CN116574795A - 基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型引物组和试剂盒 - Google Patents

基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型引物组和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型引物组和试剂盒。本发明提供的用于地中海贫血症基因分型的引物组包含序列如SEQ ID NO.1‑12所示的扩增引物，还包含序列如SEQ IDNO.13‑39所示的延伸引物。该引物组较为全面地覆盖了常见的地中海贫血相关基因热点突变及缺失，检出率更高，也更为准确；且该引物组能够通过单管反应同时检测地中海贫血症珠蛋白基因α和β的相关突变，具有高准确性、高灵敏度、高通量的特点，既可应用于临床诊断，也可以应用于地中海贫血携带者筛查。

Description

基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型引物组和试 剂盒
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其涉及基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型引物组和试剂盒。
背景技术
地中海贫血(简称地贫)是世界上最常见的常染色体单基因缺陷引起的隐性遗传性血液病。地中海贫血最早发现于地中海地区的人群，是一种由于珠蛋白基因缺失或突变导致肽链合成障碍而引起的溶血性贫血，正常人的血红蛋白是由α、β两类肽链组成的四聚体，由于基因突变，α和β肽链表达量降低，导致两者的比例不平衡，使得血红蛋白合成缺陷，红细胞容易破裂从而引发溶血性贫血。根据突变基因类型不同，可分为α、β、γ、δ、δβ地中海贫血，最常见的地中海贫血主要为α-地贫和β-地贫两类。
α肽链基因位于人类第16号染色体上，存在α1、α2两个基因，一个正常人具有4个α基因。α-地中海贫血是由于α基因缺失或者突变，使得α肽链合成量下降，胎儿体内过多的异常血红蛋白HbBart’s(γ4)，或者成人体内过多的β珠肽链形成血红蛋白HbH(β4)，导致无效造血和红细胞破坏。引发α-地中海贫血的突变在中国主要有三种缺失和三种突变，分别是缺失型--SEA、-α3.7、-α4.2及点突变Constant Spring(CS)、Quong Sze(WS)、Westmead(WS)。根据α基因的缺失情况及临床症状α-地中海贫血又可分为静止型、轻型、中间型和重型。一般来说，只缺失一个α基因，成人基本无明显临床表现，部分携带者血常规和血红蛋白电泳无异常。而对于缺失两个α基因的携带者，会有轻微的贫血，其血常规和血红蛋白电泳都有一些异常，此类携带者若与同样缺失α基因的患者结婚，就有可能会生育重型地贫患儿。轻型携带者与静止型携带者有四分之一的可能生育HbH患儿，即缺失3个α基因，是中间型地贫患者，有较为明显的贫血，临床表型因人而异，部分HbH患者能够比较好地生活，而部分则有比较严重的贫血，影响到生活质量。轻型α-地贫患者若与同样是轻型α-地贫患者结婚则有四分之一的可能生育重型地贫患儿，即HbBart’s患儿。HbBart’s胎儿会产生严重的水肿胎现象，受累胎儿由于严重贫血、缺氧，常于妊娠23-40周左右在宫内或分娩半小时后死亡。另外，妊娠HbBart’s水肿胎，母体产科并发症增加，如出现先兆子痫、早产、弥散性血管内凝血、胎盘前置和产后出血等情况。因此，通过地贫筛查和诊断，提前发现这样的胎儿并终止妊娠，尤其必要。由于生育中间型和重型的患儿的概率极高，对于中间型α-地贫患者尤其需要谨慎。
