CN105154580A - 基于水解探针法的快速检测地中海贫血罕见缺失型的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于水解探针法的快速检测地中海贫血罕见缺失型的试剂盒。该试剂盒包括：一对扩增α-珠蛋白基因簇中--^THAI等位基因的特征序列的引物，一对扩增β-珠蛋白基因簇中HPFH-SEA等位基因的引物，一对扩增β-珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物，一对扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段等位基因的引物；一条特异性检测--^THAI基因型扩增产物的探针，一条特异性检测HPFH-SEA基因型扩增产物的探针，一条特异性检测DBT基因型扩增产物的探针及一条特异性检测α1区段等位基因扩增产物的探针。本发明所述试剂盒对--^THAI、HPFH-SEA和DBT检测具有高度的灵敏性、稳定性、准确性及较高的特异性。

Description

基于水解探针法的快速检测地中海贫血罕见缺失型的试剂盒

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种基于水解探针法的快速检测地中海贫血罕见缺失型的试剂盒。

背景技术

地中海贫血也称珠蛋白合成障碍性贫血，简称地贫。地中海贫血是广西地区最常见的单基因遗传疾病之一，常见的地贫种类有α-地贫和β-地贫。中国人群中，α-地贫的基因型常见的为缺失型--^SEA、-α^3.7和-α^4.2。申请人在日常检测中发现α地贫中的泰国型缺失(--^THAI)以及β地贫中的HPFH-SEA和中国型缺失(Gγ+(Aγδβ)0，简写为DBT)在相对罕见的缺失型地贫中占有较高的比例，而这些地贫等位基因并未在常规地贫检测试剂盒以内。为了避免这些罕见等位基因的漏筛，需要建立一种可以快速诊断--^THAI、HPFH-SEA和DBT等位基因的检测试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种基于水解探针法的快速检测地中海贫血罕见缺失型的试剂盒。采用该试剂盒可以实现该试剂盒可以实现单管单次反应完成--^THAI、HPFH-SEA和DBT这3种罕见缺失型地中海贫血等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。

本发明所述的基于水解探针法的快速检测地中海贫血罕见缺失型的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其特征在于：

所述的扩增引物为：一对扩增α-珠蛋白基因簇中--^THAI等位基因的特征序列的引物THAI-F和THAI-R，一对扩增β-珠蛋白基因簇中HPFH-SEA等位基因的引物HPFH-F和HPFH-R，一对扩增β-珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和DBT-R，以及一对扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段等位基因的引物A1-F和A1-R；

所述的荧光探针为：一条特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的荧光探针THAI-Prob，一条特异性检测HPFH-F和HPFH-R扩增产物的荧光探针HPFH-Prob，一条特异性检测DBT-F和DBT-R扩增产物的荧光探针DBT-Prob，以及一条特异性检测A1-F和A1-R扩增产物的荧光探针A1-Prob；

其中：

扩增α-珠蛋白基因簇中--^THAI等位基因的特征序列的引物THAI-F和THAI-R为：

THAI-F：5’-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3’；

THAI-R：5’-CTTGGATCTGCACCTCTG-3’；

扩增β-珠蛋白基因簇中HPFH-SEA等位基因的引物HPFH-F和HPFH-R为：

HPFH-F：5’-TCCGCAGAACACTTTATTTCAC-3’；

HPFH-R：5’-AGCCTCATGGTAGCAGAATC-3’；

扩增β-珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和DBT-R为：

DBT-F：5’-GGGTGAGGAACAATTGAAAC-3’；

DBT-R：5’-ACCACATCCCTAACACAAC-3’；

扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段等位基因的引物A1-F和A1-R为：

A1-F：5’-GTTCCTGGCTTCTGTGAG-3’；

A1-R：5’-CACGTTTGCTGAGGGAAA-3’；

所述特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的荧光探针THAI-Prob为：

THAI-Prob：5’-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’；

所述特异性检测HPFH-F和HPFH-R扩增产物的荧光探针HPFH-Prob为：

HPFH-Prob：5’-6-FAM-TGTTTGCCTGCTTTAAGTTCCAGACCT-BHQ-2-3’；

所述的特异性检测DBT-F和DBT-R扩增产物的荧光探针DBT-Prob为：

DBT-Prob：5’-ROX-ACTATCACACCCTGCTTACCTCTGATGGA-BHQ-2-3’；

所述的特异性检测A1-F和A1-R扩增产物的荧光探针A1-Prob为：

A1-Prob：5’-HEX-ACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTA-BHQ-2-3’。

