CN109112204A - 用于基因分型检测α与β地中海贫血的引物组、芯片及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测α与β地中海贫血的引物组,属于分子生物学领域。所述引物组包括α引物组,和β引物组;本发明还提供了可同时检测α与β地中海贫血的芯片,所述芯片上固定有如SEQ ID NO:1‑31所示序列的探针的芯片;基于所述引物组和芯片,本发明还提供了可同时检测α与β地中海贫血的试剂盒。本发明试剂盒具备检测时间短、成本低、操作方便,闭管操作,减少污染,对开展地贫人群筛查,遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学医药领域,涉及一种检测α与β地中海贫血技术,特别是涉及一种直接PCR(Direct PCR)结合杂交技术同时检测7种α地中海贫血突变和19种点突变β地中海贫血的试剂盒。
背景技术
地中海贫血(thalassemia,简称地贫),是是由于α或β珠蛋白基因缺失或突变导致珠蛋白链合成障碍,造成α链与β链的比例失去平衡,相对过剩的链呈游离状态,进而导致血红蛋白不稳定,冗余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上,容易氧化变性,红细胞膜的通透性和脆性发生改变,导致溶血性贫血,临床上常表现出症状轻重不一的慢性进行性溶血性贫血。并且根据受累的珠蛋白肽链的类型分为α、β、γ、δ和δβ地贫等类型。其中以α、β地贫最为常见,危害也最大。广泛发生于热带和亚热带国家及我国长江以南地区。
α-地中海贫血(以下简称α-地贫)是由于α-珠蛋白基因缺失或点突变而致α-珠蛋白链合成障碍的疾病,具高度的遗传异质性。95%以上为缺失型,是由于α珠蛋白基因大片段缺失所致。就人类正常基因组而言,a珠蛋白簇的基因型为ζ2/α22/α12,有4个α珠蛋白基因,一条染色体上缺失或缺陷1个α基因,为α+地贫(静止型),通常缺失一个α基因或一个α基因发生点突变或少数几个碱基的缺失或插入引起(-α/,αTα),表现为α-珠蛋白肽链合成部分受阻,我国最常见的α+地贫基因为-3.7、-4.2缺失型突变以及Hb WS,Hb QS与Hb CS等点突变。缺失2个α基因,为α0地贫(标准型),特点为α-珠蛋白肽链合成完全受阻,,我国最常见的为--SEA,少见--THAI,而--FIL则更罕见。缺失3个αl或/和α2基因的为HbH病,4个α珠蛋白基因均缺失的为Hb Bart's胎儿水肿综合征。当夫妇双方均为她中海贫血基因缺失携带者时,其后代有25%的机会罹患Hb Bart's或HbH病。HbH病患者中至重度贫血,可丧失劳动力,严重影响生存质量;Hb Bart's水肿胎受累患儿因严重缺氧而胎死腹中或一出生即死亡,引起的产科并发症给产妇带来极大的身心伤害;最常见的是α0-地贫复合α+地贫的缺失型Hb H病,然而α2-珠蛋白基因发生非缺失型突变的纯合子或复合杂合子会引起重度贫血的Hb H病也占有相当的比例,这类病人比那些缺了3个α珠蛋白基因所表现出来的临床症状更严重,贫血更严重。这些都给家庭和社会造成巨大压力。
β珠蛋白基因簇位于人体11号染色体的短臂上,包括ε、Gr、Ar、δ和β珠蛋白基因及2个假基因,总长度约为50Kb。β珠蛋白肤链是由β珠蛋白基因所编码的146个氨基酸组成。β地中海贫血的主要分子病理学基础是β珠蛋白基因的点突变及小的插入或缺失,包括β珠蛋白基因的启动子序列突变或增强子突变都可引起β珠蛋白生成障碍性贫血,导致β珠蛋白基因转录、hnRNA加工或mRNA翻译异常引起,而相对过剩的α珠蛋白肤链的存在是β地中海贫血发生溶血、贫血和无效造血的根本原因。β珠蛋白基因含2个内含子及3个外显子。在其外显子1、外显子2、内含子1及3’端调控区集中了中国人群中发现的大部分突变。目前在全世界己报道约170种左右的β珠蛋白基因的突变类型,我国己发现至少有28种此类突变,最主要的有6种CD41-42,CD17,IVS-2nt654,TATAbox-28,CD71-72及CD26占中国人β地中海贫血突变基因总数的90%以上。
β地中海贫血是最常见的单基因遗传病之一,在我国南方各省区高发,高发区人群基因携带率达到3-9%。β地中海贫血是因调控β珠蛋白的基因点突变或缺失而导致的β珠蛋白合成障碍的一种溶血性贫血。β地中海贫血的纯合子或或β0β+的双重杂合子为致死性疾病。
目前地中海贫血仍无较理想的治疗手段,采用基因分析法进行产前诊断,可在妊娠早期对中、重型地中海贫血患儿做出诊断并及时终止妊娠,以避免中、重型地中海贫血患儿出生是目前预防本病行之有效的方法。
目前对地贫筛查方法如红细胞渗透脆性试验、血常规参数检测分析、血红蛋白电泳试验等特异性不高,较易产生假阴性。对于地中海贫血的分子诊断,PCR-等位基因特异性寡核苷酸探针杂交(PCR-ASO)是最早用于检测点突变的一种方法,一次只能检测一种突变,对于多个突变位点的检测操作复杂,成本高而不适合常规检测。近年发展起来的单链构象多肽性分析(PCR-SSCP)、PCR-RFLP连锁分析、热变性高效液相法、等位基因特异性PCR、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、TaqMan探针荧光PCR法与高分辨熔解曲线检测技术(HRM)等,这些方法首先检测费用昂贵,且操作要求费时或不定性。但这些方法检测过程繁琐、检测所用时间长、使用试剂或者仪器昂贵和特殊的标记引物等,因而不利于临床广泛的推广应用。
采用基因检测方法的地贫检测产品有深圳益生堂的缺失型α-地中海贫血基因诊断试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、亚能生物的α-地中海贫血基因检测试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、达安基因的α-地中海贫血基因检测试剂盒和非缺失型α-地中海贫血基因检测试剂盒、潮州凯普的α-地中海贫血基因检测试剂盒(PCR+导流杂交法)。
并且这些技术均需DNA抽提的操作繁琐复杂、耗时、易交叉污染、实验需要DNA自动提取仪精密仪器和试剂耗材成本昂贵,在临床上无法普遍推广应用。而DNA的质量是PCR成功的一个非常关键的因素,并且提取与纯化DNA过程极易污染,使得实验易出现假阴性或者假阳性,极易造成漏检或误检。
另外,同时所需样本量多,对于边远地带采集的标本运输需要冷链设备,需三级包装系统,标本储存空间大;生物安全风险系数高。对全血、羊水和DBS等样本,无需DNA提纯,直接检测地贫的专利技术尚无,市场上尚无此类产品。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是:针对现有的检测方法的缺陷,本发明的目的在于采用直接PCR(Direct PCR)方法,提供一种直接同时检测26种地贫类型,包括7种α地贫突变和19种β地贫突变位点的基因检测试剂盒。
本发明的技术方案如下:
用于检测α与β地中海贫血的引物组,包括α引物组,和β引物组;所述α引物组包括如下引物对:
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的APF/APR;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的SEAF/SEAR;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的THAIF/THAIR;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的4.2F/4.2R;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的3.7F/3.7R;
所述β引物组包括如下引物对:
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的APF/APR;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的B1F/B1R;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的B2F/B2R。