β肽链基因位于人类第11号染色体，与α不同的是每条染色体上只有一个β基因，但是还存在一个在胎儿期表达的γ基因及少量表达的δ基因。一个正常人有两个在胎儿期表达的γ基因，以及在成人期表达的δ和β基因。β-地中海贫血一般是由于β基因点突变导致β肽链合成减少，多余的α肽链沉积在红细胞膜上，造成红细胞破坏。β肽链基因上不同位点突变会导致β肽链合成量不同，将那些突变使得β肽链减少但并非完全缺失的定义为β+，若突变导致β肽链完全不合成，则定义为β0。其中，若有一个正常β基因，无论突变的基因是β0还是β+，一般为轻型β-地中海贫血，血常规和血红蛋白有异常，但对于携带者的生活影响较少。在杂合子β基因突变中，地贫中CD53这个突变由于发生了移码突变，使得红细胞非常不稳定，其杂合子患者可导致中间型地中海贫血，其对于患者生活有一定影响。而纯合子突变，即两个β基因都有突变的地中海贫血患者多半为中间型或者重型地中海贫血。中间型β-地贫患者由于基因突变类型不同，其贫血程度也有所不同。β-地贫患儿在胎儿期并无异常，只有在出生之后其病症才慢慢表现出来，发病越早，病情越重。重型β-地贫患儿一般会有肝脾肿大、黄疸、发育不良、贫血、有典型的地中海贫血特殊面容，若不及时合理治疗，一般在五岁前便会死亡。
当夫妇双方均为同一类型(α-或β-)地贫基因携带者时，其后代有四分之一的机会罹患重型α-或β-地贫。重型α-或β-地贫均为致死性疾病，前者在出生前或出生后半小时内死亡，后者因严重贫血需不断输血才能维持生命，平均存活年龄仅10岁左右，得不到有效治疗的重症地贫患儿很难活到20岁。
地贫患者除了身体上要承受巨大的痛苦之外，其家庭也要承受巨大的经济压力。其中重型地贫患儿每月需要4000元维持生命，成年人每月的治疗费接近万元，每年的治疗费用至少10万元，每例重症地贫患儿出生给社会和家庭带来的经济负担高达100-300万元。根治重型地贫患儿的唯一方法是移植造血干细胞，其费用超过40万，且有90％的患者无法配型成功。
由于重型地中海贫血无法有效治疗，且患者对于家庭和社会都是严重的负担，因此通过地中海贫血筛查和诊断，防止重型地贫患儿的出生是目前世界上最为有效的措施。通过血常规、血红蛋白电泳分析以及基因诊断来筛查孕育夫妇生育重型地贫患儿的可能性，最后通过对胎儿进行产前诊断，确认为重型地贫患儿则终止妊娠。
目前，临床上常用亚能生物技术(深圳)有限公司以及达安基因提供Gap-PCR法联合PCR-反向点杂交法检测α-地中海贫血，该方法在α-地中海贫血的分子筛查和临床诊断中发挥了很大的作用，但该方法在对PCR扩增产物分析时容易造成DNA交叉污染，而且操作繁琐不适用于大规模检测。近年来，具有高通量、高集成、微型化、连续化和自动化等特点的微阵列芯片法被应用于α-地中海贫血检测。博奥生物集团有限公司的微阵列芯片法在α-地中海贫血检测中可同时检测缺失型和非缺失型，减少了实验步骤，提高了工作效率，同时可实现连续化和自动化，能满足大规模检测需求。但是，微阵列芯片法容易造成漏检，不能检出泰国型缺失，而泰国型缺失复合东南亚型缺失的双杂合子表型为典型的巴氏水肿胎，因此泰国型缺失的检出意义尤为重要，上述问题使得该检测方法存在比较明显的不足之处；另外，该方法对设备要求较高，试剂成本较高，不适用于基层单位。针对此问题，申请人此前曾开发了利用导流杂交法同时检测α/β-地中海贫血的试剂盒，该试剂盒最大的优势是，基因芯片诊断技术在核酸扩增的基础上，采用荧光标记及引物延伸的方法，可提高检测结果的敏感性和特异性；另外其具有高通量的特点，适用于大面积筛查，可缩短时间，并且可以实现α/β-地贫在同一张膜上检测，避免漏检同时出现α/β-地贫的病例，降低检测成本；此外，该试剂盒在检测时并不需要特殊的仪器，适合基层实验室常见地贫的诊断。
MassARRAY DNA飞行质谱分析系统平台(Agena Bioscience)是全球独创的核酸质谱高精度DNA定性定量分析平台，是一个完整的分子实验室基因检测和研究的平台，其MassARRAY飞行时间质谱生物芯片系统可以高灵敏度和高精确度地快速分析核酸样本，通量能力能够满足大样本量检测的需求，能够快速给出检测结果、具有低成本检测几百个基因突变的能力。MassARRAY飞行时间质谱检测的原理是样本分析物与芯片基质(硅化合物)共价结合形成结晶后在质谱仪的真空腔中经高能激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，在电场中离子飞行时间与离子的质量成反比相关，通过检测解吸的核酸分子在真空腔中飞行的时间从而计算获得样本分析物的精确分子量，进而得到分析物的基因型信息。该系统自推出后很快成为国际业界公认的SNP基因型分析和DNA甲基化分析的黄金标准，是目前唯一应用飞行质谱对痕量核酸进行全方位研究的技术平台。然而，对于地中海贫血，目前尚无覆盖全面、灵敏准确的利用飞行时间质谱法检测地中海贫血基因型的试剂盒和方法。