本发明所述的荧光探针中，FAM指羧基荧光素，HEX指六氯-6-甲基荧光素，ROX指羧基-X-罗丹明，CY5是指花青染料分子5，BHQ-2是指荧光淬灭基团。

本发明所述的试剂盒，还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分，如缓冲液、酶液、MgCl₂和dNTP。具体地，酶液为Taq聚合酶体系，包括可用于水解探针法的热启动酶体系等；所述缓冲液为常规的PCR缓冲液。当酶液选择采用康为世纪所生产的GoldStarTaqDNAPolymerase时，缓冲液则优选为与GoldStarTaqDNAPolymerase配套的缓冲液。

采用上述试剂盒快速检测--^THAI、HPFH-SEA和DBT的方法，包括以下步骤：

1)抽提样本基因组DNA，制备DNA模板；

2)配制反应体系，具体为：

将引物THAI-F、THAI-R、HPFH-F、HPFH-R、DBT-F、DBT-R、A1-F和A1-R，探针THAI-Prob、HPFH-Prob、DBT-Prob和A1-Prob；以及PCR缓冲液、酶液、MgCl2、dNTP、水和DNA模板配制成反应体系；

3)样本检测：分别将配制的反应体系进行PCR扩增，记录每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环次数Cq(Cq值的大小可以反映所检测模板数的多少)；

4)数据分析及结果判定：根据实时荧光定量PCR仪自带的分析软件分析判读结果；内参基因为A1，若HEX通道显示有Cq值，则代表该样本正常扩增。具体判定如下：

在HEX通道显示有Cq值前提下，当CY5通道有Cq值读数时，则表示该样本携带--^THAI等位基因；

在HEX通道显示有Cq值前提下，当FAM通道有Cq值读数时，则表示该样本携带HPFH-SEA等位基因；

在HEX通道显示有Cq值前提下，当ROX通道有读数时，则表示该样本携带DBT等位基因；

仅有HEX通道显示有Cq值，其余通道无Cq值，则表示该样本不携带--^THAI、HPFH-SEA和DBT等位基因；

在极少数基因型的情况下A1是没有扩增产物的，如--/--基因型等，这需要再进一步地分析。

上述方法的步骤2)中，反应体系中各组分的浓度优选为：待检测DNA：1～3ng/μL；各引物：0.3～0.5μmol/L；各荧光探针浓度为0.3～0.5μmol/L；DNA模板：20～200ng；镁离子：1.5～1.9mmol/L；反应体系的终体积优选为20μL。

上述方法的步骤3)中，PCR扩增条件为：95℃预变性8～12分钟，然后95℃15～30秒，60℃退火50～70秒，39～49个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。

与现有技术相比，本发明的特点在于：

1、本发明所述试剂盒可以实现单管单次反应完成--^THAI、HPFH-SEA和DBT这3种罕见缺失型地中海贫血等位基因的检测，且具有高度的灵敏性、稳定性和准确性，以及较高的特异性。

2、本发明所述试剂盒基于溶解法进行检测时无需开管操作，极大限度地降低实验室PCR产物污染的可能；另一方面，采用溶解曲线分析法，该方法是目前使用实时荧光定量PCR仪中最廉价的实验体系构建方法，成本更低也更易于推广。

附图说明

图1为本发明实施例1中1#样本的扩增曲线；

图2为本发明实施例1中2#样本的扩增曲线；

图3为本发明实施例1中3#样本的扩增曲线；

图4为本发明实施例1中4#样本的扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。

实施例1：采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果

1、试剂盒的组成：

(1)扩增α-珠蛋白基因簇中--THAI等位基因的特征序列的引物对THAI-F和THAI-R：

THAI-F：5’-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3’(SEQIDNO：1)；

THAI-R：5’-CTTGGATCTGCACCTCTG-3’(SEQIDNO：2)；

(2)扩增HPFH-SEA等位基因的特征序列的引物对HPFH-F和HPFH-R：

HPFH-F：5’-TCCGCAGAACACTTTATTTCAC-3’(SEQIDNO：3)；

HPFH-R：5’-AGCCTCATGGTAGCAGAATC-3’(SEQIDNO：4)；

(3)扩增β-珠蛋白基因簇中DBT等位基因征序列的引物对DBT-F和DBT-R：

DBT-F：5’-GGGTGAGGAACAATTGAAAC-3’(SEQIDNO：5)；

DBT-R：5’-ACCACATCCCTAACACAAC-3’(SEQIDNO：6)；

(4)扩增α-珠蛋白基因簇中α1等位基因区段特征序列的引物对A1-F和A1-R：

A1-F：5’-GTTCCTGGCTTCTGTGAG-3’(SEQIDNO：7)；

A1-R：5’-CACGTTTGCTGAGGGAAA-3’(SEQIDNO：8)；

所述α1等位基因区段特征序列为：

Ctggacaagttcctggcttctgtgagcaccgtgctgacctccaaataccgttaagctggagcctcggtggccatgcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcagcctgtgtgtgcctgagttttttccctcagcaaacgtgccaggc(SEQIDNO：9)；

