CN101530766A

CN101530766A - 氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法

Info

Publication number: CN101530766A
Application number: CN200910066652A
Authority: CN
Inventors: 苏星光; 王冠男
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2009-03-19
Filing date: 2009-03-19
Publication date: 2009-09-16
Anticipated expiration: 2029-03-19
Also published as: CN101530766B

Abstract

本发明属于生物分子标记技术领域，具体涉及一种氨基功能化的双核壳结构的磁性荧光编码微球的制备方法。其是在反相微乳液中将两种具有不同荧光颜色的半导体量子点与超顺磁性的氧化铁纳米粒子包埋到同一二氧化硅纳米粒子中，形成一种粒度在40～100nm之间、荧光强度大、稳定性高的氨基功能化的磁性荧光编码微球。通过改变不同荧光颜色的量子点的种类和比例来调整微球的荧光位置和强度，实现了不同的荧光编码。超顺磁性四氧化三铁的加入，使微球在外加磁场的作用下，能够迅速地靶向聚集和移动。通过对微球表面进行氨基修饰，其能够广泛地应用在免疫学检测、核酸杂交、基因分析、细胞分类与成像等领域。

Description

氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法

技术领域

本发明属于生物分子标记技术领域，具体涉及一种氨基功能化的双核壳结构的磁性荧光编码微球的制备方法。

背景技术

生物分子的标记和检测一直是生物分析领域的重要内容。目前对蛋白质研究使用最普遍的荧光探针是有机荧光染料，有机荧光染料虽然在生物偶联方面已经有了深厚的研究基础，但由于其激发光谱窄、发射光谱宽、容易出现光漂白，同时由于不同染料的荧光需要不同的激发光源，很难实现多指标同时检测，这些缺陷在一定程度上限制了它们的广泛应用；而半导体量子点(QDs)则具有颜色随着尺寸可调，单一光源能激发多种颜色量子点，发射光谱具有狭窄的半峰宽和对称的结构等优点。以量子点为基础的荧光技术具有无损检测、操作简单、结果直观、测量快速、灵敏度高以及费用低等优点，自1998年Science杂志首次报道量子点用于生物医学分析以来，半导体量子点作为一种新型荧光探针，目前已被广泛应用于生命科学、医学研究及药物研发等领域。

近些年来，随着人们在科研和生物医学诊断上要求的不断提高，荧光编码微球已经成为一个主要研究的主题。荧光编码微球是一种载有两种或两种以上的荧光物质的新型功能化微球，它能够从单个样品中进行不同生物分子的平行检测，能从复杂目标中取得相关信息，如从多个蛋白或者多个基因中识别靶向目标。荧光微球由于在单个微球中包埋了多种颜色的荧光物质，可以对不同的荧光微球进行光学编码。同时，微球大的比表面积可以更多的捕获分子，为生物分析提供了一个高灵敏的平台。其在许多领域具有广泛的应用前景，如免疫分析，基因、蛋白的标识与检测以及细胞分类与成像。

就荧光编码微球的制备方法而言，目前文献报道的主要可以分为三类，一是通过溶胀的方法，将量子点包到微球内；Nie等最先使用溶胀聚苯乙烯微球的方法制备了量子点荧光编码微球(M Han，X.Gao，J.Z.Su，S.Nie，Nat Biotechnol.2001(19)：63)，溶胀法是最简单的方法，但是使用这种方法的聚苯乙烯微球表面会表现出很强的表面纹理，这种纹理很容易阻挡微球内部量子点对光的吸收和荧光发射，另外使用这种方法制备的荧光编码微球，其内部的量子点主要吸附在聚苯乙烯微球的内壁上很容易渗漏出来。二是通过层层自组装的方法使量子点吸附在微球外部。苏等人通过层层自组装的方法，利用静电引力使带负电荷的不同颜色的量子点吸附在聚苯乙烯微球的表面制备了荧光编码微球(Q.Ma，X.Wang，Y.Li，Y.Shi，X.Su，Talanta 2007(72)：1446)，这种方法的缺点是中间的聚电解质层会减弱量子点的荧光强度；并且用这种方法制备的荧光编码微球通常体积比较大，在细胞分析中受到很大局限性；三是在水/油相中利用正硅酸酯水解包覆荧光物质形成核壳结构，主要方法为反相微乳液法。反相微乳液法操作简单、直接，通过此法制备的二氧化硅微球尺寸可控、表面光滑，并且很容易与其他功能基团相连，并具有很好的生物适应性。王等人利用反相微乳法将两种有机染料同时包埋在二氧化硅微球内制备了荧光编码微球(L Wang，C.Yang，W.Tan，Nanoletters 2005(5)：37)，但此方法使用的是有机荧光染料作为荧光材料，由于有机染料具有狭窄的激发带，不对称的荧光发射峰以及光褪色等缺点，这限制了它作为荧光探针的使用。反相微乳液法对于量子点的包覆，目前只限于单色荧光量子点，因为两种量子点直接混合易发生能量转移，产生荧光猝灭，故尚未有利用此方法制备荧光编码微球的报道。本发明正是克服这个技术难关，利用反相微乳法成功地制备了稳定性高、荧光强度大的磁性荧光编码微球。