所述检测指以人体血液和/或体液和或胚胎的遗传物质和/或人体基因组DNA为模板,用所述引物组进行PCR扩增后,将所得扩增产物进行电泳和/或测序即可获知结果用于基因分型检测α与β地中海贫血的芯片,包括如下特异性探针:
用于检测β-地中海贫血基因所对应的正常基因和突变基因位点的特异性寡核苷酸探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-25;
用于检测α-地中海贫血非缺失基因所对应的正常基因和突变基因位点的特异性寡核苷酸探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO:26-31;
用于检测α-地中海贫血缺失基因的特异性寡核苷酸探针,其核苷酸序列如SEQ IDNO:33-36
所述芯片还包括:显色体系控制探针,其碱基序列如SEQ ID NO:32。
所述芯片还包括:用于固定各探针的基底,;对应各核苷酸序列的每条探针被固定在所述基底上,形成所述芯片。
所述基底选自玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、微缩磁珠;优选为尼龙膜;
在传统等位基因特异寡核苷酸探针点杂交基础上发展起来的PCR-反向点杂交(PCR-Reverse Dot Blot,PCR-RDB)技术,它与传统ASO不同是膜上固定靶DNA被固定探针取代,一次杂交即可对被检DNA的多个突变位点进行筛查,具有灵敏度高、特异性好和准确性高等优点。
用于快速检测缺失型α与β地中海贫血基因型的试剂盒,包括所述的引物组,及所述的芯片。
所述快速检测指,直接以人体体液和/或血液和或胚胎的遗传物质做为模板,用所述引物组进行PCR扩增后,将所得扩增产物滴加至所述芯片上进行杂交发生显色反应可获知结果。
所述试剂盒还包括用于进行PCR和/或电泳的试剂。
所述用于进行PCR的试剂包括dNTP、DNA聚合酶、缓冲液、双蒸水、MgCl2;
所述用于进行电泳的试剂包括琼脂糖、蒸馏水、核酸染料;
所述核酸染料优选溴化乙锭。
所述PCR的反应体系为:1~4μl模板、各引物:0.05~1μmol/L、MgCl2浓度为1.5~5mM/L、dNTP的浓度为100~500μM/L、DNA聚合酶的浓度为1~4U/反应;
或者,所述β引物组的PCR的反应体系为:1.25U/μL MightyAmp Taq 0.1~1μl、2×MightyAmp Buffer 10μl、10μmol/L B1F 0.1~1μl、10μmol/L B1R 0.1~1μl、10μmol/LB2F0.1~1μl、10μmol/L B2R 0.1~1μl、10μmol/L APF 0.1~1μl、10μmol/L APR 0.1~1μl、模板1~9.3μl;
所述β引物组的PCR的反应体系优选为:MightyAmp Taq 0.5μl、2×MightyAmpBuffer10μl、B1F 0.25μl、B1R 0.25μl、B2F 0.5μl、B2R 0.5μl、APF 0.35μl、APR 0.35μl、模板7.3μl;
所述β引物组各引物摩尔浓度比例如下:B1F∶B1R∶B2F∶B2R∶APF∶APR=5∶5∶10∶10∶7∶7;
所述β引物组的PCR的反应程序为:95℃3-5分钟;以94℃30秒、55℃~61℃30~35秒、72℃30~35秒秒为1个循环,进行30~36个循环;72℃5分钟;12℃12秒
β引物组的PCR反应程序优选为:95℃5min;以94℃30sec、58℃30sec、72℃35sec为1个循环,共34个循环;72℃5min;12℃12sec;
所述α引物组的PCR反应体系为:MightyAmp Taq 0.1-1μl、2×MightyAmp Buffer10μl、3.7F 0.1-1μl、3.7R 0.1-1μl、4.2F 0.1-1μl、4.2R 0.1-1μl、SEA-F 0.1-1μl、SEA-R0.1-1μl、THAI-F0.1-1μl、THAI-R 0.1-1μl、模板1-9.1μl;
所述α引物组的PCR反应体系优选为:MightyAmp Taq 0.5μl、2×MightyAmpBuffer 10μl、3.7F 0.2μl、3.7R 0.2μl、4.2F 0.2μl、4.2R 0.2μl、SEA-F 0.2μl、SEA-R 0.2μl、THAI-F 0.2μl、THAI-R 0.2μl、模板7.9μl;
所述α引物组各引物摩尔浓度比例如下:3.7F∶3.7R∶4.2F∶4.2R∶SEA-F∶SEA-R∶THAI-F∶THAI-R=1∶2∶1∶1∶1∶1∶1∶1;
α引物组的PCR反应程序优选为:95℃5min;以94℃30sec、61~64℃45sec~60sec、72℃130sec为1个循环,共31~34个循环;72℃8min;12℃12sec;
所述电泳指,将所述PCR反应产物置于添加了质量比为0.8~1.5%的琼脂糖凝胶中,在5V/cm电压下电泳40~55分钟;所述琼脂糖凝胶中添加有体积比0.005%的核酸染料;
所述核酸染料选自:EB、GelGreen、SYBR GreenⅠ、GoldView、GelRed和GelGreen。
所述模板可以是固定在固体载体上的人体血液和或体液和或胚胎的遗传物质,例如滤纸片干血斑样品、滤纸片干羊水样品、滤纸片干浆膜腔液样品、滤纸片干关节液样品、滤纸片干唾液样品、滤纸片干胚胎遗传物质样品等。
滤纸片是液体标本采集和运输的极好载体。全血滴在滤纸片上制成滤纸片干血斑(Dried blood spots,DBS),有很好的生物稳定性和安全性,便于储存和运输。随着我国产前筛查、新生儿筛查力度的不断增强,特别是当筛查范围扩大到一些地域偏远、医疗条件相对落后的地区时,应用滤纸干血斑(DBS)对于患者标本采集、保存和运输及流行病学调查则更为有利。
所述人体体液选自下述物质的一种或多种:羊水、胚胎绒毛组织、浆膜腔液、关节液、唾液等;所述血液包括外周血、脐带血、末梢血;所述胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞。
所述的引物组,和/或,所述的芯片,和/或,所述的试剂盒在制备缺失型α与β地中海贫血检测试剂方面的用途,其特征在于,在标有缺失型α与β地中海贫血检测用途的包装内放入所述引物组,和/或,在装有所述引物组的容器上标有缺失型α与β地中海贫血检测用途。
本发明提供检测试剂盒由PCR试剂、以尼龙膜为载体的低密度芯片、杂交试剂三部分组成。包括(1)一个基因芯片,其上带有探针;(2)分别包含多重直接PCR的引物的PCR反应液I与PCR反应液Ⅱ;(3)杂交试剂。
所述基因芯片由硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等材料制成的膜、点在膜上的探针由检测α和β-Globin基因突变位点的特异性探针组成,其特征在于特异性探针包括基底和固定于所述基底上的探针,所述特异性寡核苷酸探针序列如下:
用于检β-地中海贫血基因所对应的正常基因和突变基因位点特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:1-25;
用于检测α-地中海贫血非缺失基因所对应的正常基因和突变基因位点特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ ID NO:26-31;
用于检测α-地中海贫血缺失基因的特异性寡核苷酸探针,其碱基序列如SEQ IDNO:33-36;显色体系控制探针,其碱基序列如SEQIDNO:32
优选的,上述的α和β地中海贫血基因检测的核酸膜条中所述基底为尼龙膜。
本发明的另一技术方案为提供一种α和β地中海贫血基因检测的试剂盒,所述试剂盒包括:特异性扩增非缺失型α-地中海贫血基因与β-地中海贫血基因引物组:
APF:SEQ ID NO:37;
APR:SEQ ID NO:38;
B1F:SEQ ID NO:39;
