CN105154577A - 快速检测α2变异等位基因的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速检测α2变异等位基因的试剂盒。所述α2变异等位基因为α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)中α2基因的变异基因型，该基因型被描述为HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC。本发明所述的试剂盒包括扩增引物和荧光探针，具体包括:一对可以扩增α2变异等位基因的特征序列的引物对，一对可以扩增内参基因GAPDH片段的引物对；一条特异性检测α2变异等位基因扩增产物的荧光探针，一条特异性检测内参基因GAPDH片段扩增产物的荧光探针。本发明所述试剂盒对α2变异等位基因检测具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。

Description

快速检测α2变异等位基因的试剂盒
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种快速检测α2变异等位基因的试剂盒。
背景技术
在申请人的研究过程中，发现一种新型的α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)中α2基因的变异基因型，该基因型被描述为HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC。申请人还发现该基因型在广西有一定的分布几率，为对该基因型进行检测，需要建立一种可以快速检测HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的试剂盒。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速检测α2变异等位基因(即目标区段为HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因)的试剂盒。
本发明所述的快速检测α2变异等位基因的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其特征在于:
所述α2变异等位基因为α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)中α2基因的变异基因型，该基因型被描述为HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC，序列具体为：
gggttgcgggaggtgtagcgcaggcggcggctgcgggcctgggccCTCGGCCCcactgaccctcttctctgcacagctcctaagccactgcctgctggtgaccctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacgcctccctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtagccgttcctcctgcccgctgggcctcccaacgggccctcctcccctccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaagtctgagtgggcagcagcctgtgtgtgcctgggttctctctatcccggaatgtgccaacaatggaggtgtttacctgtctcagaccaagga；
所述的扩增引物为:一对可以扩增α-珠蛋白基因簇中HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物A2V-F和A2V-R，一对可以扩增内参基因GAPDH片段的引物GAPDH-F和GAPDH-R；
所述的荧光探针为:一条特异性检测A2V-F和A2V-R扩增产物的荧光探针A2V-Prob，一条特异性检测GAPDH-F和GAPDH-R扩增产物的荧光探针GAPDH-Prob；
其中:
所述的可以扩增α-珠蛋白基因簇中HBA2：c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物中，
A2V-F:5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3’；
A2V-R:5’-TCCTTGGTCTGAGACAGGTA-3’；
所述的可以扩增内参基因GAPDH片段的引物对中，
GAPDH-F:5’-CCCCACACACATGCACTTACC-3’；
GAPDH-R:5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’；
所述的特异性检测A2V-F和A2V-R扩增产物的荧光探针A2V-Prob为：
A2V-Prob:5’-6-ROX-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-BHQ-1-3’。
所述的特异性检测GAPDH-F和GAPDH-R扩增产物的荧光探针GAPDH-Prob为：
GAPDH-Prob:5’-CY5-AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-BHQ-2-3’。
本发明所述的荧光探针中，ROX指羧基-X-罗丹明，CY5是指花青染料分子5，BHQ-1和BHQ-2是指荧光淬灭基团。
本发明所述的快速检测α2变异等位基因的试剂盒，还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgCl2和dNTP。具体地，酶液为Taq聚合酶体系，包括可用于水解探针法的热启动酶体系等；所述缓冲液为常规的PCR缓冲液。当酶液选择采用康为世纪所生产的GoldStarTaqDNAPolymerase时，缓冲液则优选为与GoldStarTaqDNAPolymerase配套的缓冲液。
采用上述试剂盒快速检测α2变异等位基因的方法包括以下步骤：
1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；
2)配制反应体系，具体为：
将引物A2V-F、A2V-R、GAPDH-F和GAPDH-R，荧光探针A2V-Prob和GAPDH-Prob，以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系；
3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可以反映所检测模板数的多少)；
4)数据分析及结果判定：根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结果；当CY5通道有Cq值读数时，则该样本被正常扩增；在CY5通道有读数的前提下，若ROX通道有读数，则表示该样本携带HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因；在CY5通道有读数的前提下，若ROX通道没有Cq值读数，则表示该样本不携带HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因。
上述方法的步骤1)中，采用现有常规方法制备DNA模板。
上述方法的步骤2)中，反应体系中各组分的浓度优选为：待检测DNA：1～3ng/μL；各引物：0.3～0.5μmol/L；各荧光探针浓度为0.3～0.5μmol/L；DNA模板：20～200ng；镁离子：1.5～1.9mmol/L；反应体系的终体积优选为20μL。
上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件为：95℃预变性8～12分钟，然后95℃15～30秒，60℃退火50～70秒，39～49个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。
与现有技术相比，本发明的特点在于：
1、采用本发明所述试剂盒可以实现单管单次反应直接完成HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的检测；对HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因检测具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。
2、本发明无需开管操作，极大限度地降低了实验室PCR产物污染的可能。
附图说明
图1为本发明实施例1中1#样本的扩增曲线；
图2为本发明实施例1中2#样本的扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果
1、试剂盒的组成：
(1)可以扩增α-珠蛋白基因簇中HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因(所述HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的序列具体为：gggttgcgggaggtgtagcgcaggcggcggctgcgggcctgggccCTCGGCCCcactgaccctcttctctgcacagctcctaagccactgcctgctggtgaccctggccgcccacctccccgccgagttcacccctgcggtgcacgcctccctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtagccgttcctcctgcccgctgggcctcccaacgggccctcctcccctccttgcaccggcccttcctggtctttgaataaagtctgagtgggcagcagcctgtgtgtgcctgggttctctctatcccggaatgtgccaacaatggaggtgtttacctgtctcagaccaagga(SEQIDNO：1))的特征序列的引物对A2V-F和A2V-R：
A2V-F:5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3’(SEQIDNO：2)；
A2V-R:5’-TCCTTGGTCTGAGACAGGTA-3’(SEQIDNO：3)；
(2)可以扩增内参基因GAPDH片段的引物对中GAPDH-F和GAPDH-R：
GAPDH-F:5’-CCCCACACACATGCACTTACC-3’(SEQIDNO：4)；
GAPDH-R:5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’(SEQIDNO：5)；
(3)特异性检测A2V-F和A2V-R扩增产物的荧光探针A2V-Prob为：
A2V-Prob:5’-6-ROX-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-BHQ-1-3’(SEQIDNO：6)；
(4)特异性检测GAPDH-F和GAPDH-R扩增产物的荧光探针GAPDH-Prob为：
GAPDH-Prob:5’-CY5-AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-BHQ2-3’(SEQIDNO：7)。
上述内参基因GAPDH片段的序列参见(ZimmermannB,HolzgreveW,WenzelF,HahnS.Novelreal-timequantitativePCRtestfortrisomy21.ClinChem.2002Feb；48(2):362-3.)，具体如下：
CCCCACACACATGCACTTACCTGTGCTCCCACTCCTGATTTCTGGAAAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGCAA(SEQIDNO：8)。
(5)其它组成成分：
GoldStarTaqDNAPolymerase、与GoldStarTaqDNAPolymerase配套的缓冲液和dNTPs均购自康为世纪，MgCl2购自LifeTechnology。
按下述表1配制PCR反应体系：
表1：(mM表示mmol/L，μM表示μmol/L)
2、实施方法：
PCR反应所用仪器为Bio-Rad实时热循环仪CFX96。PCR反应程序为：95℃预变性10分钟，然后95℃15秒，60℃退火60秒，40个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。
样本处理：采用Lab-AidDNAminiextractionkid(Bio-V,Xiamen)试剂盒抽提DNA，以双蒸水稀释至20～200ng/μL备用。DNA样本也可采用其他常规DNA提取方法提取。
样本检测：将已知含有HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC基因型待检样本(简称1#样本)，以及1份正常基因型(αα/αα,N/N)样本(简称2#样本)，根据上述反应体系和反应程序，于荧光定量PCR仪上进行扩增检测，记录Cq值。
3、样本来源：所有样本均来源自经常规测序技术确定基因型的DNA样本。
4、数据分析及结果判定：根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结果；当CY5通道有Cq值读数时，则该样本被正常扩增；在CY5通道有读数的前提下，若ROX通道有读数，则表示该样本携带HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因；在CY5通道有读数的前提下，若ROX通道没有Cq值读数，则表示该样本不携带HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因。
经检测分析，1#样本的CY5通道有Cq值且ROX通道有Cq值(扩增曲线如图1所示，Cq值读数由表2所示)，表示1#样本携带HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因；2#样本的CY5通道有Cq值且ROX通道没有Cq值(扩增曲线如图2所示，Cq值读数由表3所示)，表示2#样本不携带HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因。
表2：
表3：
可见，采用本发明所述试剂盒进行α2变异等位基因检测时，结果准确；而且野生型样本无非特异性扩增，具有较高的特异性。
实施例2：本发明所述试剂盒在随机基因型样本中的检测效果。
1、试剂盒的组成：
同实施例1。
2、实施方法：
同实施例1。
3、样本来源：
样本为6例随机样本(由钦州市妇幼保健院提供)，以双蒸水稀释至20～200ng，作为待检样本)，以及经测序验证的1例野生型样本，1例含HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因样本。
4、数据分析及结果判定：
根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结果；当CY5通道有Cq值读数时，则该样本被正常扩增；在CY5通道有读数的前提下，若ROX通道有读数，则表示该样本携带HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因；在CY5通道有读数的前提下，若ROX通道没有Cq值读数，则表示该样本不携带HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因。
表4：
注：样本类型中NegCtrl＝阴性对照，PosCtrl＝阳性对照，Unkn＝未知样本类型，检测结果中，N/A＝无Cq值。
结果显示，野生型样本与阳性样本检出Cq值与理论一致，随机样本中检出1例HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因。

