CN117467760A - 一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒。本发明针对地中海贫血症常见突变位点的序列，设计基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型的扩增引物和延伸引物，并建立了检测方法。与现有产品相比，本发明的引物组能够较为全面地覆盖了常见的地中海贫血相关基因热点突变及缺失，检出率更高，也更为准确。同时，该引物组能够通过单管反应同时检测地中海贫血症珠蛋白基因α和β的相关突变，具有高准确性、高灵敏度、高通量的特点，既可应用于临床诊断，也可以应用于地中海贫血携带者筛查。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体地，涉及一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒。
背景技术
地中海贫血是一组以一个或多个血红蛋白（Hb）链合成缺陷为特征的异质性遗传病，这会导致不稳定的非地中海血型Hb链的积累，从而沉淀并导致外周血中红系前体细胞的髓内破坏和红细胞的过早溶解。地中海贫血主要可分为：α-地中海贫血，α珠蛋白亚基生成缺失或减少；β-地中海贫血，β珠蛋白链产生缺失或减少；δβ-地中海贫血，δ珠蛋白和β珠蛋白亚基的产生减少或不存在。
正常人类受试者有两对α珠蛋白基因和一个αα/αα基因型。与之相反，在α-地中海贫血中，受影响的染色体可能会缺失一个或两个基因。总体而言，2种主要的原因会导致α-地中海贫血：
（1）单个α珠蛋白基因缺失，定义为α+-地中海贫血。常见的两种α+-地中海贫血是-α3.7型和-α4.2型，导致α链产生减少。一个（-α/αα）或两个（--/αα，-α/-α）α珠蛋白等位基因的缺失都会导致无症状的α-地中海贫血，这些疾病的特征是α和非α珠蛋白链合成之间的不平衡，导致红细胞参数的轻度至中度变化。
（2）一条染色体上的α珠蛋白基因簇（包括两个α等位基因）全部或部分缺失会导致α0-地中海贫血。α样珠蛋白基因（即HBZ（ζ-珠蛋白）、HBA2（α2-珠蛋白）和HBA1（α1-珠蛋白））失活导致过多的β-珠蛋白链产生，在出生后形成β4四聚体（HBH）。从遗传学的角度来看，这些个体是由α+和α0突变的复合杂合性（--/-α）所致。HBH变异体极不稳定，通常在红细胞内沉淀，导致HBH病。4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，因而含有α链的HBA、HBA2和HBF的合成均减少，这种α0-地中海贫血的纯合子状态引起的疾病称为HbBarts胎儿水肿综合征，受累胎儿会有严重的缺血缺氧，全身水肿，多数胎死腹中或于分娩后半小时死亡。
根据突变和缺失的大小和/或位置，β-地中海贫血可分为以下几种：β0-地中海贫血、δβ-地中海贫血、遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症（HPFH）、γδβ-地中海贫血和εγδβ-地中海贫血。绝大多数β-地中海贫血是由β-珠蛋白基因点突变或其相邻侧翼区域引起的，β-珠蛋白基因上游的部分缺失相对较少。
β肽链基因上不同位点突变会导致β肽链合成量不同，将那些突变使得β肽链减少但并非完全缺失的定义为β+，若突变导致β肽链完全不合成，则定义为β0。其中，若有一个正常β基因，无论突变的基因是β0还是β+，一般为轻型β-地中海贫血，血常规和血红蛋白有异常，但对于携带者的生活影响较少。在杂合子β基因突变中，地中海贫血中CD53这个突变由于发生了移码突变，使得红细胞非常不稳定，其杂合子患者可导致中间型地中海贫血，其对于患者生活有一定影响。而纯合子突变，即两个β基因都有突变的地中海贫血患者多半为中间型或者重型地中海贫血。中间型β-地中海贫血患者由于基因突变类型不同，其贫血程度也有所不同。
当夫妇双方均为同一类型（α-或β-）地中海贫血基因携带者时，其后代有四分之一的机会罹患重型α-或β-地中海贫血。通过地中海贫血筛查和诊断，防止重型地贫患儿的出生是必要的措施。通过血常规、血红蛋白电泳分析以及基因诊断来筛查孕育夫妇生育重型地贫患儿的可能性，最后通过对胎儿进行产前诊断，确认为重型地贫患儿则终止妊娠。
目前，临床上常用亚能生物技术（深圳）有限公司以及达安基因提供Gap-PCR法联合PCR-反向点杂交法检测α-地中海贫血，该方法在α-地中海贫血的分子筛查和临床诊断中发挥了很大的作用，但该方法在对PCR扩增产物分析时容易造成DNA交叉污染，而且操作繁琐不适用于大规模检测。近年来，具有高通量、高集成、微型化、连续化和自动化等特点的微阵列芯片法被应用于α-地中海贫血检测。博奥生物集团有限公司的微阵列芯片法在α-地中海贫血检测中可同时检测缺失型和非缺失型，减少了实验步骤，提高了工作效率，同时可实现连续化和自动化，能满足大规模检测需求。但是，微阵列芯片法容易造成漏检，不能检出泰国型缺失，而泰国型缺失复合东南亚型缺失的双杂合子表型为典型的巴氏水肿胎，因此泰国型缺失的检出意义尤为重要，上述问题使得该检测方法存在比较明显的不足之处；另外，该方法对设备要求较高，试剂成本也较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是现有技术中存在的上述缺陷与不足，提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒。
