到消费者的健康安全又关系到我国贝类养殖业的发展。目前应用广泛、方法完善的检测分析软骨藻酸的方法仍然为高效液相色谱法，但由于其操作繁琐，设备昂贵，测定时间较长，使其推广普及受到一定的限制。免疫化学方法是利用抗体对抗原的特异性结合建立的分析方法，具有灵敏度高，特异性强，仪器设备简单易操作、样品前处理相对简单等优点，适用于一定条件下的现场监测和大量样本快速筛查，因而近年来在分析化学领域受到极大的重视和迅速发展。

经过对现有技术的检索发现，目前已有应用酶联免疫检测技术（ELISA）检测软骨藻酸的报道，如中国专利申请号201010283454.6，名称为“软骨藻酸的酶联免疫试剂盒及其检测方法”的发明专利，公开了一项运用ELISA方法检测软骨藻酸的技术。该技术检测全过程需要2-4小时，可一次检测多个样品，但由于ELISA是一种很敏感的技术，分析结果变异性大，检测需要酶标仪等仪器，需要有经验的操作人员，实现真正的现场操作有困难。胶体金免疫层析法是20世纪80年代初期发展起来的以胶体金为标记物应用于抗原抗体的一种新型、简便、快速的检测技术，检测时间可缩短到3-15min，不需要操作仪器，更加适用于现场检测。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种胶体金免疫层析试纸条及其制备方 法，用胶体金标记抗体，通过竞争免疫反应，快速检测贝类中的软骨藻酸，使得本发明满足检测方法简单易操作，快速，不需要任何其他仪器设备，非专业人员可现场使用，检测结果稳定等优点。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫和支撑板，所述样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫粘附在所述支撑板上并依次相互部分重叠；所述胶体金结合垫上含有抗软骨藻酸单克隆抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有软骨藻酸-牛血清蛋白偶联物构成的检测线和羊抗鼠IgG构成的质控线。

优选地，所述的检测线和质控线相隔3mm～7mm。

优选地，所述的软骨藻酸单克隆抗体为抗软骨藻酸杂交瘤细胞株2B1 No.9-2-2分泌的单克隆抗体。

优选地，所述支撑板为PVC塑料板。

本发明还涉及一种前述的软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、制备软骨藻酸单克隆抗体；

步骤二、将胶体金与步骤一制得的抗软骨藻酸单克隆抗体按照1∶（0.01～0.02）的体积比混匀，经纯化和浓缩后产生抗软骨藻酸单克隆抗体-胶体金标记物；

步骤三、将步骤二制得的抗软骨藻酸单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在胶体金结合垫上，将软骨藻酸-牛血清蛋白偶联物喷点在硝酸纤维素膜上构成检测线，再将羊抗鼠IgG喷点在硝酸纤维素膜上构成质控线，最后将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫粘附在所述支撑板上并依次相互部分重叠，干燥，即得。

优选地，所述步骤一具体为：采用抗软骨藻酸杂交瘤细胞株2B1 No.9-2-2分泌得到软骨藻酸单克隆抗体。

优选地，所述步骤二中的胶体金是采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备而得的。

优选地，所述步骤三中的软骨藻酸-牛血清蛋白偶联物是采用碳二亚胺法、活泼酯法或混合酸酐法将软骨藻酸小分子半抗原与牛血清蛋白进行偶联得到的。

本发明选用软骨藻酸-牛血清蛋白偶联物作为检测线，羊抗鼠IgG作为质控线，抗软骨藻酸单克隆抗体为胶体金标记的抗体，利用竞争法来检测待测样品中是否含有软骨藻酸。通过待测样品中的软骨藻酸和包被于NC膜上的软骨藻酸-牛血清蛋白偶联物共同 竞争抗软骨藻酸单克隆抗体-胶体金标记物，在检测线上出现颜色深浅不同的红色条带或不出现条带，质控线处出现红色条带。若待测样品试纸条检测线无色，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中软骨藻酸的浓度高于20ng/mL；若待测样品试纸条检测线和质控线均出现红色条带则判断为阴性样品，即待测样品中软骨藻酸的浓度小于20ng/mL；如果质控线上没有出现红色条带，则该试纸条失效。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1）检测软骨藻酸的免疫胶体金试纸条，具有特异性强、检测灵敏度高，（可达20ng/mL）,检测快速（只需10～15min）,前处理简单等优点；