B1R:SEQ ID NO:40;
B2F:SEQ ID NO:41;
B2R:SEQ ID NO:42;
特异性扩增缺失型α-地中海贫血基因引物组
SEAF:SEQ ID NO.43
SEAR:SEQ ID NO.44
THAIF:SEQ ID NO.45
THAIR:SEQ ID NO.46
4.2F:SEQ ID NO.47
4.2R:SEQ ID NO.48
3.7F:SEQ ID NO.49
3.7R:SEQ ID NO.50
本发明所述的快速检测α和β地中海贫血等位基因的试剂盒还包括一些现有试剂盒中常规且必须的组分,如缓冲液、酶液、MgCl2和dNTP等。具体地,酶液为Taq聚合酶体系,包括可用于直接PCR法的热启动酶体系等;所述缓冲液为可用于血液直接PCR缓冲液;当酶液选择采用宝生物工程(大连)有限公司所生产的MightyAmpTM DNA Polymerase时,缓冲液则优选为与MightyAmpTM DNA Polymerase配套的缓冲液。
优选的,上述α和β-地中海贫血的基因检测试剂盒中,所述用于多重直接PCR反应液I与PCR反应液Ⅱ按每人份含量由以下组份分别组成配方:表1与表2:
表1 PCR反应液I配方与反应条件(引物工作浓度10μmol/L,MightyAmp DNAPolymerase为1.25U/μL)
表2 PCR反应液Ⅱ配方与反应条件(引物工作浓度10μmol/L,MightyAmp DNAPolymerase为1.25U/μL)
本发明上述的试剂盒,所述引物的5′端标记有生物素或其它基团的标记,使得扩增的产物中含有相应的标记,以便在杂交后对杂交结果进行分析。
本发明上述的试剂盒,所述基因芯片包括用于定位探针的位置标记。
本发明上述的试剂盒,用于该核酸杂交膜条的基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底,例如玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、微缩磁珠等。所述基因芯片的探针是固定在膜条上。优选的,固定寡核苷酸探针的基底为尼龙膜。
本发明上述的试剂盒,所述杂交试剂包括用于杂交的杂交I液、杂交II液、杂交Ⅲ液、酶、显色液组成。核酸杂交的反应温度是45℃~54℃,其最佳反应温度为48℃~52℃。
本发明所述试剂盒基于Direct PCR的快速检测26种地贫类型,7种α地贫突变和19种β地贫突变位点的基因,包括常见的7种α-地贫,4种α-珠蛋白基因缺失(--SEA、--THAI、-α4.2、-α3.7)和3种突变型(HbQS、HbWS、Hb CS);19种β-地贫常见的β-珠蛋白基因突变-32(C>A)、-30(T>C)、(-28(A>G)、-29(A>G)、Cap+40-43(-AAAC)、Int(T>G)、CD14/15(+G)、CD17(A>T)、βE(G>A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、CD41/42(-TTCT)、CD43(G>T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G>T)、IVS-I-5(G>C)、IVS-II-654(C>T)、CD37(G>A)、IVS-II-5(G>C))。
采用该试剂盒地中海贫血等位基因的方法包括以下步骤:
1)样本采集及PCR模板的制备:a)样本采集:标本来源于抗凝外周血,DBS样本、胚胎绒毛组织、羊水、脐带血、末梢血、类似DBS处理的样本、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞、多个细胞或单个细胞等;b)PCR模板的制备:上述标本直接作为模板,也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。
2)配制PCR反应体系,具体为:
直接将样本(如外周血)或者样本提纯DNA加入PCR反应液、水和配制成反应体系;
3)样本检测:抗凝外周血,DBS样本、绒毛、羊水或脐带血、胚胎的遗传物质等标本直接作为模板,也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板配制的反应体系与反应条件进行PCR扩增,得到扩增产物。优选的反应体系与反应条件见表1与表2。
4)膜芯片的制作
经活化液预处理尼龙膜30分钟后,激活表面羧基;同时,将自行设计合成的的探针(5’或3’端带有氨基标记)用探针稀释液调节到适当的浓度后,按DNA芯片阵列顺序点加于尼龙膜相应位置上,此时,氨基与活化的羧基发生反应生成稳定的共价键而固定探针在尼龙膜表面;最后,用封闭液处理尼龙膜,封闭未结合探针的表面羧基,完成膜芯片制备并低温保存。
5):杂交
将扩增产物与固定在膜芯片上的探针进行杂交,杂交温度与探针和PCR扩增片段长度、盐浓度、甲酰胺、GC含量等有关。在本发明的体系中48℃孵育1.5~4小时后可获得满意的杂交结果。
6):非特异性结合物的洗脱
利用不同的洗脱条件,如温度、盐浓度等最大限度的去除非特异性杂交。
7)显色反应
5’端带有的生物素PCR产物与标记有过氧化物酶(POD)的链霉亲和素(链霉抗生物素蛋白)特异结合,并在过氧化氢和棕色底物TMB(四甲基联苯胺)的作用下发生显色反应,膜条上对应探针位置呈现蓝色斑点。
8)检测结果判读
检测结果可以直接经肉眼观察判读。也可经阅读仪扫描阅读后,对信号与背景由相应的软件系统分析获得最终的杂交结果,并自动对结果进行保存和统计。
本发明最关键的构思在于:基于直接多重PCR、Gap-PCR和反向点杂交相结合的检测原理,根据各基因型的突变或缺失位点设计相应的扩增引物和探针,以生物素标记引物,以氨基标记探针,并以基因芯片为基底,将探针固定在DNA芯片上,通过特异性引物扩增出来的PCR产物与探针进行杂交,以信号显色盒判读来进行地贫的诊断。
本发明采用直接PCR法闭管扩增7种α-地贫和19种β-地中海贫血突变。在同一条件下进行RDB试验,可以减少操作步骤,节约时间、人力、仪器和试剂成本,减少实验室污染,避免核酸抽提致使标本间交叉污染或DNA降解,降低漏检和/或误检率。
本发明所述地中海贫血基因检测试剂盒可以直接快速检测7种α地贫突变和19种β地贫突变位点。无需核酸提取,减少污染,节约人力和试剂成本,节约时间约1-2h。PCR扩增时间2.5h,比其他方法节约1h,与其他同类比,节约仪器和试剂成本。因此,本发明试剂盒具备检测时间短、成本低、操作方便,闭管操作,减少污染,对开展地贫人群筛查,遗传咨询和产前诊断具有重大的意义。
附图说明
图1为本发明的基因芯片上探针的具体分布位置的图片,每个位置代表不同的基因突变。注:N:正常野生型检测探针,M:突变检测探针。CC为显色控制点。相应正常参照见表8。
图2琼脂糖凝胶电泳检测。M:50bp DNA Ladder(MD108)(TIANGEN);泳道1:阴性对照;泳道2:多重PCR扩增产物(目的带)。PCR反应液Ⅰ加入模板经PCR扩增,扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果参见附图2,从电泳结果可以观察到成功扩增出三条目的带:扩增条带片段长度分别为658bp、528bp、306bp。
图3.琼脂糖凝胶电泳检测。M1:1kb DNA Ladder(Dye Plus)(Takara CodeNo.3426A);M2:DNA Ladder(亚能生物);泳道1与3:阴性对照;泳道2:--THAI目的带;泳道4与6:--SEA目的带;泳道5与7:-α4.2目的带;泳道8:-α3.7目的带。PCR反应液Ⅱ分别加入不同基因型模板经PCR扩增,扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果参见附图3,从电泳结果可以观察到成功分别扩增出目的带:扩增条带片段长度分别约为2.1kb(-α3.7)、1.5kb(-α4.2)、1.3kb(--SEA)、1.1kb(--THAI目的带)。