本发明的第一个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物。
本发明的第二个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的延伸引物。
本发明的第三个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的组合物。
本发明的第四个目的是提供上述的扩增引物、延伸引物和/或组合物在制备用于地中海贫血症检测和/或基因分型的产品中的应用。
本发明的第五个目的是提供一种用于地中海贫血症基因分型的试剂盒。
本发明的第六个目的是提供一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的反应体系。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明针对地中海贫血症常见突变位点的序列设计基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物和延伸引物，并建立了检测方法：提取全血基因组DNA后，通过多重PCR反应、SAP反应和单碱基延伸（UEP）反应得到反应产物，采用飞行时间质谱仪进行分析。检测结果用Typer 4.0软件自动分析，并将各位点峰面积导出至Excel文件。根据延伸引物及引物延伸后分子量大小所对应的质谱峰图，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：当检测范围内位点的野生型及突变型中至少一个峰的峰高≥1时，SNR≥3时，则认为结果可靠，可进行下一步判定：根据突变型峰值∕野生型峰值进行判定，如果峰高比＞3则判定为纯合突变（野生型峰值为0时，其峰高比接近无穷大，也符合该判定），如果0.5≤峰高比≤3，则判读为杂合突变，其他情况（也就是如果＜0.5），则判读为野生型。
因此，本发明要求保护以下内容：
一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示。
一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的延伸引物，所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示。
一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的组合物，所述组合物包含上述的扩增引物和延伸引物。
优选地，所述组合物能够实现在多重PCR和单碱基延伸反应中，在同一反应体系（单管反应）中对地中海贫血症的相关基因突变进行扩增和单碱基延伸反应，较为全面地覆盖常见的基因突变位点，且具有较高的灵敏度和准确性。
单管反应能够极大地提高检测效率，但若有需要，本发明的上述引物组也能够进行分管反应。
优选地，上述组合物覆盖的突变包括：α-地贫的4种常见缺失（--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAI）和3种点突变型（-αCS、-αQS、-αWS）及β-地贫的23种致病性变异位点：-28 (A>G)、-29 (A>G)、-30 (T>C)、-32 (C>A)、-50 (G>A)、-73 (A>T)、-90 (C>T)、CAP +1 (A>C)、CAP 41-44(-AACA)、CD 113 GTG>GAG、CD 26 (GAG>AAG)、CD 27/28 (+C)、CD 30 (A>G)、CD 31 (-C)、CD 71/72 (+A)、CD 8/9 (+G)、Init CD (ATG>AGG)、IVS I-1 (G>T/A)、IVS I-5 (G>C)、IVSII-2 (-T)、IVS II-654 (C>T)、IVS II-705 (T>G)、IVS II-806 (G>C)。
上述的扩增引物、延伸引物和/或组合物在制备用于地中海贫血症检测和/或基因分型的产品中的应用。
一种用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，所述试剂盒包含上述的扩增引物和/或上述的延伸引物。