2）检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低；

3）试纸条操作简单易掌握，无需专业人员操作；

4）试纸条储存方便，室温下干燥保存可保存6个月。

附图说明

图1为本发明检测试纸条结构示意图；

图2为本发明检测试纸条结果判定示意图；

图中：1样品垫、2胶体金结合垫、3硝酸纤维素膜（NC膜）、4吸收垫、5试纸条专用PVC塑料板、6检测线、7质控线、A为阴性标准品结果，B为阴性样品结果，C、D为阳性样品结果，E、F为试纸条失效。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1、软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的制备方法

1.1软骨藻酸人工抗原的合成

取1mg软骨藻酸（DA）溶于少量溶剂（二甲基亚砜∶水=1∶9）中，加入0.8mgN-羟基琥珀酰亚胺（20mg/mL，临用现配）、1.2mg水溶性碳二亚胺（10mg/mL，临用现配）及少量0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，混合均匀后置于25℃培养箱内反应2h。随后转移至4℃冰箱内，放置过夜。第二天加入2mg钥孔血蓝蛋白（KLH）或牛血清白蛋白(BSA)，补加少量0.1mol/L磷酸盐缓冲液，混合均匀后置于25℃培养箱内反应3h。将混合液置入超滤管内管，4500rpm离心15min后，适量稀释，分装后保存 于-20℃。

1.2抗软骨藻酸单克隆抗体的制备与纯化

以DA-KLH为免疫原，免疫5只6～8周龄的雌性BALB/c小鼠。首次免疫用200μlDA-KLH与等体积完全弗式佐剂乳化，腹腔注射小鼠，第2、4、6周取同量DA-KLH与等体积不完全弗式佐剂充分乳化，腹腔注射。取尾血测定小鼠血清效价，待效价大于要求值后，取同量DA-KLH的PBS溶液腹腔注射加强免疫，3天后选择1只血清效价最高的免疫小鼠，取其脾细胞与生长状态良好的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行细胞融合。融合后的杂交瘤细胞接种于96孔培养板中，在20%血清的HAT培养基中选择培养，10天后换液并加入新鲜培养液继续培养2天，ELISA检测细胞培养液上清。将抗阳性细胞孔的杂交瘤细胞孔，按照有限稀释法进行克隆，亚克隆，直到所有细胞孔的上清均为阳性为止，筛选可稳定分泌抗软骨藻酸单克隆抗体的杂交瘤细胞株2B1 No.9-2-2。采用体内诱生法，用0.8ml/只剂量的灭菌石蜡油腹腔注射致敏8周龄的雌性BALB/c小鼠，1周后注射杂交瘤细胞。视小鼠腹部膨大情况于14天后收集腹水。

腹水的纯化采用Protein G柱亲和层析纯化，再用0.01mol/L的磷酸盐(PBS)缓冲液（pH7.4）透析4-5天，得到纯化的软骨藻酸单克隆抗体，取出用紫外分光光度计测得蛋白浓度为0.675mg/ml，小瓶分装，-20℃保存。

1.3抗软骨藻酸单克隆抗体-胶体金标记物的制备即包被胶体金结合垫

采用柠檬酸三钠还原法制备20nm胶体金，取0.01%的氯金酸溶液100ml，放入经酸洗并硅化的洁净锥形瓶中，搅拌状态下，加热至沸腾，一次性加入1%柠檬酸三钠1ml，继续搅拌加热15min，直至溶液呈透亮的红色，室温冷却，4℃保存备用。

取20nm胶体金于干净的烧杯中，用1mol/L的NaOH调节pH值为8.5，加入抗软骨藻酸单克隆抗体，使其在胶体金中终浓度为15μg/mL（此时，加入的胶体金和抗软骨藻酸单克隆抗体的体积比为1∶（0.01～0.02））,继续搅拌1h；电磁搅拌下加入10%的BSA至终浓度为1%，以稳定胶体金颗粒的残留表位，再搅拌30min，4℃条件下隔夜静置12h。采用低温超速离心法纯化金标单抗，将金标抗体用2000r/min,4℃离心20min，弃去沉淀；将上清以13000r/min离心60min，弃去上清；将沉淀以原体积的金标稀释液（含0.2%PEG20000,0.5%BSA,0.02%NaN3的0.01mol/L pH7.4的PBS溶液）溶解，重复离心2～3次，沉淀溶于原体积1/10的金标稀释液中，4℃保存备用。

