CN102807616A - 一种膝沟藻毒素gtx2,3人工抗原制备的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法，是用乙二醛在半抗原分子GTX2,3第2号和8号位亚氨位上引进2个自由的氨基，再用2步法将此中间产物(H2N-GTX2,3)分别与载体蛋白BSA和KLH偶联，中间产物和偶联产物分别经超滤纯化后,经全波段紫外扫描和HPLC鉴定，鉴定结果表明本研究成功地制备了膝沟藻-麻痹性贝类毒素GTX2,3人工抗原，同时其具备较强的免疫原性；该方法能够有效地制备出膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原，从而生产出识别膝沟藻毒素GTX2,3的抗体，这对于采用免疫分析技术快速检测膝沟藻毒素GTX2,3具有重要的实际意义；整个制备过程简便可行，无需特别的仪器设备，成本低廉，容易规模化生产和推广应用；本方法合成的膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原具有较好的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种人工抗原的制备方法，具体涉及一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法，属于抗原制备技术领域。
背景技术
贝类大量摄食有毒藻类而在体内积累的四氢嘌呤毒素。分为四类：氨基甲酸酯类毒素，膝沟藻毒素，N-磺酰氨甲酰基类毒素，脱氨甲酰基类毒素，脱氧脱氨甲酰基类毒素。毒性很强，摄入1mg就可致人死亡，其化学性质非常稳定，烹调加热不能消除其毒性，其毒性对人类的安全产生了一定的影响。
同时由于水体富营养化致使藻类异常增殖，并释放藻毒素( Algae Toxin)， 这些次级代谢产物严重危害了人类的用水安全和其他水生生物的安全，其中以膝沟藻(gonyautoxin， GTX ） )产生的麻痹性贝类毒素引起更多重视，膝沟藻毒素为麻痹性贝类毒素家族中重要的成员，目前已经发现膝沟藻毒素各种异构体有60 多种更应该。膝沟藻毒素2，3（ gonyautoxin，GTX2，3) 是我国南方沿海染毒贝类和有毒赤潮藻的麻痹性贝毒的主要成分之一。互为空间异构体的GTX2 和GTX3，由于相对分子量小（396.36 Da）、毒性大，不具备完全抗原特性。其分子结构复杂，虽有较多官能团，但活性都不高。
小鼠生物测试法是常用的检测麻痹性贝毒的方法。但此种方法不能确知毒素的组成及含量，且重复性差，灵敏度不高。近几年发展起来的HPLC 法具有灵敏、高效的特点，但成本高，费时，需要较高的仪器设备及分析技术。酶联免疫吸附测定技术（ELISA）具有简便、快速、灵敏、成本低廉等特点，是目前最有前途的检测麻痹性贝毒技术。近十多年来，人们用多种方法试图开发出用于不同生物毒素检测的可靠的免疫诊断试剂盒。Johnson 等1964 年首次成功制备了抗STX 的多克隆抗体，Adachi M 等人尝试用单克隆抗体技术现场监测产麻痹性贝毒的有毒藻。近年有关麻痹性贝毒（特别是石房蛤毒素STX）的免疫学测定方法已取得了重大进展，初步建立了麻痹性贝毒的放射免疫测定技术和酶联免疫吸附测定技术（ELISA）。由于危害大，结构较复杂，其全合成至今尚未成功。又很难直接从天然资源中分离纯化毒素，毒素纯化不易、价格昂贵、偶联难度大、免疫易造成动物中毒等原因，仅加拿大、日本等少数发达国家掌握了此技术，但国内外对这方面的报导甚少。膝沟藻毒素GTX2,3引起的麻痹性贝类毒素免疫学快速检测试剂盒至今没有普及应用的关键问题在于，该毒素购买价格昂贵，提取困难，同时因其热和碱性不稳定性，而且GTX2,3分子结构复杂，众多官能团活性低，因此与载体蛋白偶联难度大、免疫易造成动物中毒。本研究旨在攻克免疫学快速检测的第一关GTX2,3人工抗原的制备。
关于GTX已经有相关的文章发表，可是还没有人工抗原制备地详细报道，同时文献中都是GTX-BSA-甲醛，而根据本发明的设计思路，及实验结果表明，只有GTX-醛类-载体蛋白才能有效地偶联，这也是目前GTX免疫学快速检测试剂盒欠缺的最大瓶颈问题。所以研究GTX-醛类-载体蛋白具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法。
为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：