磁性微球的研究始于70年代，自80年代以来，这一领域的研究日渐活跃，各国竞相在这一很有经济效益的领域展开角逐。磁性微球的制备国外有不少报道，国内开展这方面的工作则是近些年的事，1993年孙宗华课题组制备出大粒径苯乙烯磁性微球，1995年张津辉利用Co60.Y-射线辐射聚合制备了不同功能团的磁性微球。其中比较成熟已经商品化的是Dynal公司的产品，但由于其操作极为繁琐，需要专门设备和技术，因此Dynal公司的产品价格昂贵，并且在国内无代理商。近几年来随着对磁性微球研究的深入，磁性微球的许多应用已经或者正在被开发出来，磁性微球的应用领域从原来的分离、诊断、靶向载药外延到荧光免疫分析、免疫电化学发光、基因测序等领域，特别是伦敦儿童医院、挪威工科大学和美国喷气研究所利用纳米级磁性微球成功地进行了人体骨髓液瘤细胞的分离来治疗患者，该工作的成功无疑增强了人们的信心，加速了该领域的研究进展。

磁性荧光编码微球是一种集磁响应和荧光编码特性于一体的多功能化微球，这种微球不但能够对外加磁场做出响应，而且还能在光激发下发出两种或者多种荧光，因此能够在更广泛的领域得到应用。设计可用于化学、生物或医学传感的磁性荧光编码微球具有极重要的价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有氨基功能化的双核壳结构的磁性荧光编码微球的制备方法。

本发明提出的氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球，是在反相微乳液中将两种具有不同荧光颜色的半导体量子点(QDs1和QDs2)与超顺磁性的氧化铁纳米粒子(MNs)包埋到同一二氧化硅纳米粒子中，形成一种粒度在40-100nm之间，荧光强度大，稳定性高的氨基功能化的磁性荧光编码微球。通过改变不同荧光颜色的量子点的种类和比例来调整微球的荧光位置和强度，实现了不同的荧光编码。由于在制备过程中加入了两种不同颜色的量子点，因此该微球不仅具有磁响应性，而且可以通过改变不同荧光颜色的量子点的种类和比例来调节磁性荧光微球的荧光峰位置和强度以实现荧光编码，因此我们称之为磁性荧光编码微球。这种磁性荧光编码微球通过表面修饰，可制备成功能化的双核壳结构的磁性荧光编码微球，并可进一步连接抗体、配体、多肽、细胞因子、核酸等生物分子，从而可广泛地应用在免疫学检测、核酸杂交、基因分析、细胞分类与成像等领域。

本发明提出的上述具有核壳结构的磁性荧光编码微球是采用反相微乳液方法制备的，其具体步骤如下：

A.制备水相的超顺磁性氧化铁纳米粒子MNs和两种颜色可分的表面带有巯基羧酸类基团修饰的水相半导体量子点QDs₁和QDs₂；

B.在室温的条件下，用反相微乳液法对水相的氧化铁纳米粒子和一种表面带有巯基羧酸类基团的水相半导体量子点QDs₁进行二氧化硅包覆，形成MNs-QDs₁/SiO₂核壳结构，并用带有氨基的硅烷偶联剂对其表面进行氨基修饰，制备得到氨基修饰的单色的MNs-QDs₁/SiO₂核壳结构的磁性荧光微球。