优选地，所述试剂盒还包含多重PCR检测试剂、SAP反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或几种。
更优选地，多重PCR反应试剂包括PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTPs、DNA聚合酶、水中的一种或几种；
SAP反应试剂包括SAP反应缓冲液、SAP酶、水中的一种或几种；
单碱基延伸反应试剂包括单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸反应酶、水中的一种或几种；
上述各反应试剂中的一种或多种可以预混液形式提供。
更优选地，所述试剂盒含有扩增引物混合物，所述扩增引物混合物由核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示的引物混合而成，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示的引物的浓度依次为：1.5 μM、1.5 μM、1 μM、1 μM、2 μM、2μM、2 μM、2μM、1 μM、1 μM。
更优选地，所述试剂盒含有延伸引物混合物，所述延伸引物混合物由核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示的引物混合而成，核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示的引物的浓度依次为：792/145 μM、711/145 μM、774/145 μM、684/145 μM、783/145 μM、1035/145 μM、927/145 μM、936/145 μM、846/145 μM、1071/145 μM、1107/145 μM、990/145 μM、1053/145 μM、603/145 μM、1044/145 μM、873/145 μM、999/145 μM、540/145 μM、846/145 μM、999/145 μM、1044/145 μM、864/145 μM、954/145 μM、999/145 μM、819/145 μM、648/145 μM、558/145 μM、1179/145 μM、1368/145 μM、1467/145 μM。
优选地，上述的试剂盒基于飞行时间质谱法对地中海贫血症进行基因分型，所述基因分型包括以下步骤：
S1. 以待测样本的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示的扩增引物进行多重PCR扩增，得到PCR反应产物；
S2. 将所述PCR反应产物与SAP反应试剂混合进行SAP反应得到SAP反应产物；
S3. 将所述SAP反应产物、单碱基延伸反应试剂以及核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示的延伸引物混合，进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物；
S4. 对所述单碱基延伸反应产物进行飞行时间质谱检测。
优选地，在多重PCR扩增反应体系中，待测样本的基因组DNA的添加量为5～100ng。
优选地，所述多重PCR反应的反应条件为95℃ 3min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃30 s，45个循环；72℃ 5min。
优选地，所述单碱基延伸反应的反应条件为94℃ 30 s；以下程序40个循环：95℃5 s，1个循环，52℃ 5 s、80℃ 5s，5个循环；72℃ 3min。
优选地，结果判断方法如下：根据延伸引物及引物延伸后分子量大小所对应的质谱峰图，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：当检测范围内位点的野生型及突变型中至少一个峰的峰高≥1时，SNR≥3时，则认为结果可靠，可进行下一步判定：根据突变型峰值∕野生型峰值进行判定，如果峰高比＞3则判定为纯合突变（野生型峰值为0时，其峰高比接近无穷大，也符合该判定），如果0.5≤峰高比≤3，则判读为杂合突变，其它情况（也就是如果＜0.5），则判读为野生型。
一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的反应体系，所述反应体系包含扩增体系和延伸体系；
所述扩增体系中含有上述的扩增引物，所述延伸体系中含有上述的延伸引物。
优选地，所述扩增体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物的浓度为0.1～0.2 μM；
所述延伸体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示的各条延伸引物的浓度为0.6～1.63 μM。
