CN110082347A - 一种简易的尿糖定量检测方法以及尿糖定量检测试剂盒 - Google Patents

一种简易的尿糖定量检测方法以及尿糖定量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种简易的尿糖定量检测方法以及尿糖定量检测试剂盒，属于生物检测领域。该尿糖定量检测方法包括：将3,3',5,5'‑四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶、过氧化氢溶液和葡萄糖氧化酶混合，得到蓝色检测液；将蓝色检测液与待测尿液混匀，得到比色液，测定比色液中蓝色的强度值，计算得到待测尿液中的血糖值。该方法检测成本低、准确度高、方便快捷，且不依赖于特定的分析仪器，尤其适用于居家糖尿病患者的日常检测。

Description

一种简易的尿糖定量检测方法以及尿糖定量检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及一种简易的尿糖定量检测方法以及尿糖定量检测试剂盒。
背景技术
糖尿病被WHO称为“新兴的全球性流行病”，其发病率逐年上升，已成为一个严重的全球性公共卫生问题。血液或者尿液中葡萄糖的含量是糖尿病医生临床诊断和病人日常自我监护的重要指标。由于血糖检测需皮肤消毒后从静脉或指尖抽取血液，麻烦的消毒过程和取血时的刺痛使病人的顺应性很差。因此，具有无创检测特征的尿糖测定在病人日常自我监护中越来越受到重视。
目前，尿糖的含量测定主要以班氏试剂法和尿糖试纸法为代表的定性分析法，班氏试剂法由于其操作复杂、数据准确性低，已被逐渐淘汰而使用率越来越低；而商业化的试纸法虽然操作简单，但仍然是基于比色卡的裸眼定性测定，误差大，而且易受试纸品牌、试纸浸入尿液的时间和比色时间等因素的影响，只能得到一个大致的定性结果而无法的得到精确的尿糖含量。鉴于此，科学家开展了一些对尿糖定量分析的研究，但这些方法不但需要高超的技术来制备复杂的分析材料，而且还需要fluorospectrophotometer、chemiluminescence apparatus等特定的分析设备，不适合常规分析，特别是病人日常自我监护。
鉴于此，本发明提供一种简单便捷、不依赖于分析仪器的尿糖定量检测方法以及尿糖定量检测试剂盒。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种简易的尿糖定量检测方法，该方法检测成本低、准确度高、方便快捷，且不依赖于特定的分析仪器，尤其适用于居家糖尿病患者的日常检测。
本发明的第二目的在于提供一种尿糖定量检测试剂盒，通过使用该试剂盒，可方便快捷的采用上述尿糖定量检测方法对患者的尿糖进行监测分析。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种简易的尿糖定量检测方法，其包括：
将3,3',5,5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶、过氧化氢溶液和葡萄糖氧化酶混合，得到蓝色检测液；
将蓝色检测液与待测尿液混匀，得到比色液，测定比色液中蓝色的强度值，计算得到待测尿液中的血糖值。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述测定比色液中蓝色的强度值的方法包括：对比色液进行拍照，获得比色液图像后，读取比色液图像的RGB值。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，通过智能手机或相机测定比色液中蓝色的强度值。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在将蓝色检测液与待测尿液混匀，将所得的比色液静置5-30min后，再测定比色液中蓝色的强度值。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在制备蓝色检测液的步骤中，辣根过氧化物酶与3,3',5,5'-四甲基联苯胺的质量比为1：1.5×104-2.5×104。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在制备蓝色检测液的步骤中，辣根过氧化物酶与过氧化氢的质量比为1：1×102-4×102。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述蓝色检测液中还包括底物缓冲溶液。
一种尿糖定量检测试剂盒，其包括：3,3',5,5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶、过氧化氢溶液和葡萄糖氧化酶。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述辣根过氧化物酶、3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液的质量比为1:1.5×104-2.5×104:1×102-4×102。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的这种简易的尿糖定量检测方法，其分析原理示意图如图1所示，具体为：尿液中的葡萄糖可被葡萄糖氧化酶(GOD)特异性地催化成葡萄糖酸，并产生H2O2。H2O2在辣根过氧化物酶(HRP)的催化下，将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)氧化成蓝色。在HRP和TMB的量固定的情况下，H2O2的量与产物溶液的颜色具有相关性。通过测定溶液颜色中蓝色的强度值(例如用智能手机拍照后读取图像中的RGB强度值)，即可算出H2O2的量。同时，发明人发现，随着H2O2浓度的增加，溶液蓝色先逐渐加深，而后又逐渐变浅直至无色。特别需要注意的是，后一阶段(即颜色消退过程)的颜色差异性更明显，H2O2的浓度范围也更宽，因此可进行定性、定量分析。