图4为本发明一个实施例地中的海贫血检测结果:(1)βN/βN,αα/αα;(2)βN/βN,--SEA/αα;(3)βN/βN,--THAI/αα;(4)βN/βN,-α3.7/αα;(5)βN/βN,-α4.2/αα;(6)β-30/βN,αα/αα;(7)β-28/βN,αα/αα;(8)β-29/βN,αα/αα;(9)β37(/βN),αα/αα;(10)βCAP(/βN),αα/αα;(11)β-32/βN,αα/αα;(12)β41-42/βN,αα/αα;(13)β43/βN,αα/αα;
图5为本发明另一个实施例地中的地中海贫血检测结果:(14)β17/βN,αα/αα;(15)β14-15/βN,αα/αα;(16)βE/βN,αα/αα;(17)β27-28/βN,αα/αα;(18)β654/βN,αα/αα;(19)β31(/βN),αα/αα;(20)β71-72/βN,αα/αα;(21)βintM(/βN),αα/αα;(22)βIVSⅡ-5(/βN),αα/αα;(23)βIVS1-1(/βN),αα/αα;(24)βIVS1-5(/βN),αα/αα;(25)βN/βN,αα/ααWS;(26)βN/βN,αα/ααQS;(27)βN/βN,αα/ααCS
备注:由于一些少见类型地贫未设计对照,只能报告是否有突变。βM(/βN)表示有“M”这种类型β突变类型,是杂合子还是纯合子β突变需要进一步分析。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果,以下结合实施方式予以说明。实施例中使用的组分,除特殊说明外,均选用发明内容中的优选方案。
仪器设备
PCR反应所用仪器:PCR热循环仪,如ABI热循环仪、Bio-Rad热循环仪C1000或者T100或者杭州晶格基因扩增PCR仪等。
试剂与耗材
DNA Ladder(Dye Plus)购自Takara公司,货号:Takara Code No.3424A;
MightyAmpTM DNA Polymerase与MightyAmpTM DNA Polymerase配套的缓冲液均购自宝生物工程(大连)有限公司;
生物材料的来源
本发明实施例中使用的所有与人体相关的血液/体液样本,如:抗凝外周血、脐带血、羊水、脐血或绒毛等生物样本来自广西壮族自治区人民医院。
实施例1:采用本发明所述试剂盒标本来源及PCR模板类型
1.1 样本采集及PCR模板的制备:a)样本采集:标本来源于抗凝外周血,DBS样本、胚胎绒毛组织、羊水或脐带血、胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞等;b)PCR模板的制备:上述标本直接作为模板,也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。
1.2 DBS样本制备
上述1.1滤纸片干血斑样品(DBS)采集与制备如下:
①、使用Whatman903滤纸片(或者普通滤纸片)。在滤纸片上标记受检者编号和收集日期。②、末梢血和抗凝血均可用于滤纸片干血斑样品制作。如果从末梢血制备滤纸片干血斑,采集部位为足弓、耳垂或手指。用70%乙醇或酒精棉消毒采血部位,用消过毒的针头小心刺破皮肤。弃去第一滴末梢血。将第二滴血点在滤纸片中央的圆圈内,大约每孔需要50~80μl全血,保证滴满圆圈。每个样品应点满一张滤纸片的每个孔。如从抗凝血制备滤纸片干血斑,移液器吸取50~80μl抗凝血血样,对准滤纸片印圈的中心处,将血样滴在滤纸上。应滴满一张滤纸片的每个孔。③、血液滤纸片于室温下自然干燥至少4小时(在潮湿气候下至少24小时),不要加热血片或将他们堆叠在一起,干燥过程中不要与其它界面接触。在滤纸片血斑充分干燥后,将滤纸片放入密封袋中,避免滤纸之间标本的相互污染。④、完整包装的DBS样品可在室温下避光储存2周。未及时检测的DBS样品存放冰箱在-20℃或以下待检。
本实施例中的DBS样品还可以替换成:滤纸片干羊水样品、滤纸片干浆膜腔液样品、滤纸片干关节液样品、滤纸片干唾液样品、和/或滤纸片干胚胎的遗传物质样品、和/或滤纸片干基因组DNA样品,上述各滤纸片干体液/DNA样品制备方法同DBS样品的常规制备方式(如上所述),并且,采用相同的引物组、相同的PCR方法能获得相同的实验结果,本文中不再一一赘述。
实施例2.用于PCR扩增的特异性引物的设计及PCR反应体系确定
1.1 引物设计
从GenBank数据库中获取α-珠蛋白和β-珠蛋白基因序列,根据α-珠蛋白和β-珠蛋白基因涵盖突变区域分别设计1个引物组用于PCR扩增,其中3对引物组合置于同一个反应管中进行直接多重PCR,同时扩增α-地贫非缺失突变与β-地贫基因基因突变;另外一个引物组亦同时置于另一个反应管中进行直接多重PCR扩增缺失型α-地贫;引物由专业生物公司合成。引物序列如表3,
表3PCR反应液Ⅰ与PCR反应液Ⅱ中特异性引物
1.2 多重PCR反应体系的确定
利用正交试验方法,通过大量的实验对比,通过大量实验对比,最终确定最优的PCR反应液Ⅰ与PCR反应液Ⅱ配方及体系(引物工作浓度10μmol/L,MightyAmp DNAPolymerase为1.25U/μL)见表4与表5:PCR反应液18μl,外周血(绒毛、羊水或脐带血)加样量2μl,DBS样本1-3片(直径1-2mm)(补水2μl),反应总体积为20μl。
本实施例中:
所述PCR的反应体系为:1~4μl模板、各引物:0.05~1μmol/L、MgCl2浓度为1.5~5mM/L、dNTP的浓度为100~500μM/L、DNA聚合酶的浓度为1~4U/反应;
或者,所述β引物组的PCR的反应体系为:1.25U/μL MightyAmp Taq 0.1~1μl、2×MightyAmp Buffer 10μl、10μmol/L B1F 0.1~1μl、10μmol/L B1R 0.1~1μl、10μmol/LB2F 0.1~1μl、10μmol/L B2R 0.1~1μl、10μmol/L APF 0.1~1μl、10μmol/L APR 0.1~1μl、模板1~9.3μl;
所述β引物组的PCR的反应体系优选为:MightyAmp Taq 0.5μl、2×MightyAmpBuffer 10μl、B1F 0.25μl、B1R 0.25μl、B2F 0.5μl、B2R 0.5μl、APF 0.35μl、APR 0.35μl、模板7.3μl;
所述β引物组各引物摩尔浓度比例如下:B1F∶B1R∶B2F∶B2R∶APF∶APR=5∶5∶10∶10∶7∶7;
所述β引物组的PCR的反应程序为:95℃3-5分钟;以94℃30秒、55℃~61℃30~35秒、72℃30~35秒秒为1个循环,进行30~36个循环;72℃5分钟;12℃12秒
β引物组的PCR反应程序优选为:95℃5min;以94℃30sec、58℃30sec、72℃35sec为1个循环,共34个循环;72℃5min;12℃12sec;
所述α引物组的PCR反应体系为:MightyAmp Taq 0.1-1μl、2×MightyAmp Buffer10μl、3.7F 0.1-1μl、3.7R 0.1-1μl、4.2F 0.1-1μl、4.2R 0.1-1μl、SEA-F 0.1-1μl、SEA-R0.1-1μl、THAI-F 0.1-1μl、THAI-R 0.1-1μl、模板1-9.1μl;
所述α引物组的PCR反应体系优选为:MightyAmp Taq 0.5μl、2×MightyAmpBuffer 10μl、3.7F 0.2μl、3.7R 0.2μl、4.2F 0.2μl、4.2R 0.2μl、SEA-F 0.2μl、SEA-R 0.2μl、THAI-F 0.2μl、THAI-R 0.2μl、模板7.9μl;
所述β引物组各引物摩尔浓度比例如下:3.7F∶3.7R∶4.2F∶4.2R∶SEA-F∶SEA-R∶THAI-F∶THAI-R=1∶2∶1∶1∶1∶1∶1∶1;
α引物组的PCR反应程序优选为:95℃5min;以94℃30sec、61~64℃45sec~60sec、72℃130sec为1个循环,共31~34个循环;72℃8min;12℃12sec;
表4 多重直接PCR反应液Ⅰ配方体系与条件