发明内容
本发明提供基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型引物组和试剂盒。
本发明基于飞行时间质谱技术平台开发地中海贫血检测引物组和试剂盒，其中，引物组包含一套扩增引物组和一套延伸引物组，上述引物组可实现在PCR和UEP反应中，在同一反应体系(单管反应)中对基因进行定性和定量分析。该引物组和试剂盒依次通过PCR扩增反应、SAP反应、UEP反应和质谱检测，既能实现对地中海贫血症珠蛋白基因α和β的突变的检测，确定珠蛋白基因α和β突变点的峰高和SNR值，又能实现对中国人群地中海贫血常见27个突变位点进行准确的基因分型，其中包含对泰国型突变的地中海贫血的检测。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供用于地中海贫血症基因分型的引物组，所述引物组包含序列如SEQ ID NO.1-12所示的扩增引物，还包含序列如SEQ ID NO.13-39所示的延伸引物。
上述引物组能够实现在PCR和UEP反应中，在同一反应体系(单管反应)中对地中海贫血症的相关基因突变进行扩增和单碱基延伸反应，较为全面地覆盖常见的基因突变位点，且具有较高的灵敏度和准确性。
单管反应能够极大地提高检测效率，但若有需要，本发明的上述引物组也能够进行分管反应。
在PCR扩增反应中，单管反应为将上述各条扩增引物添加至一个反应管中进行PCR扩增反应；分管反应则为将α型与β型分开两管进行PCR扩增反应。
上述引物组覆盖的突变包括：α-地贫的4种常见缺失(-SEA、-α3.7、-α4.2、-THAI)和3种点突变型(-αCS、-αQS、-αWS)及β-地贫的20种致病性变异位点：-30(T-C)、-32(C-A)、-28(A-G)、-29(A-G)、Cap+40/43(-AAAC)、Cap+1(A-C)、Init(T-G)、CD14/15(+G)、CD17(A-T)、CD27/28(+C)、CD26(GAG-AAG)、CD31(-C)、CD41/42(-TCTT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-Ⅰ-1(G-T,G-A)、IVS-Ⅰ-5(G-C)、IVS-Ⅱ-654(C-T)、CD30(A-G)。
上述引物组用于人类地中海贫血症基因突变的检测和基因分型。
第二方面，本发明提供以上所述的用于地中海贫血症基因分型的引物组在制备用于地中海贫血症检测和/或基因分型的试剂盒中的应用。
第三方面，本发明提供用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的用于地中海贫血症基因分型的引物组。
除包含以上所述的引物组外，为便于检测，上述试剂盒还可包含用于飞行时间质谱法基因分型的其它试剂，这些试剂包括PCR反应试剂、SAP反应试剂、UEP反应试剂、飞行时间质谱检测试剂等。
优选地，所述用于地中海贫血症基因分型的试剂盒还包含选自PCR反应试剂、SAP反应试剂、UEP反应试剂、飞行时间质谱检测试剂中的一种或多种。
其中，PCR反应试剂包括PCR反应缓冲液、Mg2+、dNTP、DNA聚合酶、水等。
SAP反应试剂包括SAP反应缓冲液、SAP酶、水等。
UEP反应试剂包括单碱基延伸反应缓冲液、单碱基延伸反应终止液、单碱基延伸反应酶、水等。
上述各反应试剂中的一种或多种可以预混液形式提供。
以上所述的试剂盒基于飞行时间质谱法对地中海贫血症进行基因分型，所述基因分型包括以下步骤：
以待测样本的基因组DNA为模板，采用扩增引物进行多重PCR扩增，得到PCR反应产物，
将所述PCR反应产物与SAP反应试剂混合进行SAP反应得到SAP反应产物，
将所述SAP反应产物与UEP反应试剂和上述延伸引物混合进行UEP反应得到UEP反应产物，
对所述UEP反应产物进行飞行时间质谱检测。
其中，优选地，在多重PCR扩增反应体系中，序列如SEQ ID NO.1-12所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.12μM、0.12μM、0.1μM、0.1μM、0.11μM、0.11μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.13μM、0.1μM、0.1μM。