更优选地，所述扩增体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.1μM、0.1 μM；
所述延伸体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示的各条延伸引物的终浓度依次为：0.88 μM、0.79 μM、0.86 μM、0.76 μM、0.87 μM、1.15 μM、1.03 μM、1.04 μM、0.94 μM、1.19 μM、1.23 μM、1.10 μM、1.17 μM、0.67 μM、1.16 μM、0.97 μM、1.11 μM、0.6 μM、0.94μM、1.11 μM、1.16 μM、0.96 μM、1.06 μM、1.11 μM、0.91 μM、0.72 μM、0.62 μM、1.31 μM、1.52 μM、1.63 μM。
更优选地，所述反应体系还包含多重PCR检测试剂、SAP反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或几种。
优选地，上述的反应体系基于飞行时间质谱法对地中海贫血症进行基因分型，所述基因分型包括以下步骤：
S1. 以待测样本的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示的扩增引物进行多重PCR扩增，得到PCR反应产物；
S2. 将所述PCR反应产物与SAP反应试剂混合进行SAP反应得到SAP反应产物；
S3. 将所述SAP反应产物、单碱基延伸反应试剂以及核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示的延伸引物混合，进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物；
S4. 对所述单碱基延伸反应产物进行飞行时间质谱检测。
更优选地，在多重PCR扩增反应体系中，待测样本的基因组DNA的添加量为5～100ng。
更优选地，所述多重PCR反应的反应条件为95℃ 3min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，45个循环；72℃ 5min。
优选地，所述单碱基延伸反应的反应条件为94℃ 30 s；以下程序40个循环：95℃5 s，1个循环，52℃ 5 s、80℃ 5s，5个循环；72℃ 3min。
优选地，结果判断方法如下：根据延伸引物及引物延伸后分子量大小所对应的质谱峰图，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：当检测范围内30个位点的野生型及突变型中至少一个峰的峰高≥1时，SNR≥3时，则认为结果可靠，可进行下一步判定：根据突变型峰值∕野生型峰值进行判定，如果峰高比＞3则判定为纯合突变（野生型峰值为0时，其峰高比接近无穷大，也符合该判定），如果0.5≤峰高比≤3，则判读为杂合突变，其它情况（也就是如果＜0.5），则判读为野生型。
优选地，在多重PCR扩增反应体系中，待测样本的基因组DNA的添加量为5～100ng。
优选地，所述多重PCR反应的反应条件为95℃ 3min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃30 s，45个循环；72℃ 5min。
优选地，所述单碱基延伸反应的反应条件为94℃ 30 s；以下程序40个循环：95℃5 s，1个循环，52℃ 5 s、80℃ 5s，5个循环；72℃ 3min。
上述用于地中海贫血症基因分型的组合物、所述用于地中海贫血症基因分型的试剂盒和所述用于地中海贫血症基因分型的反应体系在检测地中海贫血症相关基因的基因型中的应用。
以上所述的应用为非疾病诊断和治疗目的的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明公开了一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的引物组和试剂盒。本发明提供的引物组较为全面地覆盖了常见的地中海贫血相关基因热点突变及缺失，与其他产品相比，增加对泰国型地中海贫血的检测，使得产品覆盖更广泛的地中海贫血类型，检出率更高，也更为准确。
本发明的引物组能够通过单管反应同时检测地中海贫血症珠蛋白基因α和β的相关突变，确定珠蛋白基因α和β的峰高和SNR值，同时检测中国人群地贫常见的、包括泰国型在内的30个热点突变，具有高准确性、高灵敏度、高通量的特点，适于推广和应用。