该方法是利用膝沟藻毒素GTX2,3与载体蛋白BSA及KLH大分子偶联制备人工抗原的方法，用乙二醛在半抗原分子GTX2,3第2号和8号位亚氨位上引进2个自由的氨基，再用2步法将此中间产物( H2N- GTX2,3) 分别与载体蛋白BSA 和KLH 偶联.具体方法如下：
(1) 均取85μL 的2.37mg.mL-1 GTX2,3毒素原液在避光下加入少量0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，轻弹混匀，使得溶液的pH值为4.6；
(2) 向(1)溶液中分别加入适量新鲜配制的乙二醛， 使醛的终浓度为0.1～3%；
(3) 称取0.0023 g BSA、0.0023 g KLH 分别溶于160 μL 0.01 mol·L-1 pH7.6的PBS 中， 分别加入上述溶液中；使GTX：BSA的摩尔比为3～20，GTX：KLH的摩尔比为5～25；
（4）25℃反应20～80h后转入4℃冰箱反应10～30 h，即先将GTX2,3活化；
(5) 将反应溶液转移到截留分子量为5000Da的超滤管，并记下溶液的体积，3000～8000rpm离心5～20min；或者将反应溶液转移到截留分子量为5000Da的透析袋中，4℃透析过夜；
(6) 收集超滤外液，并向超滤管中加入适当体积的0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，使得溶液的pH值为4.6，重复离心2～3次，超滤离心除去未反应的毒素、醛类小分子；
(7) 超滤3 次后取超滤外液0.5 mL 注射小鼠，5 min 后小鼠死亡；
(8) 继续超滤离心：重复超滤离心5 次后，取超滤截留物及超滤外液分别注射小鼠，未见死亡；
(9) 将超滤管倒转离心，3000～8000rpm离心5min，收集管内容物，分装， 20℃保存，得到GTX2,3-BSA和GTX2,3-KLH；
（10）得到的产物用MiliiPore 超滤装置过滤后，冷冻干燥即得到的蛋白质抗原。
（11）该人工抗原蛋白质用全波段紫外自动扫描、高效液相HLPC 检测结果显示为GTX2,3的人工抗原；
（12）产物分别经超滤纯化后，经全波段紫外扫描的平均偶联比能达到11.5 以上。
所述的膝沟藻毒素GTX2,3与载体蛋白的摩尔质量比为1∶3～25。
所述的膝沟藻毒素GTX2,3与载体蛋白的摩尔质量比为1∶15。
本发明加入0.1M醋酸溶液，和0.1M醋酸钠溶液为了调节溶液的pH值，其加入量以调整溶液pH值为4.6为准。
本发明所述的BSA为小牛血清白蛋白，KLH为匙血蓝蛋白，PBS为磷酸缓冲溶液。
本发明有益效果是：1.能够有效地制备出膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原，从而生产出识别膝沟藻毒素GTX2,3的抗体，这对于采用免疫分析技术快速检测膝沟藻毒素GTX2,3具有重要的实际意义；2.整个制备过程简便可行，无需特别的仪器设备，成本低廉，容易规模化生产和推广应用；3.本发明制备合成的膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原具有较好的稳定性。
本发明膝沟藻毒素GTX2,3毒素的人工抗原中，膝沟藻毒素GTX2,3毒素与载体蛋白的质量比为1∶15。 本发明将膝沟藻毒素GTX2,3毒素通过曼尼希法和蛋白载体偶联制备人工抗原，将人工抗原免疫动物来制备特异性抗体。本发明针对膝沟藻毒素GTX2,3毒素的人工抗原的特异性抗体可以用于膝沟藻毒素GTX2,3毒素的提取纯化，还可用于建立时间分辨荧光免疫分析法或酶联免疫吸附法来快速、灵敏地检测膝沟藻毒素GTX2,3毒素。从而实现快速、高效、高灵敏度、高特异性，以及高稳定性的对膝沟藻毒素GTX2,3的检测，对生产中检测和今后科研有指导意义。由于该方法易操作，成本低，效果好，且可重复使用，因而将其应用于水产食品贝类毒素的快速有实用价值。
该方法能够有效地制备出膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原，从而生产出识别膝沟藻毒素GTX2,3的抗体，这对于采用免疫分析技术快速检测膝沟藻毒素GTX2,3具有重要的实际意义。
附图说明
图1：三种醛类的光吸收峰图：首先将三种醛的特征峰进行扫描，结果表明，甲醛和乙二醛在﹥220nm无吸收峰，从图1可见，乙二醛在 >220nm以上无吸收峰；