(5)特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的荧光探针THAI-Prob为：

THAI-Prob：5’-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’(SEQIDNO：10)；

(6)特异性检测HPFH-F和HPFH-R扩增产物的荧光探针HPFH-Prob为：

HPFH-Prob：5’-6FAM-TGTTTGCCTGCTTTAAGTTCCAGACCT-BHQ-2-3’(SEQIDNO：11)；

(7)特异性检测DBT-F和DBT-R扩增产物的荧光探针DBT-Prob为：

DBT-Prob：5’-ROX-ACTATCACACCCTGCTTACCTCTGATGGA-BHQ-2-3’(SEQIDNO：12)；

(8)特异性检测A1-F和A1-R扩增产物的荧光探针A1-Prob为：

A1-Prob：5’-HEX-ACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTA-BHQ-2-3’(SEQIDNO：13)；

(9)其它组成成分：

GoldStarTaqDNAPolymerase、与GoldStarTaqDNAPolymerase配套的缓冲液和dNTPs均购自康为世纪，MgCl₂购自LifeTechnology。

按下述表1配制PCR反应体系：

表1：(mM表示mmol/L，μM表示μmol/L)

2、实施方法：

PCR反应所用仪器为Bio-Rad实时热循环仪CFX96。PCR反应程序为：95℃预变性10分钟，然后95℃15秒，60℃退火60秒，40个循环，于60℃退火步骤末采集荧光信号。

样本处理：采用Lab-AidDNAminiextractionkid(Bio-V,Xiamen)试剂盒抽提DNA，以双蒸水稀释至20～200ng/μL备用。DNA样本也可采用其他常规DNA提取方法提取。

样本检测：将3份已知基因型待检样本(分别简称为1#样本、2#样本和3#样本)，以及1份正常基因型(αα/αα，N/N)样本(简称为4#样本)，根据上述反应体系和反应程序，于荧光定量PCR仪上进行扩增检测，记录Cq值。

3、样本来源：所有样本均来源自经常规Gap-PCR技术确定基因型的DNA样本。

4、数据分析及结果判定：根据实时荧光PCR仪自带的分析软件分析判读结果。内参基因为A1，若HEX通道显示有Cq值，则代表该样本正常扩增。具体判定如下：

在HEX通道显示有Cq值前提下，当CY5通道有Cq值读数时，则表示该样本携带--^THAI等位基因；

在HEX通道显示有Cq值前提下，当FAM通道有Cq值读数时，则表示该样本携带HPFH-SEA等位基因；

在HEX通道显示有Cq值前提下，当ROX通道有读数时，则表示该样本携带DBT等位基因；

仅有HEX通道显示有Cq值，其余通道无Cq值，则表示该样本不携带--^THAI、HPFH-SEA和DBT等位基因；

在极少数基因型的情况下A1是没有扩增产物的，如--/--基因型等，这需要再进一步地分析。

经检测分析，1#样本的HEX通道有Cq值，且ROX通道有Cq值(扩增曲线如图1所示，Cq值读数由表2所示)，表示1#样本携带DBT等位基因；2#样本的HEX通道有Cq值，且FAM通道有Cq值(扩增曲线如图2所示，Cq值读数由表3所示)，表示2#样本携带HPFH-SEA等位基因；3#样本的HEX通道有Cq值，且Cy5通道有Cq值(扩增曲线如图3所示，Cq值读数由表4所示)，表示3#样本携带--^THAI等位基因；4#样本的HEX通道有Cq值，其余通道均无Cq值(扩增曲线如图4所示，Cq值读数由表5所示)，表示4#样本不携带--^THAI、HPFH-SEA和DBT等位基因；

表2：

表3：

表4：

表5：

可见，采用本发明所述试剂盒进行--^THAI、HPFH-SEA和DBT等位基因检测时，结果准确；而且野生型样本无非特异性扩增，具有较高的特异性。

实施例2：本发明所述试剂盒在随机基因型样本中的检测效果。

1、试剂盒的组成：

同实施例1。

2、实施方法：

同实施例1。

3、样本来源：

样本为7例随机样本(由钦州市妇幼保健院提供)，以双蒸水稀释至20～200ng，作为待检样本)，以及经Gap-PCR验证的2例野生型样本，3例阳性样本(其中1例--^THAI，1例HPFH-SEA，1例DBT)。

