CN113249462A - 一种地中海贫血筛查试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种地中海贫血筛查试剂盒。本发明所述测试剂盒，包括一组用于多重PCR的引物、一组用于检测PCR产物的荧光探针和磁性多孔反应板，荧光探针包括磁性微球、连接在磁性微球表面的单链寡核苷酸分子信标和荧光素猝灭剂；单链寡核苷酸分子信标包括经化学反应性基团修饰的5’端，经荧光素分子修饰的3’端和位于5’端和3’端中间的茎‑环结构单链寡核苷酸链；检测时，经过PCR扩增的待测产物能与荧光探针上的单链寡核苷酸进行杂交，使得单链寡核苷酸分子信标的茎‑环结构打开，荧光素和猝灭剂分开，荧光分子发出荧光，在紫外光下就能直接进行观察，操作简单，快速，检测灵敏度高，检出率好。

Description

一种地中海贫血筛查试剂盒
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种地中海贫血筛查试剂盒。
背景技术
地中海贫血又名珠蛋白生成障碍性贫血，是一组遗传性溶血性贫血疾病。由于遗传的基因缺陷致使血红蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺失或不足，导致贫血。珠蛋白肽链的分子结构及合成是由α基因族和β基因族决定的，α基因族由ζ和α珠蛋白基因组成，β基因族由γ、δ、ε和β珠蛋白基因组成；正常人自父母双方各继承2个α珠蛋白基因合成足够的α珠蛋白链；自父母双方各继承1个β珠蛋白基因合成足够的β珠蛋白链，由于珠蛋白基因的缺失或点突变，珠蛋白肽链合成障碍导致地中海贫血的发病。
常见的珠蛋白基因缺陷包括缺失突变和点突变，缺失突变常见于α-地贫，目前已鉴定的α-地贫至少有36中，常见于中国人的有3种缺失型，(--SEA/)deletion、(-α3.7/)deletion、(-α4.2/)deletion，但是近来研究发现泰国缺失型地中海贫血(--THAI/)deletion在我国沿海地区出现了较多病例，而且常被误诊或漏诊，同时α-地贫也存在点突变，在中国人群中常见的为constant spring(CS),Quong Sze(QS)和westmead(WS)，点突变最主要存在于β-地贫，全世界已经报道170种左右的β珠蛋白基因突变，导致中国人群β-地贫发生的突变基因有23种，占中国人β-地贫突变基因总数的80％以上，在广东地中海贫血的基因携带者具有近千万，而且，如果夫妻二人均为相同类型的地中海贫血基因携带者，则有25％的几率生出重型或中间型地中海贫血患儿，对于已经患有地贫的儿童，难治疗，预后不好，如果能在出生前就做一些基因的筛查，实现地贫基因携带者的优生优育，无疑是非常有意义的。
在地中海贫血的基因检测中，由于杂交分析检测技术特异性高，因而被广为使用，对于地中海贫血既存在缺失突变又存在点突变，因此先PCR扩增再进行杂交是最合理的方式，自动化程度高，操作简单，成本低，但是现有技术中，对待检测基因进行PCR扩增后进行电泳、测序或者杂交，操作复杂，检测成本较高。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中地中海贫血筛查操作复杂，灵敏性低，成本高的缺点，提供了一种基于荧光探针的地中海贫血筛查试剂盒。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述地中海贫血筛查试剂盒，包括一组用于多重PCR的引物，一组用于检测PCR产物的荧光探针，和磁性多孔反应板，所述荧光探针包括磁性微球、连接在所述磁性微球表面的单链寡核苷酸分子信标和荧光素猝灭剂；所述单链寡核苷酸分子信标包括经化学反应性基团修饰的5’端，经荧光素分子修饰的3’端和位于5’端和3’中间的茎-环结构单链寡核苷酸链；未使用时，所述位于5’端和3’中间的茎-环结构单链寡核苷酸链互补链连接，荧光素和连接在所述磁性微球表面的荧光素猝灭剂鲜花靠近，发生能量转移而使得荧光素荧光猝灭，检测时，经过PCR扩增的待测产物能与荧光探针上的单链寡核苷酸进行杂交，使得单链寡核苷酸分子信标的茎-环结构打开，荧光素和猝灭剂分开，解放所述荧光探针上的荧光分子发出荧光，在紫外灯下或者荧光检测仪下就能直接进行观察，操作简单，快速，检测灵敏度高，检出率好；本发明所述地中海贫血筛查试剂盒还包括用于多重PCR的引物，能够进行单管反应，简化检测过称，本发明所述地中海检测试剂盒还包括磁性多孔反应板，所述磁性多孔反应板孔内涂覆有超顺磁材料，能够吸附所述带有磁性微球的单链寡核苷酸分子信标，进行杂交和洗涤，简化操作步骤，所述磁性多孔反应板可重复性使用，减少成本，使用荧光作为检测信号，灵敏度高。
2.本发明所述地中海贫血筛查试剂盒，包括常见的突变位点，成本低，效果好，检出率好，适用于筛查。本发明所述的地中海贫血筛查办法，所述待测样品包括外周血，口腔上皮细胞和体细胞，适合于多种样品，实用性好。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
本实施例公开了一种地中海贫血筛查试剂盒的具体实施方式，具体制备方法如下所述：
1.设计荧光探针
荧光探针包括磁性微球、连接在所述磁性微球表面的单链寡核苷酸分子信标和荧光素猝灭剂。所述单链寡核苷酸分子信标包括经化学反应性基团修饰的5’端、经荧光素分子修饰的3’端和位于5’端和荧光素分子中间的茎-环结构单链寡核苷酸链，所述化学反应性基团与所述磁性微球表面偶联。