表:5多重直接PCR反应液Ⅱ配方体系与条件
1.3 多重PCR扩增程序的确定
经过大量实验对比优化,控制退火温度和退火时间可以做到特异性好,扩增效率高,最终确定的最佳扩增程序见表4与表5。
PCR反应液Ⅰ加入模板经PCR扩增,扩增产物经2%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果参见附图2,从电泳结果可以观察到成功扩增出三条目的带:扩增条带片段长度分别为658bp、528bp、306bp。
PCR反应液Ⅱ分别加入不同基因型模板经PCR扩增,扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,检测结果参见附图3,从电泳结果可以观察到成功分别扩增出目的带:扩增条带片段长度分别约为2.1kb(-α3.7)、1.5kb(-α4.2)、1.3kb(--SEA)、1.1kb(--THAI目的带)。
实施例3:寡核苷酸探针的设计、点样和固定
3.1.探针的设计及筛选
从GenBank数据库中获取α-珠蛋白基因序列,根据α与β-地贫基因突变区域设计特异性识别α-地贫7种突变(QS、CS、WS、--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2)和19种β地贫基因突变的寡核苷酸探针组合;并设计显色对照探针(CC)(表6与表7)。由专业生物公司合成。
表6 β-地贫基因突变区域特异性探针
表7 α-地贫基因突变区域特异性探针
3.2.基因芯片的制备。
本发明所述基因芯片的制备方法,包括如下步骤:
(1)寡核苷酸探针的工作液的配制:将合成好的寡核苷酸探针用探针稀释液(pH8.4的0.5M Na2CO3和0.5M NaHCO3的溶液)混合稀释成工作液(10μM),以备点样用。
(2)固定探针:尼龙膜浸泡于10%的EDAC溶液中活化30分钟,纯水洗涤3次,每次2分钟,然后室温晾干。通过微量移液设备将上述制备好的探针分别点在在活化处理好的尼龙膜上,每滴0.5μL。点膜结束后,将膜放置于室温30分钟,进行反应。膜条上的探针序列如表6与7所示。特异性探针中用于检测没有发生突变的位点为正常探针(用N表示),用于检测发生突变的位点为突变探针(用M表示),膜条上的探针排列顺序如图1所示,由斑点显现的位置即可判断结果。检测的位点突变与正常对照关系如表8所示。检测位点包括α-突变:非缺失(αCSα、αQSα、αWSα)与缺失型(--SEA、--THAI、-α3.7和-α4.2);检测位点还包括β-突变(19种β地贫基因突变)(-32(C>A)、-30(T>C)、(-28(A>G)、-29(A>G)、Cap(-AAAC)、Int(T>G)、CD14/15(+G)、CD17(A>T)、βE(G>A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、CD41/42(-TTCT)、CD43(G>T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G>T)、IVS-I-5(G>C)、IVS-II-654(C>T)、CD37(G>A)、IVS-II-5(G>C))。
表8 检测的位点突变与正常对照关系
(3)制备基因芯片:利用氢氧化钠停止反应,制得基因芯片。将膜转入0.1M NaOH溶液中浸泡10分钟,停止反应。并用蒸馏水充分洗涤,室温晾干后保存于4℃备用。即制得基因芯片。
实施例4:杂交条件的确定、显色反应及结果判断。
将待测样品或样品DNA直接用直接PCR反应液及在相应扩增条件进行PCR反应扩增,其扩增产物用于反向斑点杂交。反向斑点杂交过程包括以下几个步骤:核酸杂交、结合的核酸与酶交联及非特异性结合核酸的洗脱、与酶底物结合显色、杂交结果分析。下面详细说明各步骤的操作。
4.1 杂交
标有样品编号的膜条置入15ml塑料离心管,加入杂交I液(2×SSC、0.1%SDS)5-6ml及PCR反应液中部分或者所有(5-20μL)PCR产物,拧紧管盖。将离心管放入沸水浴中加热10分钟,取出拧紧盖子,放入杂交箱48℃杂交1.5小时以上,但不超过4小时。
取50ml塑料管,加入40ml杂交II液(0.5×SSC、0.1%SDS)于杂交箱(或者恒温水浴箱)中进行预热至48℃。
4.2 洗膜
取出膜条,移至装有预热杂交II液的50ml管中,于48℃轻摇洗涤15分钟(每管40ml溶液,最多可同时洗涤4张膜)。
4.3 显色
按杂交I液:POD=2000:1配制孵育液,室温轻摇浸泡30分钟,弃去POD溶液。用杂交I液室温轻摇洗两次,每次5分钟。室温用C液洗膜1-2分钟,同时新鲜配制显色液。将膜条浸泡于显色液中避光显色6至12分钟即可观察结果。
4.4 结果判读
(1.1)杂交结果分析
弃去显色液,用蒸馏水洗涤两次,每次2-3分钟。吸水纸吸干基因芯片表面的水,肉眼直接判读结果或者在扫描仪上扫描记录结果。
(1.2)结果读取基本方式
膜条上相应探针位置显蓝色,说明膜条有相应信号;膜条上的突变位点有信号,说明待检样品含有该类型突变;若该突变位点对应的正常对照也有信号,说明待检样品为该类型突变的杂合子;若该突变位点对应的正常对照没有信号,说明待检样品为该类型突变纯合子或单体型。
(1.3)质量控制
(1.31)阴性对照(以水代替样本)进行杂交,膜条上除CC位置显示蓝色外若有杂交斑点,提示为实验有污染,实验结果无效。
(1.32)样品膜条上没有一个斑点,该样品实验无效。
(1.33)CC位置不显示蓝色,说明显色系统有问题,询查试剂问题。
实施例5:试剂盒简要说明及具体实验方法
5.1 试剂盒主要成份
(1)基因芯片,其上带有检测正常与突变位点探针及阴阳性对照探针及空白对照;(2)用于直接扩增的PCR反应液含多重PCR的引物;(3)杂交试剂如POD、TMB及30%H2O2。
本检测需要用到的其他主要试剂
10%SDS:20g SDS用180ml纯水溶解,用1N HCl调pH值至pH 7.0,最后定容至200ml。常温保存。
20×SSC:175.3g NaCl、88.2g柠檬酸钠用750ml纯水溶解,用浓盐酸调pH值至pH7.0,最后定容至1000ml,并高压灭菌保存。常温保存。
1M柠檬酸钠:294g柠檬酸钠用700ml溶解,用浓HCl调pH值至pH 5.0,最后定容至1000ml。常温保存。
杂交试剂由杂交I液、杂交II液、Ⅲ液、酶、显色液组成,其中杂交I液的组成为1~6×SSC,0.1%~1%SDS,其中优选的方案是2×SSC,0.5%SDS;杂交II液的组成为0.1~1×SSC,0.1%~1%SDS,其中优选的方案是0.5×SSC,0.5%SDS。酶为辣根过氧化物酶(Streptavidin-POD),用量为0.005~1U/ml,优选的用量为0.1U。与之相匹配的显色系统,辣根过氧化物酶的显色底物可以是3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,简称TMB),显色液优选的方案为0.1M柠檬酸钠(pH 4.9),0.42mMTMB,0.004%H2O2(v/v)。
杂交I液:100ml 20×SSC,10ml 10%SDS加纯水定容至1000ml。常温保存。
杂交II液:25ml 20×SSC,10ml 10%SDS加纯水定容至1000ml。常温保存。
杂交Ⅲ液:100ml 1M柠檬酸钠加纯水定容至1000ml。常温保存。
显色液:19ml C液加入1ml TMB和2μl 30%H2O2。
5.2 PCR反应所用仪器:Bio-Rad热循环仪C1000或者T100或者杭州晶格基因等普通PCR扩增仪。
5.3 样本采集及PCR模板要求:
a)样本采集:标本来源于抗凝外周血、DBS样本、绒毛、羊水、脐带血或其他体液标本等;b)PCR模板要求:上述标本直接作为模板,也可以采用上述标本经核酸提取的DNA作为模板。
c)血样保存:抗凝全血或脐带血、绒毛、羊水或其他体液标本等在室温放置不超过24小时,DBS样本在室温放置不超过2周,2~8℃保存不超过7-15天,-20℃以下保存不超过1-2年,-70℃可长期保存,冷冻保存时应避免反复冻融。