优选地，在多重PCR扩增反应体系中，待测样本的基因组DNA的添加量为10-50ng。
进一步优选地，5μL的多重PCR扩增反应体系包括以下组分：10×PCR反应缓冲液0.5μL，25mM MgCl2 0.4μL，25mM dNTP mix 0.1μL，序列如SEQ ID NO.1-12所示的扩增引物混合物0.5μL，DNA聚合酶0.2μL，DNA样本10-50ng，超纯水补足5μL。
优选地，在UEP反应体系中，序列如SEQ ID NO.13-39所示的各条延伸引物在最终反应体系中的浓度依次为：0.78μM、0.99μM、0.86μM、0.76μM、0.87μM、1.15μM、1.03μM、1.04μM、0.94μM、1.19μM、1.23μM、1.10μM、1.17μM、0.67μM、1.16μM、0.97μM、1.11μM、0.6μM、0.94μM、1.11μM、1.16μM、0.96μM、1.06μM、1.11μM、0.91μM、0.72μM、0.62μM。
优选地，多重PCR反应程序包括：(1)98℃，5min；(2)98℃、30sec，62℃、30sec，72℃、120sec，共35个循环；(3)72℃、5min。
优选地，UEP反应程序包括：(1)94℃、30sec；(2)以下程序40个循环：①95℃、5sec，②52℃、5sec，80℃、5sec，5个循环；(3)72℃、3min。
优选地，结果判断方法如下：定性检测时，根据延伸引物及引物延伸后分子量大小，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：对于缺失型α-地贫基因位点，当突变峰值≥2，SNR>8时，该位点峰值为阳性；反之为阴性。对于上述确定突变为阳性的样本，若HBA2内参基因位点延伸产物峰值≥2时，SNR>8，判别为杂合缺失；若HBA2内参基因位点延伸产物峰值<2，SNR<8，判别为纯合缺失。对于α-地贫和β-地贫点突变位点，判断原则为当峰值≥2时，突变型峰值/野生型峰值≥0.5，SNR>8，样本判断为阳性；当峰值<2时，突变型峰值/野生型峰值＜0.5时，样本判断为阴性。
第四方面，本发明提供以上所述的用于地中海贫血症基因分型的引物组或所述用于地中海贫血症基因分型的试剂盒在检测地中海贫血症相关基因的基因型中的应用。
以上所述的应用可为非疾病诊断和治疗目的的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供的引物组较为全面地覆盖了常见的地中海贫血相关基因热点突变及缺失，与其他产品相比，增加对泰国型地中海贫血的检测，使得产品覆盖更广泛的地中海贫血类型，检出率更高，也更为准确。
本发明的引物组能够通过单管反应同时检测地中海贫血症珠蛋白基因α和β的相关突变，确定珠蛋白基因α和β的峰高和SNR值，同时检测中国人群地贫常见的、包括泰国型在内的27个热点突变，具有高准确性、高灵敏度、高通量的特点，适于推广和应用。
本发明的引物组和试剂盒利用飞行时间质谱检测方法进行基因分型，操作简单、检测成本低、检测结果稳定可靠、通量高，适用于进行临床大规模人群筛查，适用对象包括疑似地中海贫血症的患者，确诊地中海贫血症的患者，或有地中海贫血症家族病史等高危人群，可以对正常人、携带者和患者进行准确的基因分型筛查，用于地中海贫血症患者的辅助临床诊断和携带者、新生儿的筛查，既可应用于临床诊断，也可以应用于地中海贫血携带者筛查以及地贫的一二三级预防。
与现有产品相比，本发明的引物组和试剂盒至少具有以下优势：
1、高精准度、低复查率：本发明的引物组能够实现在同一反应体系中高效地进行目标片段的扩增和突变的延伸反应；配合MassARRAY DNA飞行质谱分析系统进行基因分型，可高灵敏度和高精确度地快速分析待测样本的突变类型。
2、应用范围广：本发明的检测试剂盒可同时对地中海贫血所涉及的缺失以及常见的热点突变进行检测，并且较其他产品增加了对泰国型地贫的检测，检测覆盖范围广，既可应用于开展地中海贫血的一级、二级、三级预防，也可辅助于临床诊断，得到更精准的诊断结果。