从数据库中取α-珠蛋白和β-珠蛋白基因序列，根据基因序列和常见的突变区域设计所述荧光探针上与突变位点名称对应的单链寡核苷酸的序列，如表1所示，进行合成：
表1单链寡核苷酸序列表
Figure BDA0002382977740000041
Figure BDA0002382977740000051
其中5’端修饰的化学反应性基团包括氨基、羧基或酰胺基，偶联在所述磁性微球上；
其中3’端修饰的荧光素分子包括Cy3、Cy5或FAM；
所述荧光素的猝灭剂包括Dabcyl、BHQ-1或TANRA，偶联在所述磁性微球上。
所述磁性微球为磁性聚合物微球，所述聚合物微球的材料单体为乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，包括包埋于所述聚合物微球内部的质量分数为1％的Fe3O4磁性纳米粒子，所述Fe3O4磁性纳米粒子粒径为10-20nm，所述磁性聚合物微球表面经化学反应性基团修饰，化学反应性基团包括氨基、羧基或酰胺基，连接单链寡核苷酸分子信标和荧光素猝灭剂后表面封闭，平均直径为2.5μm；以上为磁性微球的一个实施例，但并不限于此，只要具备磁性且具有表面修饰的基团可以连接荧光素猝灭剂和单链寡核苷酸分子信标即可。
制备好的含有特异寡核苷酸分子信标的荧光探针，分别分装在不同的包装中。
使用时配合所述分子信标荧光探针的磁性多孔反应板，由超顺磁材料制成，反应板内孔表面设有亲水涂层，或者所述磁性多孔反应板由两部分组成，由超顺磁底座和嵌合在所述超顺磁底座上可更换反应板，使用时连接电路，控制磁性的有无。
2.设计引物
从数据库中获取α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因,根据如上所述的地中海贫血基因突变类型，设计了如下的引物序列用于PCR扩增，上述引物的衍生序列也在本发明的保护范围，所述衍生序列为5’端和/或3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。
本发明所述的引物序列如下表2所示：
表2引物序列
Figure BDA0002382977740000061
Figure BDA0002382977740000071
3.设计PCR反应液和反应程序
所述PCR反应液包括：
Figure BDA0002382977740000072
所述PCR的反应程序为95℃反应5min，然后以94℃反应30秒，61℃反应35秒，72℃反应35秒，以上为一个循环，进行30-36个循环；然后72℃反应5min，12℃反应12s；
其中，采用北京百泰克Power Taq Plus DNA聚合酶，PCR扩增仪为杭州朗基科学仪器有限公司MG系列96梯度PCR仪。
4.设计杂交液和洗涤液
所述杂交液，包括质量分数为5％的硫酸葡聚糖，500mM的NaCl，体积分数为20％的去离子甲酰胺，5mM的Na2EDTA，体积分数为0.5％的tritonX-100，100mM Tris-HCl(pH7.5),体积分数为0.5％的吐温80，体积分数为0.5％的三甲铵乙内酯。
所述洗涤液，包括25mM Tris，50mM NaCl，体积分数为0.5％的tritonX-100,体积分数为0.1％的SDS，pH值为6-10。
实施例2
本实施例公开了一种实施例1所述地中海贫血检测方法，具体如下所述：
样品采集与提取：采集接受基因筛查的试验者外周血，采用QIAamp DNA BloodMini Kit进行基因组DNA提取；在一些实施例中，标本也可使用唾液中的口腔上皮细胞或体细胞。
PCR扩增：在灭菌PCR管中依次添加经提取的DNA 4μl，在55℃温浴7min，然后添加5μl 0.1％SDS室温7min，终止反应，置于冰上，总体积20μl作为模板；加入实施例1所述PCR反应引物和反应液，按照实施例1所述的反应程序进行PCR反应，对样本的基因组DNA进行外显子区域扩增，得到扩增片段。
杂交和洗涤：将寡核苷酸分子信标荧光探针放入磁性多孔反应板的孔中，每孔中含有一种寡核苷酸分子信标的荧光探针，将得到的PCR引物稀释10倍，分别滴入多孔板中，每孔5μl，每个孔内各加入一种荧光探针1μl混合，然后通电获得磁性，经缓冲液清洗，撤去磁性，加入缓冲液后得到杂家液。
荧光检测：在紫外灯下直接观察反应板中的荧光信号，判读结果。其中检测方法不限于紫外灯下的直接观察，也可经荧光检测仪观察，或将得到的杂交液经荧光分光光度计检测，比较对照品荧光强度和杂交液荧光强度进行判读，对照品为上述PCR反应中不加引物，其他与杂交液成分和操作步骤相同。
实施例3
准确性测定：收集20份阴性样本和40份地贫样本，按照实施例2所述检测方法进行DNA扩增，将得到的扩增页进行连续二倍稀释，制成高、中、低3个浓度，每个浓度平行9个样品，分别采用本发明所述检测。北京百奥莱博科技有限公司和上海伯豪生物技术有限公司生产的试剂盒进行检测，每个产品采用三个不同批次的产品检测3次，分别计算阴性和阳性符合率。结果显示相应的基因型，产品阳性符合率和阴性符合率都达100％。