本发明的引物组和试剂盒利用飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症进行基因分型，操作简单、检测成本低、检测结果稳定可靠、通量高，适用于进行临床大规模人群筛查，适用对象包括疑似地中海贫血症的患者，确诊地中海贫血症的患者，或有地中海贫血症家族病史等高危人群，可以对正常人、携带者和患者进行准确的基因分型筛查，用于地中海贫血症患者的辅助临床诊断和携带者、新生儿的筛查，既可应用于临床诊断，也可以应用于地中海贫血携带者筛查以及地贫的一二三级预防。
与现有产品相比，本发明的引物组和试剂盒至少具有以下优势：
（1）高精准度、低复查率：本发明的引物组能够实现在同一反应体系中高效地进行目标片段的扩增和突变的延伸反应，配合MassARRAY DNA飞行质谱分析系统进行基因分型，可高灵敏度和高精确度地快速分析待测样本的突变类型。本发明的引物组和方法在测定下限（2.5 ng/μl）时的检测结果与已知基因型结果符合率为100%。
（2）应用范围广：本发明的检测试剂盒可同时对地中海贫血所涉及的缺失以及常见的热点突变进行检测，并且较其他产品增加了对泰国型地贫的检测，检测覆盖范围广，既可应用于开展地中海贫血的一级、二级、三级预防，也可辅助于临床诊断，得到更精准的诊断结果。
（3）检测通量高：根据目前的MassARRAY DNA飞行质谱分析系统机型，最多每次可以处理384×2个样本，每天可以处理6～8块芯片，高通量（3000～5000人份/天），能够满足大样本量筛查的应用需求。
附图说明
图1为实施例4中基因型为αα/αα，β/β的样本基因位点的飞行时间质谱图，A：样本中HBA2检测位点的检测结果，B：样本中Y2Y1检测位点的检测结果。
图2为实施例4中基因型为--SEA/αα，β/β的样本基因位点的飞行时间质谱图，A：样本中HBA2检测位点的检测结果，B：样本中Y2Y1检测位点的检测结果，C：样本中SEA检测位点的检测结果。
图3为实施例4中基因型为-α3.7/αα，β/β的样本基因位点的飞行时间质谱图，A：样本中HBA2检测位点的检测结果，B：样本中Y2Y1检测位点的检测结果。
图4为实施例4中基因型为-α4.2/αα，β/β的样本基因位点的飞行时间质谱图，A：样本中HBA2检测位点的检测结果，B：样本中Y2Y1检测位点的检测结果。
图5为实施例4中基因型为-α3.7/-α3.7，β/β的样本基因位点的飞行时间质谱图，A：样本中HBA2检测位点的检测结果，B：样本中Y2Y1检测位点的检测结果。
图6为实施例4中基因型为--THAI/αα，β/β的样本基因位点的飞行时间质谱图，A：样本中HBA2检测位点的检测结果，B：样本中Y2Y1检测位点的检测结果，C：样本中THAI检测位点的检测结果。
图7为实施例4中基因型为-α3.7/-α4.2，β/β的样本基因位点的飞行时间质谱图，A：样本中HBA2检测位点的检测结果，B：样本中Y2Y1检测位点的检测结果。
图8为实施例4中的样本基因型为αα/αα，β-29(A>G)/β的样本基因位点的飞行时间质谱图，A：样本中HBA2检测位点的检测结果，B：样本中Y2Y1检测位点的检测结果，C：样本中-29(A>G)检测位点的检测结果。
图9为实施例4中基因型为αα/αα，β-28(A>G)/β的样本基因位点的飞行时间质谱图，A：样本中HBA2检测位点的检测结果，B：样本中Y2Y1检测位点的检测结果，C：样本中-28(A>G)检测位点的检测结果。
图10为实施例4中基因型为αα/αα，βIVS II-654 (C>T)/β的样本基因位点的飞行时间质谱图，A：样本中HBA2检测位点的检测结果，B：样本中Y2Y1检测位点的检测结果，C：样本中IVS II-654 (C>T)检测位点的检测结果。
图11为退火温度对多重PCR反应产物的影响，其中泳道1～7依次为退火温度为52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃和64℃时多重PCR反应产物的凝胶电泳结果。
图12为多重PCR反应中退火温度为58℃、60℃、62℃、64℃的质谱结果。
图13为扩增引物浓度对多重PCR反应产物的影响，其中泳道1～7依次为为使用对比例2中第①～⑦组扩增引物混合物进行多重PCR反应得到的产物的凝胶电泳结果。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 基于飞行时间质谱法结合拷贝数的地中海贫血症基因分型的扩增引物
通过NCBI、Snapgene以及文献查阅寻找常见突变位点的序列，并根据这些序列设计基于飞行时间质谱法结合拷贝数的地中海贫血症基因分型的扩增引物。表1为5对扩增引物，其中含针对α突变的4对引物和1对针对β基因簇的引物（SEQ ID NO.9～10），4对引物中有2对引物为大片段缺失的扩增引物（SEQ ID NO.1～4），1对定量检测α珠蛋白基因簇拷贝数变化的引物（SEQ ID NO.5～6）以及1对涵盖三个点突变类型的扩增引物（SEQ ID NO.7～8）。
表1 引物序列
实施例2 基于飞行时间质谱法结合拷贝数的地中海贫血症基因分型的延伸引物