因此，在该分析方法中，首先向尿液中加入定量的、能使溶液蓝色最深的H2O2，然后利用葡萄糖被GOD氧化所新产生的H2O2抑制HRP活性，使得溶液的蓝色变浅，从而实现定性、定量分析。该分析方法具有成本低、准确度高、方便快捷，且不依赖于特定的分析仪器，尤其适用于居家糖尿病患者的日常检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本发明中提供的尿糖定量检测方法的分析原理示意图；
图2为RGB加成色示意图(左)和Color picker软件分析RGB值(右)；
图3为不同浓度葡萄糖反应后，在通过对比色液图像中的蓝色进行取色后的结果图；
图4为H2O2浓度与溶液蓝色关系的定性观察(上)和定量曲线(下)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本实施方式提供一种简易的尿糖定量检测方法，其包括：
步骤S1:将3,3',5,5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶、过氧化氢溶液和葡萄糖氧化酶混合，得到蓝色检测液。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在制备蓝色检测液的步骤中，辣根过氧化物酶与3,3',5,5'-四甲基联苯胺的质量比为1：1.5×104-2.5×104。
发明人发现，在H2O2的存在下，TMB经过辣根过氧化物酶(HRP)催化，TMB会产生可溶性蓝色产物。研究结果表明TMB浓度对显色影响不大，HRP的量对显色影响比较明显，随着HRP浓度增加，反应颜色逐渐加深，当HRP与TMB之间的质量比为1：1.5×104-2.5×104，显色效果最佳。
优选地，辣根过氧化物酶与3,3',5,5'-四甲基联苯胺的质量比为1：1.7×104-2.3×104；或者，质量比为1：1.9×104-2.1×104；更为优选地，质量比为1：2.0×104。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在制备蓝色检测液的步骤中，辣根过氧化物酶与过氧化氢的质量比为1：1×102-4×102。
在该分析方法中，通过先加入一定量的H2O2，使TMB转化成可溶性蓝色产物，且使溶液达到稳定的蓝色且随着H2O2量的增多蓝色不再加深，再进行后续的尿糖检测。发明人考察了多个浓度的H2O2，发现随着H2O2浓度的增加，溶液颜色逐渐加深，然后又逐渐变浅；空白的背景值较大，且颜色变浅过程更为明显、其相对应的H2O2浓度范围也更宽。通过考察H2O2浓度与溶液中蓝色的强度值的关系曲线，发现当辣根过氧化物酶与过氧化氢的质量比为1：1×102-4×102(或者为1：2×102-3×102，或者为1：2×102-2.5×102)，溶液的蓝色处于临界处，此时颜色最深且再加入H2O2溶液的颜色会逐渐变浅。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述蓝色检测液中还包括磷酸盐缓冲溶液。具体地，该底物缓冲溶液是通过将1.6-2.0g的Na2HPO4以及0.3-0.6g的柠檬酸混合加水至100mL所得。
步骤S2:将蓝色检测液与待测尿液混匀，得到比色液，测定比色液中蓝色的强度值，计算得到待测尿液中的血糖值。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述在将蓝色检测液与待测尿液混匀，将所得的比色液静置5-30min后，再测定比色液中蓝色的强度值。发明人研究发现，在将蓝色检测液与待测尿液混匀后，显色反应较快，5min之前颜色变化较大，10min以后颜色基本稳定不再明显变化，因此选择10-30min为最佳测试时间点。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述测定比色液中蓝色的强度值的方法包括：对比色液进行拍照，获得比色液图像后，读取比色液图像的RGB值。优选地，通过智能手机或相机测定比色液中蓝色的强度值。
比色原理：RGB色彩就是常说的三原色，R代表Red(红色)，G代表Green(绿色)，B代表Blue(蓝色)。自然界中肉眼所能看到的任何色彩都可以由R、G、B三色不同分量色彩混合叠加而成。每个像素的RGB分量的强度数值在0-255之间，不同的分量组合形成了不同的肉眼可见颜色，如：白色(255,255,255)、黑色(0,0,0)、纯蓝色(0,0,255)。通过多种图像处理软件(例如photoshop、手机Color picker APP软件等)即可阅读图像上面的红、绿、蓝三色的光亮度，然后把这些亮度转换成RGB三原色数据，如图2所示。
