CN114292908A - 检测地中海贫血基因罕见突变的试剂、方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测地中海贫血罕见基因突变的试剂、方法和试剂盒，所述试剂包括特异性扩增α地中海贫血和β地中海贫血罕见基因突变的正、反向引物、内参引物和测序引物；结合Sanger测序技术，快速准确地检测地中海贫血罕见基因突变，有利于明确患者基因型，在地中海贫血高发区有助于降低罕见致病突变的漏检率和减少重症患儿的出生。
Description
技术领域
本发明属基因检测技术领域，特别涉及检测地中海贫血基因罕见突变的试剂、方法和试剂盒，采用普通PCR结合Sanger测序技术，对α及β地中海贫血中的罕见型基因突变进行检测。
背景技术
地中海贫血(简称地贫)是由于遗传基因缺失或突变所致的慢性溶血性贫血，一般可以分为α与β地贫两大类，是人类最常见的遗传病之一，广泛流行于地中海流域、中东、东南亚和非洲。我国的广西、广东、海南、贵州、云南、四川等省是地贫高发区。α地贫是由编码α珠蛋白链的基因突变导致的地贫，分为缺失型和非缺失型(主要是点突变)两类，编码α珠蛋白链的基因位于16号染色体短臂末端(16p 13.3-pter)的α珠蛋白基因簇中。目前全球至少发现35种缺失型和50多种非缺失型α地贫。β地贫是由于β珠蛋白基因突变导致β珠蛋白链合成不足(β+)或缺失(β0)而引起的遗传性溶血性血红蛋白病，编码β珠蛋白基因位于11号染色体11p15.5上的β珠蛋白基因簇中。目前全球己报道了至少200多种基因突变类型，其中占绝大多数的点突变就占190多种，缺失型有17种。
全球大约有5％的人口为地贫基因突变的携带者，目前主流的地贫基因突变检测试剂盒的范围已能覆盖中国南方人群α、β地贫基因突变的主要类型。然而，地贫的分子基础复杂、突变类型繁多，在研究及临床工作中罕见及未知类型时有发现。地贫的预防和控制已成为我国卫生系统的重点工作。目前的常规地中海贫血检测试剂盒往往会造成罕见突变的漏检,因此在临床检验中,应严格遵循血液学表型与基因型相结合的原则,当血液学表型与地中海贫血基因型不相符合时,应该考虑珠蛋白基因测序的方法,以明确是否存在罕见或新发的地中海贫血突变类型,避免漏诊。虽然罕见地贫基因型在人群中所占的比例不高，但开展罕见地贫突变的检测研究仍然很有必要。
目前国内外β地贫分子诊断方法主要有等位基因特异性寡核苷酸探针点杂交(PCR-ASO)、反向点杂交(RDB)、导流杂交和二代测序等。PCR-ASO技术操作繁琐，通量低和结果准确性受人为影响大，RDB技术操作繁琐，通量低、费用较高以及结果准确性受人为影响大；导流杂交技术不能做到基因位点的准确分型；Sanger测序方法成熟可靠，可检出样本中所有已知的突变和未知类型突变，因此，本发明采用PCR扩增结合Sanger测序方法对α与β地中海贫血中的罕见基因突变进行检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测地中海贫血基因罕见突变的试剂和检测方法，采用普通PCR结合Sanger测序技术，可快速准确的检测患者体内海贫血基因罕见突变，为地中海贫血的诊断及遗传咨询提供参考。
为了实现上述发明目的，本发明提供了检测地中海贫血基因罕见突变的试剂，所述试剂包括(1)～(3)中的至少一种：
(1)针对α地中海贫血相关基因HBA1和HBA2全序列的第一对引物；
(2)针对β地中海贫血相关基因HBB第1、2外显子和部分内含子的第二对引物；
(3)针对β地中海贫血相关基因HBB第3外显子和部分内含子的第三对引物；其中，所述第一对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述第二对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
所述第三对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
进一步地，还包括测序引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
进一步地，还包括(4)检测内参基因actin的引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
进一步地，(1)、(2)或(3)中的一对引物浓度均为0.125uM。
进一步地，所述内参基因的引物的使用浓度比为1:1。
本发明还提供一种检测地中海贫血罕见基因突变的方法，包括以下步骤：1)抽提待测基因组DNA；2)将所述待测基因组DNA与试剂混合，进行PCR；3)利用一对测序引物对(2)中的扩增产物进行测序；4)将(3)中的测序结果与野生型HBA1、HBA2和HBB基因序列进行比较，检测待测基因组DNA是否有罕见基因突变，其中，所述试剂包括(1)～(3)中的至少一种：
(1)针对α地中海贫血相关基因HBA1和HBA2全序列的第一对引物；
(2)针对β地中海贫血相关基因HBB第1、2外显子和部分内含子的第二对引物；
(3)针对β地中海贫血相关基因HBB第3外显子和部分内含子的第三对引物；其中，所述第一对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；所述第二对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
所述第三对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
进一步地，扩增体系内模板DNA浓度最低为0.025ng/uL。
本发明还提供一种检测地中海贫血罕见基因突变的试剂盒，所述试剂盒含有试剂，所述试剂包括(1)～(3)中的至少一种：
(1)针对α地中海贫血相关基因HBA1和HBA2全序列的第一对引物；
(2)针对β地中海贫血相关基因HBB第1、2外显子和部分内含子的第二对引物；
(3)针对β地中海贫血相关基因HBB第3外显子和部分内含子的第三对引物；
其中，所述第一对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
所述第二对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
所述第三对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
进一步地，还包括测序引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。