通过NCBI、Snapgene以及文献查阅寻找常见突变位点的序列，并根据这些序列设计基于飞行时间质谱法结合拷贝数的地中海贫血症基因分型的延伸引物。延伸引物涵盖30个变异位点，共30条延伸引物（SEQ ID NO.11～40）（表2）。对于定量检测α珠蛋白基因簇拷贝数变化，选择-α3.7和-α4.2相同区段Y2、Y1设计定量分析引物。各突变位点延伸引物、野生型和突变型对应分子量（Mw）如表3所示。
表2 引物序列
表3 各突变位点延伸引物、野生型和突变型对应分子量表
实施例3 基于飞行时间质谱法结合拷贝数的地中海贫血症基因突变位点的检测方法
一、DNA样本提取
DNA样本通过抽取人的外周血得到，使用凯普核酸提取试剂盒磁珠法DR-4801-KZ型提取全血基因组DNA，再使用凯普自动提取仪4801完成提取实验。
二、多重PCR反应
多重PCR反应试剂包括超纯水、PCR Buffer缓冲液、25 mM MgCl2、25 mM dNTPs、扩增引物混合物、DNA聚合酶。
其中，扩增引物混合物由表1中所示的各条扩增引物（SEQ ID NO.1～10）混合得到，针对各突变位点的每条扩增引物的原始浓度为100 µmol/L，序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物在扩增引物混合物中的浓度依次为：1.5 μM、1.5 μM、1 μM、1 μM、2 μM、2μM、2 μM、2μM、1 μM、1 μM。
多重PCR反应体系设置如表4所示，DNA样本的添加量以5 ng及以上为适宜。在多重PCR反应体系中，序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.1 μM、0.1 μM。
表4 多重PCR反应体系
多重PCR反应程序设置如表5所示。
表5 多重PCR反应程序
三、SAP反应
SAP反应试剂包括：超纯水、SAP缓冲液、SAP酶。
添加2 μL SAP混合液到上述多重PCR反应产物中，总体积：7 μL。
SAP混合液组成如表6所示。
表6 SAP混合液
SAP反应程序设置如表7所示。
表7 SAP反应程序
四、单碱基延伸反应
单碱基延伸反应试剂包括：超纯水、延伸缓冲液、延伸终止液、延伸引物混合物、Extend酶。
单碱基延伸反应液的组成如表8所示。其中，延伸引物混合物由表2中所示的各条延伸引物（SEQ ID NO.11～40）混合得到，每条单碱基延伸引物的原始浓度为500 µmol/L，序列如SEQ ID NO.11～40所示的各条延伸引物在延伸引物混合物中的浓度依次为：792/145 μM、711/145 μM、774/145 μM、684/145 μM、783/145 μM、1035/145 μM、927/145 μM、936/145 μM、846/145 μM、1071/145 μM、1107/145 μM、990/145 μM、1053/145 μM、603/145μM、1044/145 μM、873/145 μM、999/145 μM、540/145 μM、846/145 μM、999/145 μM、1044/145 μM、864/145 μM、954/145 μM、999/145 μM、819/145 μM、648/145 μM、558/145 μM、1179/145 μM、1368/145 μM、1467/145 μM。
向上一步的SAP反应产物中加入2 μL单碱基延伸反应液，总体积9 μL。在单碱基延伸反应体系中，序列如SEQ ID NO.11～40所示的各条延伸引物的终浓度依次为：0.88 μM、0.79 μM、0.86 μM、0.76 μM、0.87 μM、1.15 μM、1.03 μM、1.04 μM、0.94 μM、1.19 μM、1.23μM、1.10 μM、1.17 μM、0.67 μM、1.16 μM、0.97 μM、1.11 μM、0.6 μM、0.94 μM、1.11 μM、1.16 μM、0.96 μM、1.06 μM、1.11 μM、0.91 μM、0.72 μM、0.62 μM、1.31 μM、1.52 μM、1.63μM。
表8 单碱基延伸反应液
单碱基延伸反应程序设置如表9所示。
表9 单碱基延伸反应程序
反应结束后，2000 rpm瞬时离心，每孔加入16 μL的灭菌双蒸水（此时每孔内的总体积为25 μL），更换新膜将384孔板封住，震荡混匀后，离心。
五、质谱检测
将上一步的单碱基延伸反应产物采用飞行时间质谱仪进行分析，导入Assay和对应的384板的样本编号，连接芯片。将384孔板与芯片放置在质谱仪相应的位置，然后按开始键，直到全部完成。检测结果用Typer 4.0软件自动分析，并将各位点峰面积导出至Excel文件。
六、结果判读