灵敏度测定：采用本发明试剂盒对地贫检测位点进行灵敏度分析，将实施例2所得的扩增液进行连续二倍稀释7次，每个浓度平行3个样品，采用本发明所述的选自3个不同批次的试剂盒进行测定，确定各基因型能够稳定检出的基因组DNA最低浓度，经定量检测核酸浓度为8ng/μL；
特异性测定：通过干扰筛查试验，临床正常剂量的EDTA、枸橼酸钠不是本品的干扰物质；溶血样本不会干扰本试剂盒检测结果；脂血样本中甘油三酯黄疸样本对本品检测无干扰。用本产品检测8例本产品检测范围外的临床样本，包括2例α-地贫与β-地贫阴性样本、2例缺铁性贫血临床样本、2例再障临床样本，1例感染衣原体的全血样本，1例感染流感的全血样本，均无交叉反应。
重复性测定：采用本发明试剂盒不同批号产品，不同人试验人员操作，同一天做2次，共做2天，每个参考品每次试验重复3次检测。在不同实验条件下能多次重复稳定检测α-地贫基因型，结果显示一致。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所做的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州百源基因技术有限公司
<120> 一种地中海贫血筛查试剂盒
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
<400> 43
ttaggcagaa tccagatgct caag 24
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
ccttcaccct cccacagttc c 21
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
cgtcacctca gagccatcac 20
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
tgcggtcagc agcacttcc 19
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
tcaccaccac ctgtgtagga gtg 23
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
tgcttttgtg agtgctgtgt tgac 24
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
aggcggagtt tcgctgttgt 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
cccctgtcct ttccctaccc 20
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
ggagtgggac ttctctgacc tacc 24

Claims (11)

1.一种地中海贫血筛查试剂盒，其特征在于，包括
(1)一组用于多重PCR的引物，为SED ID NO.38-51；
(2)一组用于检测PCR产物的荧光探针，所述荧光探针包括磁性微球、连接在所述磁性微球表面的单链寡核苷酸分子信标和荧光素猝灭剂；所述单链寡核苷酸分子信标包括经化学反应性基团修饰的5’端，经荧光素分子修饰的3’端和位于5’端和3’中间的茎-环结构单链寡核苷酸链；
(3)磁性多孔反应板，所述磁性多孔反应板孔内层涂覆有超顺磁材料。
2.根据权利要求1所述的地中海贫血筛查试剂盒，其特征在于，根据权利要求1所述的地中海贫血筛查试剂盒，其特征在于，所述茎-环结构单链寡核苷酸茎部为互补的序列组成的双链结构，环部的序列如SED ID NO.1-37所示。
3.根据权利要求1或2所述的地中海贫血筛查试剂盒，其特征在于，所述磁性微球为一种含磁性纳米粒子的聚合物微球，所述聚合物微球表面经化学反应性集团修饰，连接有荧光素猝灭剂和单链寡核苷酸分子信标。
4.根据权利要求1-3任一项所述的地中海贫血筛查试剂盒，其特征在于，所述荧光猝灭剂包括Dabcyl、BHQ-1或TANRA；所述荧光素分子包括Cy3、Cy5或FAM。
5.根据权利要求1-4任一项所述的地中海贫血筛查试剂盒，其特征在于，5’端修饰的化学反应性基团包括氨基、羧基或酰胺基。
6.根据权利要求1-5任一项所述的地中海贫血筛查试剂盒，其特征在于，还包括一组用于多重PCR的反应液，所述多重PCR反应液按每人份含量由以下组分组成：
Figure FDA0002382977730000021
7.根据权利要求1-6任一项所述的地中海贫血筛查试剂盒，其特征在于，还包括杂交液和洗涤液。
8.一种应用权利要求1-7任一项所述地中海贫血筛查试剂盒的地中海贫血筛查方法，其特征在于，包括以下步骤：收集待测样品并提取DNA；加入引物和反应物进行PCR扩增；将PCR扩增产物稀释后滴入磁性多孔反应板中，并加入荧光探针，经杂交和洗涤后在检测其荧光判定结果。
9.根据权利要求8所述的地中海贫血筛查方法，其特征在于，所述待测样品包括外周血，口腔上皮细胞，体细胞。
10.一种权利要求1-7任一项所述地中海贫血筛查试剂盒在地中海贫血筛查领域的应用。
11.根据权利要求10所述的地中海贫血筛查试剂盒在地中海贫血筛查领域的应用，其特征在于，用于中国人群的地中海贫血筛选。
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