将标记好的抗体溶液1：4稀释后按照60μL/cm2的量均匀涂布在4mm×5mm的玻璃纤维上，37℃真空干燥1h后取出，作为胶体金结合垫。

1.4偶联抗原包被NC膜

将NC膜裁成4mm×2.5cm大小，取1μL羊抗鼠IgG（1mg/mL）和1μL包被抗原DA-BSA（0.8mg/ml）喷涂在NC膜上，分别作为质控线和检测线，两线相隔0.5cm（可为0.3cm～0.7cm中任意值），37℃真空干燥1h；干燥后完全浸泡于含1%BSA的pH7.4的PBS溶液中，以封闭NC膜的残余吸附能力，封闭2h；然后用pH7.4的0.01mol/L的PBS溶液洗涤两次，每次5min，37度真空干燥后后备用。

1.5试纸条组装

裁取4mm×3cm的吸水纸作吸收垫。4mm×2.8cm的玻璃纤维作样品垫。将样品垫、包被有抗软骨藻酸单克隆抗体-胶体金标记物的胶体金结合垫、包被有软骨藻酸-牛血清蛋白偶联抗原作为检测线和包被有羊抗鼠IgG作为质控线的NC膜、吸收垫首尾相连，按顺序粘贴在4mm×8cm的PVC塑料板上（图1），组装结束后，与干燥剂一起装入铝箔袋，密封储存。

实施例2、软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条使用方法

2.1样品前处理

取生鲜带壳或冷冻后在室温下半解冻的样品，用刀切开闭壳肌取出贝肉，将可食部分与中肠腺分离，放在网孔细小的金属网上沥水5min。取5g样品，加入10mL匀浆液（50%甲醇水溶液），匀浆后，漩涡振荡1min，超声提取5min；4000rpm离心20min。移出上清液至25mL容量瓶，剩余残渣再加入匀浆液5mL，重复提取两次，上清液均移至25mL容量瓶内，蒸馏水定容。0.22μm滤膜过滤。

2.2用实施例1制得的试纸条进行检测

阳性标准品（20ng/mL的软骨藻酸标准溶液）、阴性标准品（0.01mol/L pH7.4的PBS缓冲液）及待测样品各取80μl加入到微孔板中，将胶体金试纸条插入其中，15min后观察结果。

2.3结果判定

如图2所示，若待测样品试纸条检测线颜比阴性空白试纸条检测线颜色浅，同时质控线上出现红色条带，则判断为阳性样品，即样品中软骨藻酸的浓度小于20ng/mL;若待测样品试纸条检测线无颜色，同时质控线上出现红色条带，则判断为阳性样品，即样品中软骨藻酸的的浓度大于或等于20ng/mL;若待测样品试纸条检测线颜色与阴性空白试纸条检测线颜色一致，同时质控线上出现红色条带，则判断为阴性样品，即样品中不含软骨藻酸；若质控线上无颜色，则该试纸条无效。

实施例3、软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条灵敏度测验

按照实施例2所述实验方法，用实施例1的检测试纸条分别检测10μg/mL,1μg/mL,100ng/mL,80ng/mL，40ng/mL，20ng/mL，15ng/mL，10ng/mL，5ng/mL，0ng/mL，10个浓度梯度的软骨藻酸标准品，重复4次，通过肉眼观察检测线，检测结果如表1所示。发现软骨藻酸浓度为0ng/ml（阴性对照）时，检测线出现很深的红色条带，随着浓度的增加，检测线的颜色逐渐减弱，当DA标准品浓度增至20ng/ml时，检测线无红色条带，当DA标准品浓度继续增至10μg/ml时，检测线都无红色条带，而质控线均出现红色条带。由此判断，该试纸条检测软骨藻酸的检测灵敏度为20ng/ml(对于贝类食品相当于8μg/g贝肉)，可以满足国际规定的20μg/g的安全限值。