根据延伸引物及引物延伸后分子量大小所对应的质谱峰图，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：当检测范围内30个位点的野生型及突变型中至少一个峰的峰高≥1时，SNR≥3时，则认为结果可靠，可进行下一步判定：根据突变型峰值∕野生型峰值进行判定，如果峰高比＞3则判定为纯合突变（野生型峰值为0时，其峰高比接近无穷大，也符合该判定），如果0.5≤峰高比≤3，则判读为杂合突变，其他情况（也就是如果＜0.5），则判读为野生型。常见α-地贫缺失基因型Y2、Y1相对拷贝数及具体基因型判读见表10。
表10 常见α-地贫缺失基因型Y2、Y1相对拷贝数及具体基因型
实施例4 引物组的性能测试
一、引物组的特异性、测定下限能力评价
使用临床样本对实施例1和实施例2的引物和实施例3的分型方法的特异性、测定下限能力进行评价，具体方法和结果如下：
1. 特异性评价
（1）实验方法
取阴性样本、阳性样本若干份进行检测，检测方法依照实施例3进行，其中阳性样本为由凯普生物技术支持中心提供的确诊基因型样本。样本的基因型详见表11。
表11 样本基因型
将所有检测结果按表12归总后得到表13和表14，计算符合率。实验结果与预期结果的符合率为100%即为通过。
表12 方法符合率
阳性符合率=a/(a+c)×100%；
阴性符合率=d/(b+d)×100%；
总符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%。
（2）实验结果
图1～10为表11中已知基因型样本的飞行时间质谱图，横坐标为分子量，纵坐标为丰度（代表拷贝数）。已知基因型样本结果如表13所示。
表13 已知基因型样本检测结果
经计算，阳性符合率为100%，阴性符合率为100%，总符合率为100%，表明利用本发明的引物组和基因分型方法得到的检测结果与已知基因型结果符合率为100%，本发明的基因分型引物组和方法具有较高的特异性。
表14 方法符合率
2. 测定下限验证
（1）实验方法
选取上述特异性评价中所用到的α、β地中海贫血基因样本，分别稀释至每个型别的浓度为2.5 ng/μl，验证在测定下限浓度是否能检出阳性结果。测定下限实验结果与预期结果的符合率为100%即为通过。
（2）实验结果
测定下限结果如表15所示。结果表明，本发明的基因分型引物组和方法在测定下限（2.5 ng/μl）时的检测结果与已知基因型结果符合率为100%。
表15 测定下限结果
实施例5 一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数的地中海贫血症基因突变位点的检测试剂盒
一、组成
扩增引物混合物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示的基于飞行时间质谱法结合拷贝数的地中海贫血症基因分型的扩增引物混合而成，浓度依次为：1.5 μM、1.5 μM、1 μM、1 μM、2 μM、2μM、2 μM、2μM、1 μM、1 μM。
延伸引物混合物：核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示的基于飞行时间质谱法结合拷贝数的地中海贫血症基因分型的延伸引物混合而成，浓度依次为：792/145 μM、711/145 μM、774/145 μM、684/145 μM、783/145 μM、1035/145 μM、927/145 μM、936/145 μM、846/145 μM、1071/145 μM、1107/145 μM、990/145 μM、1053/145 μM、603/145 μM、1044/145μM、873/145 μM、999/145 μM、540/145 μM、846/145 μM、999/145 μM、1044/145 μM、864/145μM、954/145 μM、999/145 μM、819/145 μM、648/145 μM、558/145 μM、1179/145 μM、1368/145 μM、1467/145 μM。
多重PCR反应试剂：超纯水、PCR Buffer缓冲液、25 mM MgCl2、25 mM dNTPs、DNA聚合酶；
SAP反应试剂：超纯水、SAP缓冲液、SAP酶；
单碱基延伸反应试剂：超纯水、延伸缓冲液、延伸终止液、Extend酶。
二、使用方法
依照实施例3的检测方法进行检测和结果判读。
对比例1 退火温度对多重PCR反应产物的影响
一、实验方法
实施例3多重PCR反应步骤中，退火温度分别52℃、54℃、56℃、58℃、60℃、62℃和64℃，其余步骤与实施例3相同。
二、实验结果
结果如图11和图12所示。退火温度在52℃、54℃、56℃时有非特异条带产生，在58℃、60℃、62℃和64℃能得到较好的特异性条带（图11）。在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性，且在58℃、60℃、62℃和64℃退火温度中，60℃的退火温度得到的质谱图峰值更优（图12）。