4、数据分析及结果判定：

根据实时荧光PCR仪自带的分析软件分析判读结果。内参基因为A1，若HEX通道显示有Cq值，则代表该样本正常扩增。具体判定如下：

在HEX通道显示有Cq值前提下，当CY5通道有Cq值读数时，则表示该样本携带--^THAI等位基因；

在HEX通道显示有Cq值前提下，当FAM通道有Cq值读数时，则表示该样本携带HPFH-SEA等位基因；

在HEX通道显示有Cq值前提下，当ROX通道有读数时，则表示该样本携带DBT等位基因；

仅有HEX通道显示有Cq值，其余通道无Cq值，则表示该样本不携带--^THAI、HPFH-SEA和DBT等位基因；

在极少数基因型的情况下A1是没有扩增产物的，如--/--基因型等，这需要再进一步地分析。

在用本发明所述试剂盒及方法对上述样本进行检测的同时，采用现有的Gap-PCR方法进行验证，结果如下述表6所示：

表6：

注：样本类型中NegCtrl＝阴性对照，PosCtrl＝阳性对照，Unkn＝未知样本类型，检测结果中，N/A＝无Cq值。

结果显示，野生型样本与阳性样本检出Cq值与理论一致，随机样本中检出1例--^THAI等位基因。

Claims (2)

1.基于水解探针法的快速检测地中海贫血罕见缺失型的试剂盒，包括扩增引物和荧光探针，其特征在于：

所述的扩增引物为：一对扩增α-珠蛋白基因簇中--^THAI等位基因的特征序列的引物THAI-F和THAI-R，一对扩增β-珠蛋白基因簇中HPFH-SEA等位基因的引物HPFH-F和HPFH-R，一对扩增β-珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和DBT-R，以及一对扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段等位基因的引物A1-F和A1-R；

所述的荧光探针为：一条特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的荧光探针THAI-Prob，一条特异性检测HPFH-F和HPFH-R扩增产物的荧光探针HPFH-Prob，一条特异性检测DBT-F和DBT-R扩增产物的荧光探针DBT-Prob，以及一条特异性检测A1-F和A1-R扩增产物的荧光探针A1-Prob；

其中：

扩增α-珠蛋白基因簇中--^THAI等位基因的特征序列的引物THAI-F和THAI-R为：

THAI-F：5’-AAGCGAGAGGAATCACATTC-3’；

THAI-R：5’-CTTGGATCTGCACCTCTG-3’；

扩增β-珠蛋白基因簇中HPFH-SEA等位基因的引物HPFH-F和HPFH-R为：

HPFH-F：5’-TCCGCAGAACACTTTATTTCAC-3’；

HPFH-R：5’-AGCCTCATGGTAGCAGAATC-3’；

扩增β-珠蛋白基因簇中DBT等位基因的引物DBT-F和DBT-R为：

DBT-F：5’-GGGTGAGGAACAATTGAAAC-3’；

DBT-R：5’-ACCACATCCCTAACACAAC-3’；

扩增α-珠蛋白基因簇中α1区段等位基因的引物A1-F和A1-R为：

A1-F：5’-GTTCCTGGCTTCTGTGAG-3’；

A1-R：5’-CACGTTTGCTGAGGGAAA-3’；

所述特异性检测THAI-F和THAI-R扩增产物的荧光探针THAI-Prob为：

THAI-Prob：5’-CY5-TGTACCAAGTGGGCTGAGCCCTTGA-BHQ-2-3’；

所述特异性检测HPFH-F和HPFH-R扩增产物的荧光探针HPFH-Prob为：

HPFH-Prob：5’-6-FAM-TGTTTGCCTGCTTTAAGTTCCAGACCT-BHQ-2-3’；

所述的特异性检测DBT-F和DBT-R扩增产物的荧光探针DBT-Prob为：

DBT-Prob：5’-ROX-ACTATCACACCCTGCTTACCTCTGATGGA-BHQ-2-3’；

所述的特异性检测A1-F和A1-R扩增产物的荧光探针A1-Prob为：

A1-Prob：5’-HEX-ACCGTGCTGACCTCCAAATACCGTTA-BHQ-2-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括缓冲液、酶液、MgCl₂和dNTP。