3、检测通量高：根据目前的MassARRAY DNA飞行质谱分析系统机型，最多每次可以处理384*2个样本，每天可以处理6-8块芯片，高通量(3000-5000人份/天)能够满足大样本量筛查的应用需求。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例3中对多重PCR扩增条件中的退火温度进行优化以筛选特异性扩增条件的电泳结果。其中，上、中、下三个图分别为PCR反应程序A、B和C的电泳结果。
图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12为本发明实施例3中所用的阴性样本和阳性临床样本基因位点的飞行时间质谱图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型引物组的开发
通过NCBI、Snapgene以及文献查阅寻找常见突变位点的序列，并根据这些序列设计基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型引物组，引物组包括扩增引物和质谱延伸引物，其中，共6对扩增引物(含针对α突变的5对引物，其中4对大片段缺失的扩增引物及1对涵盖三个点突变类型的扩增引物，以及针对β突变的1对引物)，以及涵盖20个变异位点，共27条延伸引物，具体引物名称和序列信息如表1所示。
表1引物序列
各突变位点质谱探针、野生型和突变型对应分子量如表2所示。
表2各突变位点质谱探针、野生型和突变型对应分子量表
实施例2基于飞行时间质谱法的地中海贫血症基因分型方法的建立
1、DNA样本提取
DNA样本通过抽取人的外周血得到，使用凯普核酸提取试剂盒磁珠法DR-4801-KZ型提取全血基因组DNA，再使用凯普自动提取仪4801完成提取实验。
2、多重PCR反应
PCR反应试剂包括超纯水、PCR Buffer缓冲液、25mM MgCl2、25mM dNTP Mix、扩增引物混合物、DNA聚合酶。
其中，扩增引物混合物由表1中所示的各条扩增引物(SEQ ID NO.1-12)混合得到，针对各突变位点的每条扩增引物的原始浓度为100μmol/L。多重PCR扩增反应体系中，序列如SEQ ID NO.1-12所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.12μM、0.12μM、0.1μM、0.1μM、0.11μM、0.11μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.13μM、0.1μM、0.1μM。
多重PCR反应体系设置如表3所示，DNA样本的添加量以10ng及以上为适宜。
表3
多重PCR反应程序设置如表4所示。
表4
3、SAP反应
SAP反应试剂包括：超纯水、SAP缓冲液、SAP酶。
添加2μL SAP混合液到单孔PCR反应产物中，总体积：7μL。
SAP混合液组成如表5所示。
表5
SAP反应程序设置如表6所示。
表6
4、UEP反应
UEP反应试剂包括：超纯水、延伸缓冲液、延伸终止液、延伸引物混合物、Extend酶。
向上一步的SAP反应产物中加入2μL单碱基延伸反应液，总体积9μL。
其中，延伸引物混合物由表1中所示的各条延伸引物混合得到。每条单碱基延伸引物的原始浓度为500μmol/L，在UEP反应体系中，序列如SEQ ID NO.13-39所示的各条延伸引物的终浓度依次为：0.78μM、0.99μM、0.86μM、0.76μM、0.87μM、1.15μM、1.03μM、1.04μM、0.94μM、1.19μM、1.23μM、1.10μM、1.17μM、0.67μM、1.16μM、0.97μM、1.11μM、0.6μM、0.94μM、1.11μM、1.16μM、0.96μM、1.06μM、1.11μM、0.91μM、0.72μM、0.62μM。
单碱基延伸反应液的组成如表7所示。
表7
单碱基延伸反应程序设置如表8所示。
表8
反应结束后，2000rpm瞬时离心，每孔加入16μL的灭菌双蒸水(此时每孔内的总体积为25μL)，更换新膜将384孔板封住，震荡混匀后，离心。
5、质谱检测
将步骤4的单碱基延伸反应产物采用飞行时间质谱仪进行分析，导入Assay和对应的384板的样本编号，连接芯片。将384孔板与芯片放置在质谱仪相应的位置，然后按开始键，直到全部完成。检测结果用Typer 4.0软件自动分析，并将各位点峰面积导出至Excel文件。