利用这一特点，智能手机或者相机可以作为定量测定工具，通过在颜色分析软件的辅助下，将待分析物质在特殊化学环境下发生的颜色变化，定量解析为红、绿、蓝三原色。
在本发明中，由于葡萄糖量与溶液的蓝色存在相关性，因此将三原色中B值(即蓝色的强度值)解析出来作为计算的依据。通过对16个浓度的葡萄糖溶液(0.000、0.002、0.039、0.078、0.156、0.313、0.625、1.250、1.880、2.500、3.750、5.000、10.000、15.00、20.000、30.000mg mL-1)进行分析，如图3所示，随着葡萄糖量的增加，溶液颜色明显逐渐变浅，可以实现葡萄糖的可视化定性分析。进一步，通过“葡萄糖浓度vs B值”的某种函数关系还可实现定量分析。
本实施方式还提供一种尿糖定量检测试剂盒，其包括：3,3',5,5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶、过氧化氢溶液和葡萄糖氧化酶。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述辣根过氧化物酶、3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢溶液的质量比为1：1.5×104-2.5×104：1×102-4×102。
通过该尿糖定量检测试剂盒，患者可自行在家对自己的尿糖进行监测，方便快捷，且准确性高。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：
实施例
本实施例提供一种简易的尿糖定量检测方法，并用该方法检测糖尿病患者尿液中的葡萄糖含量。
a.收集4份糖尿病患者(男女各半)尿液，所有样品均未经过预处理和稀释，均为新鲜使用。
b.在酶标板孔内依次加入30uL TMB(2mg/mL)、30uL HRP(100ng/mL)、10uL H2O2(0.078％)、130uL底物缓冲溶液、50ul GOD(10mg/mL，GOD≥300U/g),得到四份蓝色检测液。
c.将步骤a中收集的4份待检尿液与步骤b中获得的四份蓝色检测液混合，轻摇10s混匀，静置反应10min后拍照，读取各比色液图像的蓝色强度值(即RGB色彩中的B值)。
由于溶液中的葡糖糖浓度(C)的对数值(即lnC)与蓝色强度的对数值(即lnB)之间存在线性关系，通过采用同样的方法对多个浓度的葡萄糖标准溶液进行分析，得到标准曲线方程；再将上述所得的各比色液图像的蓝色强度值带入标准曲线方程中，得到该4名患者的血糖结果分别为：0.14±0.03mg/mL、0.70±0.02mg/mL、0.25±0.05mg/mL和0.31±0.05mg/mL。
实验例
下面结合实验数据对本发明提供的方法进行说明。
一.方法与材料：
1.仪器与测试方法
将酶标板平放置于白色背景上，将小米6X智能手机垂直置于酶标板正上方20cm处，关闭闪光灯，摄像头对准酶标板的每个孔，在自动模式下拍照采集图像，最后通过手机内软件包Color Picker 1.5.2对图像的RGB值进行分析
2.材料
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，GOD≥300U/g)，辣根过氧化物酶(horseradishperoxidsae，HRP)，3,3′5,5′-四甲基联苯胺(3,3′5,5′-tetramethylbenzidine，TMB)从阿拉丁生化科技有限公司(上海)购买。底物缓冲溶液(配制为1.84g Na2HPO4、1.84g柠檬酸加水至100mL)、过氧化氢(H2O2)、pH 7.4PBS磷酸盐缓冲液、其他化学物质AR级采购自国药集团化学试剂有限公司购买。
二.分析方法的优化
2.1优化TMB与HRP量和反应时间
向酶标板(4×5)孔内分别加入30uL TMB溶液和HRP溶液，其中横排每行中TMB的浓度分别为1、2、3、4mg/mL，竖排每列中HRP的浓度分别为25、50、100、200、400ng/mL。再向每孔内加入10uL H2O2(0.75％)和130uL底物缓冲液，轻摇10s混匀，静置反应1、5、10、15、20min后测定。
结果表明：在H2O2存在下，TMB浓度对显色影响不大，HRP的量对显色影响比较明显。随着HRP浓度增加，反应颜色逐渐加深，HRP和TMB浓度分别为100ng/mL、2mg/mL时显色效果最佳。显色反应较快，5min之前颜色变化较大，10min以后颜色基本稳定不再明显变化，因此选择10min为最佳测试时间点。
2.2选择H2O2的最优添加量
首先向酶标板的14个孔中依次加入10uL浓度分别为0.000％、0.005％、0.010％、0.015％、0.020％、0.026％、0.039％、0.078％、0.156％、0.313％、0.625％、1.250％、2.500％、5.000％的H2O2溶液。然后再向每孔分别加入30uL TMB(2mg/mL)、10uL HRP(100ng/mL)、130uL底物缓冲液，轻摇10s混匀，静置反应10min后测定。