d)样品运输:抗凝全血或脐带血、绒毛、羊水或其他体液标本等运输时需用冰壶或加有冰袋的泡沫箱密封,应保证冰袋不化冻,且在途时限不宜超过72小时。DBS样本可以室温(不宜超过30℃)运输或运输时需用冰壶或加有冰袋的泡沫箱密封,且在途时限不宜超过72小时。
5.4 检验方法
5.4.1 PCR扩增
从冰箱取出试剂盒,并从中取出所需PCR反应液,室温平衡溶解,在管壁上做好标记,于5000-10000rpm离心2-4秒,而后向PCR反应液中直接加入样本或者已提取的待测样品DNA 1-4μL,反应总体系为20μL。
每次实验另取一管PCR反应液,以2μL纯水为模板,作阴性对照。
PCR按以下条件进行扩增,优选的,表1:
5.4.2 杂交
标有样品编号的膜条置入15ml塑料离心管,加入杂交I液(2×SSC、0.1%SDS)5-6ml及PCR反应液中部分或者所有(5-20μl)PCR产物,拧紧管盖。将离心管放入沸水浴中加热10分钟,取出拧紧盖子,放入杂交箱48℃杂交1.5小时以上,但不超过4小时。
取50ml塑料管,加入40ml杂交II液(0.5×SSC、0.1%SDS)于杂交箱(或者恒温水浴箱)中进行预热至48℃。
5.4.3 洗膜
取出膜条,移至装有预热杂交II液的50ml管中,于48℃轻摇洗涤15分钟(每管40ml溶液,最多可同时洗涤4张膜)。
5.4.4 显色
按杂交I液:POD=2000:1配制孵育液,室温轻摇浸泡30分钟,弃去POD溶液。用杂交I液室温轻摇洗两次,每次5分钟。再用杂交Ⅲ液室温洗涤膜条1-2分钟,同时新鲜配制显色液。将膜条浸泡于显色液中避光显色6至12分钟即可观察结果。
5.4.5 杂交结果分析
弃去显色液,用蒸馏水洗涤两次,每次2-3分钟。吸水纸吸干基因芯片表面的水,依据表8,判定方法同实施例4,肉眼直接判读结果或者在扫描仪上扫描记录结果。
实施例6.采用本发明所述试剂盒在已知基因型样本中的检测结果
1、试剂盒的组成:
同实施例5。
2、实施方法:
采用双盲实验,其他同实施例5。
3、样本来源:
所有样本均来源自经第三方提供的常规Gap-PCR技术确定基因型(研究者不知道)不同类型样本。
4、数据分析及结果判定:依据表8,判定方法同实施例4,肉眼直接判读结果或者在扫描仪上扫描记录结果。本实施例的结果如图4和图5所示。
本发明的各实施例中的检测样本也可以采集人体体液或人体基因组DNA作为PCR反应模板,所述人体体液选自下述物质的一种或多种:羊水、胚胎绒毛组织、浆膜腔液、关节液、唾液;采用上述体液样品中的任一种,或者采用人体基因组DNA,通过本发明所提供的引物组或试剂盒,采用相同的PCR方法,能获得同样的实验结果,达到同样的检测目的,本文不再一一赘述。
实施例7.本发明的产品性能验证
产品性能指标
1 测定准确性
收集10份阴性样本和32份地贫样本,选择低、中、高3个浓度,每个浓度重复3次,分别用3批产品来检测,分别计算阴性和阳性符合率。结果显示相应的基因型,研究结果与与采用深圳益生堂生物企业有限公司和/或亚能生物技术(深圳)有限公司的地中海贫血基因诊断试剂盒(PCR法)试剂盒检测结果完全符合,产品阳性符合率和阴性符合率都达100%。
2 分析灵敏度
采用本发明试剂盒对地贫检测位点进行灵敏度分析,每个样本包含7个浓度梯度,确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度为10ng/μL;
3 分析特异性
通过干扰筛查试验,临床正常剂量的EDTA、枸橼酸钠不是本品的干扰物质;溶血样本不会干扰本试剂盒检测结果;脂血样本中甘油三酯(14.1mmol/L)和黄疸样本(360.4mmol/L)对本品检测无干扰。
用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本,包括1例α-地贫与β-地贫阴性样本、2例缺铁性贫血临床样本、3例G-6-PD临床样本,1例感染弓形虫的全血样本,1例感染衣原体的全血样本,均无交叉反应。
4 重复性
采用本发明试剂盒不同批号产品,不同人(2人)操作,同一天做2次,共做2天,每个参考品每次试验重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型,结果显示一致。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换,或直接或间接运用在相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 陈治中
<120> 用于基因分型检测α与β地中海贫血的引物组、芯片及试剂盒
<130> P170157/CZZ
<160> 50
<170> PatentIn version 3.5
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<220>
<223> CD(βE)26M
<400> 12
gttggtggta aggccctg 18
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<211> 16
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<213> artificial sequence
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<223> CD27-28M
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<213> artificial sequence
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<223> IVS-I-1GTM
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<212> DNA
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gaggttcttt tagtcctttg g 21
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<223> CD71-72+AM
<400> 21
tcggtgcctt taagtgatg 19
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<220>
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<223> IVS-II-654M
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tattgctatt accttaaccc ag 22
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<223> IVS-II-5M
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tcagggtgac tctatggga 19
<210> 25
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<223> CD37M
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ctacccttag acccagagg 19
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<223> WSN
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<220>
<223> QSN
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aacttgtcca gggaggcg 18