6、结果判读
优选地，结果判断方法如下：定性检测时，根据延伸引物及引物延伸后分子量大小，判读目标位点上为何种基因型，判断原则为：对于缺失型α-地贫基因位点，当突变峰值≥2，SNR>8时，该位点峰值为阳性；反之为阴性。对于上述确定突变为阳性的样本，若HBA2内参基因位点延伸产物峰值≥2时，SNR>8，判别为杂合缺失；若HBA2内参基因位点延伸产物峰值<2，SNR<8，判别为纯合缺失。对于α-地贫和β-地贫点突变位点，判断原则为当峰值≥2时，突变型峰值/野生型峰值≥0.5，SNR>8，样本判断为阳性；当峰值<2时，突变型峰值/野生型峰值＜0.5时，样本判断为阴性。
实施例3引物组的性能验证
1、引物组的特异性分析
利用特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.12对实施例2中获取的样本DNA进行PCR扩增，得到扩增产物。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带位置可以判断PCR扩增特异性。进一步地，对多重PCR扩增条件中的退火温度进行优化，以减少非特异性条带的产生，分别采用以下A、B和C三种多重PCR反应程序进行扩增，将5μl PCR产物于1.5％的琼脂糖凝胶中电泳分析，PCR产物的电泳结果如图1所示，结果显示，PCR反应程序C扩增得到的目的片段条带清晰、无明显非特异条带，有利于后续的质谱分析，提高基因检测结果的准确性和可靠性。
PCR反应程序分别为：
A：(1)98℃，5min；(2)98℃、30sec，58℃、30sec，72℃、120sec，共35个循环；(3)72℃、5min。
B：(1)98℃，5min；(2)98℃、30sec，66℃、30sec，72℃、120sec，共35个循环；(3)72℃、5min。
C：(1)98℃，5min；(2)98℃、30sec，62℃、30sec，72℃、120sec，共35个循环；(3)72℃、5min。
2、引物组的准确度、测定下限、抗干扰能力评价
使用临床样本对实施例1的引物组和实施例2的分型方法的准确度、测定下限、抗干扰能力进行评价，具体方法和结果如下：
(1)准确度评价：取阴性样本5份，阳性样本10份进行检测。其中，阳性样本为由凯普生物技术支持中心提供的确诊基因型样本。将所有检测结果按表9归总后得到表10和表11，计算符合率。实验结果与验证的结果符合率为100％即为通过，图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9、图10、图11、图12为阴性样本和阳性样本的质谱峰图。
表9方法符合率验证
阳性符合率＝a/(a+c)×100％；
阴性符合率＝d/(b+d)×100％；
总符合率＝(a+d)/(a+b+c+d)×100％。
表10本发明试剂盒检测已知基因型样本结果
样本编号 已知基因型 实验结果是否相符
A1 αα/αα，β/β 是
A2 αα/αα，β/β 是
A3 αα/αα，β/β 是
A4 αα/αα，β/β 是
A5 αα/αα，β/β 是
A6 --THAI/αα，β/β 是
A7 --SEA/αα，β/β 是
A8 -α3.7/αα，β/β 是
A9 --α4.2/αα，β/β 是
A10 αα/αα，βCD71/72(+A)/β 是
A11 αα/αα，β-28(A-G)/β-28(A-G) 是
A12 αα/αα，βCD31(-C)/βCD31(-C) 是
A13 αα/αα，βCD26(GAG-AAG)/βCD26(GAG-AAG) 是
A14 αα/αα，βCD43(G-T)/β 是
A15 αα/αα，βIVS-II-654(C-T)/β 是
表11方法符合率验证结果
经计算，阳性符合率为100％，阴性符合率为100％，总符合率为100％，表明利用本发明的引物组和基因分型方法得到的检测结果与已知基因型结果符合率为100％，本发明的基因分型引物组和方法具有较高的准确度。
(2)测定下限验证：选取上述(1)准确度评价中所用到的α、β地中海贫血基因阳性样本5个，稀释至每个型别的浓度为5ng/μl，验证在测定下限浓度是否能检出阳性结果。测定下限实验结果与预期结果的符合率为100％即为通过，结果汇总至表12。
表12本发明试剂盒测定下限结果