对比例2 扩增引物浓度对多重PCR反应产物的影响
一、实验方法
实施例3多重PCR反应步骤中，使用①～⑦组扩增引物混合物进行多重PCR反应扩增：
①在多重PCR反应体系中，序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.2 μM；
②在多重PCR反应体系中，序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM；
③在多重PCR反应体系中，序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.1 μM、0.1 μM；
④在多重PCR反应体系中，序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM；
⑤在多重PCR反应体系中，序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.1 μM、0.1 μM；
⑥在多重PCR反应体系中，序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM；
⑦在多重PCR反应体系中，序列如SEQ ID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.1 μM。
其余步骤与实施例3相同。
二、实验结果
结果如图13所示。在扩增试剂推荐的引物浓度和多重PCR反应条件下，7种扩增引物组合物的电泳结果显示，在只改变引物浓度情况下，第⑤组扩增引物混合物能够获得基因拷贝数更高的特异性条带且无非特异条带产生。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～10所示。
2. 一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的延伸引物，其特征在于，所述延伸引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示。
3.一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的扩增引物和权利要求2所述的延伸引物。
4.权利要求1所述的扩增引物、权利要求2所述的延伸引物和/或权利要求3所述的组合物在制备用于地中海贫血症检测和/或基因分型的产品中的应用。
5.一种用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的扩增引物和/或权利要求2所述的延伸引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含多重PCR检测试剂、SAP反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或几种。
7.一种基于飞行时间质谱法结合拷贝数对地中海贫血症基因分型的反应体系，其特征在于，所述反应体系包含扩增体系和延伸体系；
所述扩增体系中含有权利要求1所述的扩增引物，所述延伸体系中含有权利要求2所述的延伸引物。
8. 根据权利要求7所述的反应体系，其特征在于，所述扩增体系中，核苷酸序列如SEQID NO.1～10所示的各条扩增引物的浓度为0.1～0.2 μM；
所述延伸体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示的各条延伸引物的浓度为0.6～1.63 μM。
9. 根据权利要求8所述的反应体系，其特征在于，所述扩增体系中，核苷酸序列如SEQID NO.1～10所示的各条扩增引物的终浓度依次为0.15 μM、0.15 μM、0.1 μM、0.1 μM、0.2μM、0.2 μM、0.2 μM、0.2 μM、0.1 μM、0.1 μM；
所述延伸体系中，核苷酸序列如SEQ ID NO.11～40所示的各条延伸引物的终浓度依次为：0.88 μM、0.79 μM、0.86 μM、0.76 μM、0.87 μM、1.15 μM、1.03 μM、1.04 μM、0.94 μM、1.19 μM、1.23 μM、1.10 μM、1.17 μM、0.67 μM、1.16 μM、0.97 μM、1.11 μM、0.6 μM、0.94 μM、1.11 μM、1.16 μM、0.96 μM、1.06 μM、1.11 μM、0.91 μM、0.72 μM、0.62 μM、1.31 μM、1.52 μM、1.63 μM。
10.根据权利要求7～9任一所述的反应体系，其特征在于，所述反应体系还包含多重PCR检测试剂、SAP反应试剂和单碱基延伸反应试剂中的一种或几种。
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