Claims (2)

1.快速检测α2变异等位基因的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其特征在于:
所述α2变异等位基因为α-珠蛋白基因簇(NG_000006.1)中α2基因的变异基因型，该基因型被描述为HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC；
所述的扩增引物为:一对可以扩增α-珠蛋白基因簇中HBA2:c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物A2V-F和A2V-R，一对可以扩增内参基因GAPDH片段的引物GAPDH-F和GAPDH-R；
所述的荧光探针为:一条特异性检测A2V-F和A2V-R扩增产物的荧光探针A2V-Prob，一条特异性检测GAPDH-F和GAPDH-R扩增产物的荧光探针GAPDH-Prob；
其中:
所述的可以扩增α-珠蛋白基因簇中HBA2：c.301-24delinsCTCGGCCC等位基因的特征序列的引物对中，
A2V-F:5’-GGGTTGCGGGAGGTGTAG-3’；
A2V-R:5’-TCCTTGGTCTGAGACAGGTA-3’；
所述的可以扩增内参基因GAPDH片段的引物对中，
GAPDH-F:5’-CCCCACACACATGCACTTACC-3’；
GAPDH-R:5’-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’；
所述的特异性检测A2V-F和A2V-R扩增产物的荧光探针A2V-Prob为：
A2V-Prob:5’-6-ROX-CCTCGGCCCCACTGACCCTC-BHQ-1-3’；
所述的特异性检测GAPDH-F和GAPDH-R扩增产物的荧光探针GAPDH-Prob为：
GAPDH-Prob:5’-CY5-AAAGAGCTAGGAAGGACAGGCAACTTGGC-BHQ-2-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括缓冲液、酶液、MgCl2和dNTP。
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