结果表明，本发明的基因分型引物组和方法在测定下限(5ng/μl)时的检测结果与已知基因型结果符合率为100％。
(3)抗干扰能力验证：选取上述(1)准确度评价中所用到的α、β地中海贫血基因阳性样本5个，每例样本分别制作成：a、含有109g/L血红蛋白干扰物的临床样本；b、含有450μmol/L胆红素干扰物的临床样本；c、含有6.7mmol/L甘油三酯干扰物的临床样本；d、不含干扰物的临床样本，结果如表13所示。
表13本发明试剂盒抗干扰能力结果
/>
结果表明，本发明的基因分型引物组和方法在存在血红蛋白、胆红素、甘油三酯等干扰物时的检测结果与已知基因型结果符合率为100％，具有较强的抗干扰能力。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.用于地中海贫血症基因分型的引物组，其特征在于，所述引物组包含序列如SEQ IDNO.1-12所示的扩增引物，还包含序列如SEQ ID NO.13-39所示的延伸引物。
2.权利要求1所述的用于地中海贫血症基因分型的引物组在制备用于地中海贫血症检测和/或基因分型的试剂盒中的应用。
3.用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的用于地中海贫血症基因分型的引物组。
4.根据权利要求3所述的用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含选自PCR反应试剂、SAP反应试剂、UEP反应试剂、飞行时间质谱检测试剂中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒基于飞行时间质谱法对地中海贫血症进行基因分型，所述基因分型包括：
以待测样本的基因组DNA为模板，采用扩增引物进行多重PCR扩增，得到PCR反应产物，
将所述PCR反应产物与SAP反应试剂混合进行SAP反应得到SAP反应产物，
将所述SAP反应产物与UEP反应试剂和延伸引物混合进行UEP反应得到UEP反应产物，
对所述UEP反应产物进行飞行时间质谱检测。
6.根据权利要求5所述的用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，其特征在于，多重PCR扩增反应体系中序列如SEQ ID NO.1-12所示的各条扩增引物的终浓度依次为：0.12μM、0.12μM、0.1μM、0.1μM、0.11μM、0.11μM、0.1μM、0.1μM、0.1μM、0.13μM、0.1μM、0.1μM。
7.根据权利要求5或6所述的用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，其特征在于，UEP反应体系中，序列如SEQ ID NO.13-39所示的各条延伸引物在最终反应体系中的浓度依次为：0.78μM、0.99μM、0.86μM、0.76μM、0.87μM、1.15μM、1.03μM、1.04μM、0.94μM、1.19μM、1.23μM、1.10μM、1.17μM、0.67μM、1.16μM、0.97μM、1.11μM、0.6μM、0.94μM、1.11μM、1.16μM、0.96μM、1.06μM、1.11μM、0.91μM、0.72μM、0.62μM。
8.根据权利要求5～7任一项所述的用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，其特征在于，多重PCR扩增反应程序包括：(1)98℃，5min；(2)98℃、30sec，62℃、30sec，72℃、120sec，共35个循环；(3)72℃、5min。
9.根据权利要求5～7任一项所述的用于地中海贫血症基因分型的试剂盒，其特征在于，UEP反应程序包括：(1)94℃、30sec；(2)以下程序40个循环：①95℃、5sec，②52℃、5sec，80℃、5sec，5个循环；(3)72℃、3min。
10.权利要求1所述的用于地中海贫血症基因分型的引物组或权利要求3～9任一项所述的用于地中海贫血症基因分型的试剂盒在检测地中海贫血症相关基因的基因型中的应用。
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