表1软骨藻酸免疫层析试纸条灵敏度检测结果

“+”、“-”分别表示试纸条检测结果为阳性和阴性

实施例4、软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条特异性测验

将记忆缺失性贝毒主要成分软骨藻酸（DA）、腹泻性贝毒的主要成分软海绵酸（OA）、麻痹性贝毒主要成分石房蛤毒素（STX）以及河豚鱼毒素（TTX）配成1000ng/mL的样品。按照实施例2所述方法进行实验，实验结果（表2）表明，软骨藻酸（DA）样品检测线无颜色出现，同时质控线出现红色条带；而软海绵酸（OA）、石房蛤毒素（STX）和河豚鱼毒素（TTX）的样品检测线与阴性空白检测线颜色一致，同时质控线出现红色条带，这表明软海绵酸（OA）、软海绵酸（OA）和河豚鱼毒素（TTX）与本发明的试纸条无交叉反应，显示本试纸条具有良好的特异性。

表2本发明试纸条特异性实验结果

检测样品	软骨藻酸（DA）	软海绵酸（OA）	石房蛤毒素（STX）	河豚鱼毒素（TTX）
					检测结果	＋	-	-	-

 注：“＋”表示阳性，“－”表示阴性

实施例5、软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条稳定性测验

（1）将实施例1制作好的试纸条置于不透光塑料袋中(加干燥剂)封口密闭，置于4℃的冰箱内，分别在1、2、3、4、5、6月后取试纸条进行浓度为0、10、20ng/mL软骨藻酸标样的测试，每次3个重复，观察稳定性测试结果（检测线和质控线的有无、条带的清晰度以及玻璃纤维释放金标抗体的程度）。

（2）加速稳定性实验37℃、7d。将实施例1制作好的试纸条置于37℃的干燥箱内，每天取出试纸条进行浓度为0、10、20ng/mL软骨藻酸标样的测试，每次3个重复，观察稳定性测试结果（检测线和质控线的有无、条带的清晰度以及玻璃纤维释放金标抗体的程度）。

密闭保存于4℃条件下的试纸条在6次18组检测实验中，检测阴性样本时检测线清晰，胶体金结合垫上金标抗体释放完全；检测20ng/mL标准品时，阴性对照试纸条检测线清晰，样品试纸条检测线完全消失（阳性），符合实验要求。试纸条在37℃条件下保存到第6d，检测阴性样本时检测线颜色开始变浅，第7d时，对照试纸条检测线颜色已经很浅，模糊不清。最后确定软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的保存条件是置于铝箔袋中抽真空、加干燥剂4℃密闭保存，有效期至少为6个月。

实施例6、样品中软骨藻酸模拟检测实验

分别向贝肉中添加软骨藻酸标准品，按照实施例2制成0ng/mL,20ng/mL，40ng/mL的样品待测液，并按照实施例2所述方法，用本发明实施例1制得的试纸条对0ng/mL,20ng/mL，40ng/mL的样品检测，重复实验5次，结果显示0ng/mL的样品的试纸条检测线与阴性空白检测线一致，同时质控线出现红色条带，判断为阴性样品；而20ng/mL和40ng/mL的样品的试纸条检测线无颜色，同时质控线出现红色条带，判断为阳性样品。说明本发明试纸条可以用来检测贝类样品。

Claims (3)

1.一种软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、制备软骨藻酸单克隆抗体；

步骤二、将胶体金与步骤一制得的抗软骨藻酸单克隆抗体按照1：(0.01～0.02)的体积比混匀，经纯化和浓缩后产生抗软骨藻酸单克隆抗体-胶体金标记物；

步骤三、将步骤二制得的抗软骨藻酸单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在胶体金结合垫上，将软骨藻酸-牛血清蛋白偶联物喷点在硝酸纤维素膜上构成检测线，再将羊抗鼠IgG喷点在硝酸纤维素膜上构成质控线，最后将样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫粘附在所述支撑板上并依次相互部分重叠，干燥，即得；

所述步骤一具体为：采用抗软骨藻酸杂交瘤细胞株2B1No.9-2-2分泌得到软骨藻酸单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的胶体金是采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备而得的。

3.根据权利要求1所述的软骨藻酸胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的软骨藻酸-牛血清蛋白偶联物是采用碳二亚胺法、活泼酯法或混合酸酐法将软骨藻酸小分子半抗原与牛血清蛋白进行偶联得到的。