图2：GTX -0.2%乙二醛的光吸收峰图：图2可见， 同时GTX -0.2%乙二醛在245nm及270nm有强吸收峰，发生明显的红移，说明GTX2,3与乙二醛已经偶联；
从图1可见，乙二醛在 >220nm以上无吸收峰，而图2可见， 同时GTX -0.2%乙二醛在245nm及270nm有强吸收峰，发生明显的红移，说明GTX2,3与乙二醛已经偶联。
图3： GTX -0.2%乙二醛-BSA 图：图3可见， GTX -0.2%乙二醛-BSA 在231nm、 234nm和275nm有吸收峰, 说明: GTX-0.2%乙二醛-BSA已经偶联上；
图4： GTX-0.2%乙二醛-BSA蛋白的Western-blot：1、2、5为GTX2, 3-KLH， 3为BSA， M为预染Marker，4为KLH，图４可见：用制备的人工抗原GTX2,3-醛-BSA免疫BalB/C小鼠，Western-blot鉴定结果表明制备的抗体能够识别其抗原，说明本研究成功地制备了膝沟藻-麻痹性贝类毒素GTX2,3人工抗原，同时其具备较强的免疫原性。这为制备GTX2,3的单克隆抗体及建立免疫学快速检测试剂盒打下了坚实的基础。
具体实施方式
下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。
实施例1
一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法，该方法是利用膝沟藻毒素GTX2,3与载体蛋白BSA及KLH大分子偶联制备人工抗原的方法，用乙二醛在半抗原分子GTX2,3第2号和8号位亚氨位上引进2个自由的氨基，再用2步法将此中间产物( H2N- GTX2,3) 分别与载体蛋白BSA 和KLH 偶联，具体方法如下：
(1) 均取85μL 的2.37mg.mL-1 GTX2,3毒素原液在避光下加入少量0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，轻弹混匀，使溶液的pH值为4.6；
(2) 向(1)溶液中分别加入适量新鲜配制的乙二醛， 使醛类终浓度为0.1%；
(3) 称取0.0023 g BSA、0.0023 g KLH 分别溶于160 μL 0.01 mol·L-1 pH7.6的PBS 中， 分别加入上述溶液中；使GTX：BSA的摩尔比为3～20， GTX：KLH的摩尔比为5；
(4)再于25℃反应20h后转入4℃冰箱反应15 h；
(5) 将反应溶液转移到截留分子量为5000Da的超滤管 ，并记下溶液的体积，4600rpm离心10min；或者将反应溶液转移到截留分子量为5000Da的透析袋中，4℃透析过夜；
(6) 收集超滤外液，并向超滤管中加入适当体积的0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，使溶液的pH值为4.6，重复离心2～3次，超滤离心除去未反应的毒素、醛类小分子；
(7) 超滤3 次后取超滤外液0.5 mL 注射小鼠，5 min 后小鼠死亡；
(8) 继续超滤离心：重复超滤离心5 次后，取超滤截留物及超滤外液分别注射小鼠，未见死亡；
(9)将超滤管倒转离心，3500rpm离心5min，收集管内容物，分装， 20℃保存，得到GTX2,3-BSA和GTX2,3-KLH；
(10)得到的产物用MiliiPore 超滤装置过滤后，冷冻干燥即得到的蛋白质抗原；
(11)该人工抗原蛋白质用全波段紫外自动扫描、高效液相HLPC 检测结果显示为GTX2,3的人工抗原；
(12)产物分别经超滤纯化后，经全波段紫外扫描的平均偶联比能达到1∶3。
膝沟藻毒素GTX2,3与载体蛋白的摩尔质量比为1∶3。
实施例2
一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法，该方法是利用膝沟藻毒素GTX2,3与载体蛋白BSA及KLH大分子偶联制备人工抗原的方法，用乙二醛在半抗原分子GTX2,3第2号和8号位亚氨位上引进2个自由的氨基，再用2步法将此中间产物( H2N- GTX2,3) 分别与载体蛋白BSA 和KLH 偶联，具体方法如下：
(1) 均取85μL 的2.37mg.mL-1 GTX2,3毒素原液在避光下加入少量0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，轻弹混匀，使溶液的pH值为4.6；
(2) 向(1)溶液中分别加入适量新鲜配制的乙二醛， 使醛类终浓度为3%；