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> CSN
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caaataccgt taagctggag cct 23
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<213> artificial sequence
<220>
<223> WSM
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ggaggcctgc accgc 15
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<211> 15
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> QSM
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cgcctccccg gacaa 15
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<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> CSM
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ccaaataccg tcaagctgga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> CC
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cacatcacac actctgcgac 20
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<212> DNA
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<223> SEA
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<212> DNA
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<223> THAI
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gcggctcaag ggctcag 17
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catgcctgta aacccaccta ct 22
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<220>
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gggatttaac tcaacaggc 19
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<223> APF
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accctcttct ctgcacagct cc 22
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<220>
<223> APR
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tccattgttg gcacattccg 20
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<213> artificial sequence
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<223> B1F
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acggctgtca tcacttagac ctca 24
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<213> artificial sequence
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<223> B1R
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aggggaaaga aaacatcaag cg 22
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<212> DNA
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<223> B2F
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cctaatctct ttctttcagg gcaat 25
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<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> B2R
<400> 42
ttaggcagaa tccagatgct caag 24
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
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<223> SEAF
<400> 43
ccttcaccct cccacagttc c 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
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<223> SEAR
<400> 44
cgtcaccctc agagccatca c 21
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<212> DNA
<213> artificial sequence
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<223> THAIF
<400> 45
tgcggtcagc agcacttcc 19
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<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
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<223> THAIR
<400> 46
tcaccaccac ctgtgtagga gtg 23
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<213> artificial sequence
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<223> 4.2F
<400> 47
tgcttttgtg agtgctgtgt tgac 24
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<213> artificial sequence
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aggcggagtt tcgctgttgt 20