进一步地，还包括(4)检测内参基因actin的引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
本发明的有益效果为：编码α珠蛋白链的基因有两个拷贝，两个拷贝有部分碱基序列不同，本发明通过引物设计用1对引物同时对α珠蛋白链的两个编码基因进行扩增，既节省了成本，又简化了操作，加快检测时间。本发明采用PCR技术，通过调整引物浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，构建了稳定的扩增体系。本发明公开的检测地中海贫血基因罕见突变的试剂和方法，同时具有成熟简便、检测敏感性高、特异性好等优点。与反向点杂交法(RDB)相比，本发明具有更高的灵敏度和特异性，操作简便；和下一代测序法(NGS)相比，具有更简便的操作过程，无需后期生物信息数据处理，简单比对给出结论。
附图说明
图1为样本验证的琼脂糖凝胶电泳图，M为Marker DL 2000，1～7为未知突变类型的地中海贫血样本DNA，用本发明引物扩增出目的条带，且目的条带清晰，产物大小正确。
图2为用本项目方法检测一例地中海贫血病例的HBB基因上IVS-2-666(C>T)杂合突变测序比对截图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。具体实施例仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
值得注意的是，本发明中，术语“第一”、“第二”等仅用于区分目的，而不能理解为各个试剂的相对重要性或者数量等技术特征，其只是为了说明清楚而加的定语。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
一种检测地中海贫血基因罕见突变的试剂，所述试剂包括：
针对HBA1和HBA2全基因序列的第一对引物；
针对HBB第1、2外显子和部分内含子的第二对引物；
针对HBB第3外显子和部分内含子的第三对引物；
其中，所述第一对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
所述第二对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
所述第三对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；
其中，还包括测序引物，核苷酸序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；
相应地，还包括检测内参基因actin的引物，核苷酸序列为SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10。
一种地中海贫血基因罕见突变的检测方法，包括以下步骤：
(1)抽提待测基因组DNA；
(2)将所述待测基因组DNA与试剂混合，进行PCR，所述试剂包括第一对引物、第二对引物和第三对引物；
(3)利用测序引物SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8对(2)中的扩增产物进行测序；
(4)将(3)中的测序结果与野生型HBA1、HBA2和HBB基因序列进行比较，可检测出待测基因组DNA是否有基因罕见突变；
其中，本发明涉及的引物对序列如表1所示。
表1.引物序列
为了使本发明上述方法更加清楚并易于理解，以下通过实施例进行举例说明：
实施例1
血液/细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒(天根生物)的操作流程：
(1)抽提血液中的组织DNA：1)抽取300μl血液加入900μl红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。12，000rpm离心1min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200μl缓冲液GA，振荡至彻底混匀；2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀；3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12，000rpm离心30秒，倒掉废液；9)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：
X＝18μl反应液×(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
(3)加样：加入检测体系PCR反应液中1μl DNA；阳性对照和阴性对照直接加1μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加1μl生理盐水或不加任何物质。
阳性对照品：含有正常人HBA及HBB基因序列的核酸溶液
阴性对照品：不含有HBA及HBB基因序列的核酸溶液
(4)扩增：检测在常规PCR仪上进行，可用仪器包括ABI veriti(美国AppliedBiosystems公司)等。反应条件如下：
PCR扩增体系试剂配制方法如下，引物序列见表1：
(5)电泳：1.5％琼脂糖凝胶电泳，120V，30min，凝胶成像系统观察。
如图1所示，即为12例血液样本DNA以本引物扩增后所得产物的电泳图谱。电泳图的表明本发明所述扩增有效，且条带清晰。
(6)Sanger测序：
取9μl PCR产物与2μl纯化体系。按照以下程序进行纯化：
将1μl纯化产物分别与上、下测序引物按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15μl无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl CBL后进行变性5min，最后-20℃2min上测序仪(ABI3730)测序。
(7)结果判断：分别将测序结果与野生型HBA1、HBA2和HBB参考序列进行比对，根据实际情况对结果进行报告。
实施例2
取7例临床诊断为地贫的外周血样本，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。每份样本加入检测体系PCR反应液中1μl。同时做阳性，阴性，空白对照各一份。用普通PCR仪检测，时间为100分钟。
琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳图如图1所示，所有样本都有目的条带，经测序比对，测序比对结果如图2所示，用Mutation Surveyor V4.0.8(demo)对测序结果进行分析，7个样本的HBA基因均未检测到突变，全部7个样本的HBB基因上均检测到IVS-2-666(C>T)杂合突变，有2个样本的HBB基因上检测到IVS-2-654(C>T)杂合突变，有1个的样本的HBB基因上存在CD17(AAG>TAG)纯合突变，有1个的样本的HBB基因上存在CD2(CAT>CAC)突变和IVS-2-16(G>C)突变。
从检测结果可以看出，本发明的引物和方法，可简便迅速的检测地中海贫血基因罕见突变，可用于地中海贫血的诊断及遗传咨询。
序列表
<110> 福州艾迪康医学检验实验室有限公司
<120> 检测地中海贫血基因罕见突变的试剂、方法和试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtaaaacga cggccagtct cttctggtcc ccacagactc 40
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aacagctatg accatggtat ttggaggtca gcacggt 37
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgtaaaacga cggccagtca actcctaagc cagtgccag 39
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aacagctatg accatgggga aagaaaacat caagcgtc 38
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtaaaacga cggccagtac tttccctaat ctctttcttt cagg 44
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacagctatg accatgtgac ctcccacatt ccctttt 37
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtaaaacga cggccagt 18
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aacagctatg accatg 16
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctaactgcgc gtgcgttct 19
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agtccttagg ccgccagggg 20
Claims (10)
1.用于检测地中海贫血基因罕见突变的试剂，其特征在于，所述试剂包括(1)～(3)中的至少一种：
(1)针对α地中海贫血相关基因HBA1和HBA2全序列的第一对引物；
(2)针对β地中海贫血相关基因HBB第1、2外显子和部分内含子的第二对引物；
(3)针对β地中海贫血相关基因HBB第3外显子和部分内含子的第三对引物；
其中，所述第一对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
所述第二对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
所述第三对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
2.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包括测序引物，其核苷酸序列为SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8。
3.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，还包括(4)检测内参基因actin的引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
4.如权利要求1所述的试剂，其特征在于，(1)、(2)或(3)中的一对引物浓度均为0.125uM。
5.如权利要求3所述的试剂，其特征在于，所述内参基因的引物的使用浓度比为1:1。
6.一种检测地中海贫血罕见基因突变的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)抽提待测基因组DNA；
(2)将所述待测基因组DNA与权利要求1-5之一所述的试剂混合，进行PCR；
(3)利用权利要求2所述的测序引物对(2)中的扩增产物进行测序；
(4)将(3)中的测序结果与野生型HBA1、HBA2和HBB基因序列进行比较，检测待测基因组DNA是否有罕见基因突变。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，扩增体系内模板DNA浓度最低为0.025ng/uL。
8.一种检测地中海贫血罕见基因突变的试剂盒，所述试剂盒含有试剂，其特征在于，所述试剂包括(1)～(3)中的至少一种：
(1)针对α地中海贫血相关基因HBA1和HBA2全序列的第一对引物；
(2)针对β地中海贫血相关基因HBB第1、2外显子和部分内含子的第二对引物；
(3)针对β地中海贫血相关基因HBB第3外显子和部分内含子的第三对引物；
其中，所述第一对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；
所述第二对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；
所述第三对引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括测序引物，其核苷酸序列为SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括(4)检测内参基因actin的引物，其核苷酸序列为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。
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-
2022
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