通过考察浓度分别为0-5％的14个H2O2样品，结果如图4(上)所示，可明显地观察到：随着H2O2浓度的增加，溶液颜色逐渐加深，然后又逐渐变浅；空白的背景值较大，且颜色变浅过程更为明显、其相对应的H2O2浓度范围也更宽。通过绘制H2O2浓度与色度B值的关系曲线，如图4(下)所示H2O2的拐点浓度为0.078％时，这一结果与图4(上)肉眼观察到的颜色最深结果一致，因此选择H2O2的添加浓度为0.078％。
2.3优化GOD最佳浓度
首先向酶标板的4个孔中加入50ul浓度分别为1、5、10、15mg/mL的GOD溶液。然后再向每孔依次加入30uL TMB(2mg/mL)、10uL HRP(100ng/mL)、10uL H2O2(0.75％)、130uL底物缓冲液、50uL Glu(20mg/mL)，轻摇10s混匀，静置反应10min后测定。
结果显示，随着GOD浓度增大溶液逐渐变浅且色差较为明显。当浓度大于10mg/mL后颜色基本不变，因此在该检测体系中，当GOD溶液的浓度为10mg/mL时，显色效果最佳。
2.4方法学验证
2.4.1标准曲线及最低检测限(LOD)：
用PBS缓冲液配制5个浓度分别为：0.039、0.078、0.313、5.000、10.000mg/mL的葡萄糖标准溶液，按照实施例的步骤进行分析，以B值的对数为纵坐标(y)、浓度C的对数为横坐标(x)，进行二元一次线性回归分析，得到标准曲线方程为y＝0.148x+5.13，R2＝0.996。LOD为空白样品平均值的3倍标准偏差计算而得，经测定LOD为0.009mg/mL。
2.4.2精密度：
精密度通过日内试验和日间试验进行评价。选取浓度分别为0.156、1.250和5.000mg/mL的三个葡萄糖对照品溶液，在一天内分别重复测定9次，计算测定结果的变异系数，用于评价日内精密度(intra-precision)；类似地，将这三个对照品在三天内分别重复测定9次，计算测定结果的变异系数用于评价日间精密度(inter-precision)。
通过对上述高、中、低3个浓度的葡萄糖对照品溶液，在一天内和三天内的分析，计算出一天内的变异系数为2.8％-4.8％，三天的变异系数为2.4％-4.2％，均变异系数均小于5％，说明这个方法具有较好的准确性。
2.4.3重复性和回收率：
重复性和回收率通过如下方法评价：随即选取一份糖尿病人的尿液，按照实施例中的分析方法独立、平行测定6次，计算其变异系数评价重复性。接着，再分别向该尿液中加入其测定含量80％、100％、120％的葡萄糖对照品，每个浓度重复三份，然后按照实施例中的分析方法进行测定，以检测到的量与添加量的比值计算回收率。
同一份糖尿病人的尿液，独立、平行测定6次的结果为0.70±0.02mg/mL，CV为4.7％，结果表明重复性良好。按照样品测得浓度(0.70mg/mL1)的80％、100％、120％，分别添加0.56、0.70、0.84mg/mL/葡萄糖对照品溶液后，计算得到高中低浓度的回收率分别为94.66±3.13、96.19±1.65、94.76±4.36mg/mL，CV值分别为3.31％、1.71％和4.6％，表明加样回收良好。
上述方法学验证结果表明，本发明所开发的这种简易的尿糖定量检测方法符合定量分析的要求，该方法线性范围宽、重复性好、结果准确度高，可用于尿中或者其它生物样本中葡萄糖浓度的检测。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (7)

1.一种简易的尿糖定量检测方法，其特征在于，其包括：
将3,3',5,5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶、过氧化氢溶液和葡萄糖氧化酶混合，得到蓝色检测液；
将所述蓝色检测液与待测尿液混匀，得到比色液，测定所述比色液中蓝色的强度值，计算得到所述待测尿液中的血糖值。
2.根据权利要求1所述尿糖定量检测方法，其特征在于，测定所述比色液中蓝色的强度值的方法包括：对所述比色液进行拍照，获得比色液图像后，读取所述比色液图像的RGB值。
3.根据权利要求2所述尿糖定量检测方法，其特征在于，通过智能手机或相机测定所述比色液中蓝色的强度值。
4.根据权利要求1所述尿糖定量检测方法，其特征在于，在将所述蓝色检测液与待测尿液混匀，将所得的比色液静置5-30min后，再测定所述比色液中蓝色的强度值。
根据权利要求1所述尿糖定量检测方法，其特征在于，在制备所述蓝色检测液的步骤中，所述辣根过氧化物酶与所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺的质量比为1：1.5×104-2.5×104。根据权利要求1所述尿糖定量检测方法，其特征在于，在制备所述蓝色检测液的步骤中，所述辣根过氧化物酶与所述过氧化氢的质量比为1：1×102-4×102。
5.根据权利要求1所述尿糖定量检测方法，其特征在于，所述蓝色检测液中还包括底物缓冲溶液。
6.一种尿糖定量检测试剂盒，其特征在于，其包括：3,3',5,5'-四甲基联苯胺、辣根过氧化物酶、过氧化氢溶液和葡萄糖氧化酶。
7.根据权利要求8所述的尿糖定量检测试剂盒，其特征在于，所述辣根过氧化物酶、所述3,3',5,5'-四甲基联苯胺和所述过氧化氢溶液的质量比为1:1.5×104-2.5×104:1×102-4×102。
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