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<220>
<223> 3.7F
<400> 49
cccctgtcct ttccctaccc 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 3.7R
<400> 50
ggagtgggac ttctctgacc tacc 24
Claims (10)
1.用于检测α与β地中海贫血的引物组,包括α引物组,和β引物组;所述α引物组包括如下引物对:
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的APF/APR;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的SEAF/SEAR;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的THAIF/THAIR;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的4.2F/4.2R;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的3.7F/3.7R;
所述β引物组包括如下引物对:
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的APF/APR;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的B1F/B1R;
上下游引物序列分别如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的B2F/B2R。
2.根据权利要求1所述的引物组,其特征在于,所述检测指以人体血液和/或体液和/或人体基因组DNA为模板,用所述引物组进行PCR扩增后,将所得扩增产物进行电泳和/或测序即可获知结果。
3.用于基因分型检测α与β地中海贫血的芯片,包括如下特异性探针:
用于检测β-地中海贫血基因所对应的正常基因和突变基因位点的特异性寡核苷酸探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1-25;
用于检测α-地中海贫血非缺失基因所对应的正常基因和突变基因位点的特异性寡核苷酸探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO:26-31;
用于检测α-地中海贫血缺失基因的特异性寡核苷酸探针,其核苷酸序列如SEQ ID NO:33-36。
4.根据权利要求3所述的芯片,其特征在于,还包括:显色体系控制探针,其碱基序列如SEQ ID NO:32。
5.根据权利要求3或4所述的芯片,其特征在于,还包括:用于固定各探针的基底,;对应各核苷酸序列的每条探针被固定在所述基底上,形成所述芯片。
6.根据权利要求5所述的芯片,其特征在于,所述基底选自玻璃片、硅胶晶片、尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、微缩磁珠;优选为尼龙膜。
7.用于快速检测缺失型α与β地中海贫血基因型的试剂盒,包括权利要求1或2所述的引物组,及权利要求3-6任一所述的芯片。
8.根据权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述快速检测指,直接以人体体液和/或血液和/或胚胎的遗传物质做为模板,用所述引物组进行PCR扩增后,将所得扩增产物滴加至所述芯片上进行杂交发生显色反应可获知结果。
9.根据权利要求7或8任一所述的试剂盒,其特征在于,还包括用于进行PCR和/或电泳的试剂。
所述用于进行PCR的试剂包括dNTP、DNA聚合酶、缓冲液、双蒸水、MgCl2;
所述用于进行电泳的试剂包括琼脂糖、蒸馏水、核酸染料;
所述核酸染料优选溴化乙锭;
所述PCR的反应体系为:1~4μl模板、各引物:0.05~1μmol/L、MgCl2浓度为1.5~5mM/L、dNTP的浓度为100~500μM/L、DNA聚合酶的浓度为1~4U/反应;
或者,所述β引物组的PCR的反应体系为:1.25U/μL MightyAmp Taq 0.1~1μl、2×MightyAmp Buffer 10μl、10μmol/L B1F 0.1~1μl、10μmol/L B1R 0.1~1μl、10μmol/LB2F 0.1~1μl、10μmol/L B2R 0.1~1μl、10μmol/L APF 0.1~1μl、10μmol/L APR 0.1~1μl、模板1~9.3μl;
所述β引物组的PCR的反应体系优选为:MightyAmp Taq 0.5μl、2×MightyAmp Buffer10μl、B1F 0.25μl、B1R 0.25μl、B2F 0.5μl、B2R 0.5μl、APF 0.35μl、APR 0.35μl、模板7.3μl;
所述β引物组各引物摩尔浓度比例如下:B1F∶B1R∶B2F∶B2R∶APF∶APR=5∶5∶10∶10∶7∶7;
所述β引物组的PCR的反应程序为:95℃3-5分钟;以94℃30秒、55℃~61℃30~35秒、72℃30~35秒秒为1个循环,进行30~36个循环;72℃5分钟;12℃12秒;
β引物组的PCR反应程序优选为:95℃5min;以94℃30sec、58℃30sec、72℃35sec为1个循环,共34个循环;72℃5min;12℃12sec;
所述α引物组的PCR反应体系为:MightyAmp Taq 0.1-1μl、2×MightyAmp Buffer 10μl、3.7F 0.1-1μl、3.7R 0.1-1μl、4.2F 0.1-1μl、4.2R 0.1-1μl、SEA-F 0.1-1μl、SEA-R0.1-1μl、THAI-F 0.1-1μl、THAI-R 0.1-1μl、模板1-9.1μl;
所述α引物组的PCR反应体系优选为:MightyAmp Taq 0.5μl、2×MightyAmp Buffer 10μl、3.7F 0.2μl、3.7R 0.2μl、4.2F 0.2μl、4.2R 0.2μl、SEA-F 0.2μl、SEA-R 0.2μl、THAI-F0.2μl、THAI-R 0.2μl、模板7.9μl;
所述α引物组各引物摩尔浓度比例如下:3.7F∶3.7R∶4.2F∶4.2R∶SEA-F∶SEA-R∶THAI-F∶THAI-R=1∶2∶1∶1∶1∶1∶1∶1;
α引物组的PCR反应程序优选为:95℃5min;以94℃30sec、61~64℃45sec~60sec、72℃130sec为1个循环,共31~34个循环;72℃8min;12℃12sec;
所述电泳指,将所述PCR反应产物置于添加了质量比为0.8~1.5%的琼脂糖凝胶中,在5V/cm电压下电泳40~55分钟;所述琼脂糖凝胶中添加有体积比0.005%的核酸染料;
所述核酸染料选自:EB、GelGreen、SYBR GreenⅠ、GoldView、GelRed和GelGreen;
所述模板可以是固定在固体载体上的人体血液和或体液和或胚胎的遗传物质,例如滤纸片干血斑样品、滤纸片干羊水样品、滤纸片干浆膜腔液样品、滤纸片干关节液样品、滤纸片干唾液样品、滤纸片干胚胎遗传物质样品等;
所述人体体液选自下述物质的一种或多种:羊水、胚胎绒毛组织、浆膜腔液、关节液、唾液等;所述血液包括外周血、脐带血、末梢血;所述胚胎的遗传物质包括配子如精子或卵子、卵裂期胚胎的卵裂球、囊胚滋养外胚层细胞,即囊胚细胞。
10.权利要求1或2所述的引物组,和/或,权利要求3-6所述的芯片,和/或,权利要求7-9任一所述的试剂盒在制备缺失型α与β地中海贫血检测试剂方面的用途,其特征在于,在标有缺失型α与β地中海贫血检测用途的包装内放入所述引物组,和/或,在装有所述引物组的容器上标有缺失型α与β地中海贫血检测用途。
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