(3) 称取0.0023 g BSA、0.0023 g KLH 分别溶于160 μL 0.01 mol·L-1 pH7.6的PBS 中， 分别加入上述溶液中；使GTX：BSA的摩尔比为3～20， GTX：KLH的摩尔比为25；
(4)再于25℃反应80h后转入4℃冰箱反应20 h；
(5) 将反应溶液转移到截留分子量为5000Da的超滤管 ，并记下溶液的体积，6600rpm离心10min；或者将反应溶液转移到截留分子量为5000Da的透析袋中，4℃透析过夜；
(6) 收集超滤外液，并向超滤管中加入适当体积的0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，使溶液的pH值为4.6，重复离心2～3次，超滤离心除去未反应的毒素、醛类小分子；
(7) 超滤3 次后取超滤外液0.5 mL 注射小鼠，5 min 后小鼠死亡；
(8) 继续超滤离心：重复超滤离心5 次后，取超滤截留物及超滤外液分别注射小鼠，未见死亡；
(9) 将超滤管倒转离心，6000rpm离心5min，收集管内容物，分装， 20℃保存，得到GTX2,3-BSA和GTX2,3-KLH；
(10)得到的产物用MiliiPore 超滤装置过滤后，冷冻干燥即得到的蛋白质抗原；
(11)该人工抗原蛋白质用全波段紫外自动扫描、高效液相HLPC 检测结果显示为GTX2,3的人工抗原；
(12)产物分别经超滤纯化后，经全波段紫外扫描的平均偶联比能达到1∶20。
膝沟藻毒素GTX2,3与载体蛋白的摩尔质量比为1∶20。
Claims (4)
1.一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法，其特征在于：该方法是利用膝沟藻毒素GTX2,3与载体蛋白BSA及KLH大分子偶联制备人工抗原的方法，用乙二醛在半抗原分子GTX2,3第2号和8号位亚氨位上引进2个自由的氨基，再用2步法将此中间产物( H2N- GTX2,3) 分别与载体蛋白BSA 和KLH 偶联.具体方法如下：
(1) 均取85μL 的2.37mg.mL-1 GTX2,3毒素原液在避光下加入少量0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，轻弹混匀，使得溶液的pH值为4.6；
(2) 向(1)溶液中分别加入适量新鲜配制的乙二醛， 使醛的终浓度为0.1～3%；
(3) 称取0.0023 g BSA、0.0023 g KLH 分别溶于160 μL 0.01 mol·L-1 pH7.6的PBS 中， 分别加入上述（2）溶液中；使GTX：BSA的摩尔比为3～20，GTX：KLH的摩尔比为5～25；
（4）25℃反应20～80h后转入4℃冰箱反应10～30 h，即先将GTX2,3活化；
(5) 将反应溶液转移到截留分子量为5000Da的超滤管，并记下溶液的体积，3000～8000rpm离心5～20min；或者将反应溶液转移到截留分子量为5000Da的透析袋中，4℃透析过夜；
(6) 收集超滤外液，并向超滤管中加入适当体积的0.1M醋酸溶液，并加入一定量的0.1M醋酸钠溶液，使得溶液的pH值为4.6，重复离心2～3次，超滤离心除去未反应的毒素、醛类小分子；
(7) 超滤3 次后取超滤外液0.5 mL 注射小鼠，5 min 后小鼠死亡；
(8) 继续超滤离心：重复超滤离心5 次后，取超滤截留物及超滤外液分别注射小鼠，未见死亡；
(9) 将超滤管倒转离心，3000～8000rpm离心5min，收集管内容物，分装， 20℃保存，得到GTX2,3-BSA和GTX2,3-KLH；
(10)得到的产物用MiliiPore 超滤装置过滤后，冷冻干燥即得到的蛋白质抗原。
2.根据权利要求1所述的一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法，其特征在于：GTX2,3先与终浓度为0.1～3%的乙二醛结合，再与载体蛋白BSA和KLH偶联。
3.根据权利要求1所述的一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法，其特征在于：膝沟藻毒素GTX2,3与载体蛋白的摩尔质量比为1∶3～25。
4.根据权利要求1或2所述的一种膝沟藻毒素GTX2,3人工抗原制备的新方法，其特征在于：膝沟藻毒素GTX2,3毒素与载体蛋白的摩尔质量比为1∶15。
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