C.将步骤B中所得的带有氨基修饰的单色的MNs-QDs₁/SiO₂核壳结构的磁性荧光微球与另一种表面带有巯基羧酸类基团的半导体量子点QDs₂混合，并采用反相微乳液法进行第二次二氧化硅包覆，制备得到具有双核壳结构的磁性荧光编码微球；

D.用带有氨基的硅烷偶联剂和三羟硅基-3-丙基甲膦酸酯(THPMP)对步骤C中所得的双核壳结构的磁性荧光编码微球进行功能化修饰，得到可用于免疫分析的氨基功能化的双核壳结构的磁性荧光编码微球。

上述步骤A，水相的超顺磁性氧化铁纳米粒子MNs的浓度为0.01～0.1M；水相半导体量子点QDs₁和QDs₂的浓度为0.0015～0.01mM；

上述步骤B，所述的制备氨基修饰的单色核壳结构的磁性荧光微球，是在20℃～40℃温度条件下，首先将10～500μL超顺磁性氧化铁纳米粒子水溶液与100～1000μL巯基羧酸类基团修饰的一种颜色的量子点水溶液混合，然后同5～10ml的油相环己烷、1～3ml的助表面活性剂正己醇、1～3ml的表面活性剂TritonX-100、30～200μL的正硅酸乙酯一起加入到容器中，搅拌30～60min后加入50～100μL质量分数比浓度为20％～40％的氨水和20～100μL、0.05％～0.10v/v％的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)水溶液，再搅拌24～36小时后形成混合的W/O型微乳液，在该微乳液的乳滴中通过正硅酸乙酯的水解生成二氧化硅壳，然后加入10～50μL带有氨基的硅烷偶联剂进行表面修饰，继续搅拌24～36小时；再向容器中加入10～20ml的丙酮进行破乳，停止搅拌后离心使反应物沉淀分离出来，用有机试剂(如甲醇、乙醇等)和水洗涤沉淀产物，然后分散于水中，进而得到粒度为20～50nm范围内氨基修饰的单色核壳结构的磁性荧光微球溶液；

上述步骤C中所述的制备双核壳磁性荧光编码微球，是将步骤B中制备的氨基修饰的单色核壳结构的磁性荧光微球与另一种颜色的表面带有巯基羧酸类基团的量子点进行二氧化硅包覆。

是在20℃～40℃温度条件下，首先将100～1000μL氨基修饰的单色核壳结构的磁性荧光微球溶液与100～1000μL巯基羧酸类基团修饰的另一种颜色的量子点水溶液混合，然后同5～10ml的油相环己烷、1～3ml的助表面活性剂正己醇、1～3ml的表面活性剂Triton X-100、30～200μL的正硅酸乙酯一起加入到容器中，搅拌30～60min分钟后加入50～100μL、质量分数比浓度为20％～40％的氨水和20～100μL、0.05％～0.10v/v％的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯(PDDA)水溶液，搅拌24～36小时后形成混合的W/O型微乳液，在该微乳液的乳滴中通过正硅酸乙酯的水解生成第二层二氧化硅壳，，从而得到粒度在40～100nm范围内的双核壳结构的磁性荧光编码微球溶液。

上述步骤D中所述制备功能化磁性荧光编码微球，是向双核壳结构的磁性荧光编码微球溶液中加入带有氨基的硅烷偶联剂和THPMP，对双核壳磁性荧光编码微球表面进行功能化修饰。其是在20℃～40℃温度条件下，在步骤C的溶液中加入10～50μL带有氨基的硅烷偶联剂和30-100μL THPMP，继续搅拌24～36小时，再向容器中加入10～20ml的丙酮进行破乳，停止搅拌后离心使反应物沉淀分离出来，用有机试剂(如甲醇、乙醇等)和水洗涤沉淀产物，然后分散于水中，得到氨基修饰的双核壳磁性荧光编码微球溶液，该微球的粒度在40～100nm范围内。

上述步骤中所述的水相的溶剂为去离子水或者蒸馏水，所有合成步骤均在水相中进行。

上述步骤中所述的超磁性氧化铁纳米粒子，是粒径为5～12nm的超顺磁性氧化铁纳米粒子，为Fe₃O₄或r-Fe₂O₃中的一种。

上述步骤中所述的两种颜色可分的表面带有巯基羧酸类基团的水相半导体量子点QDs₁和QDs₂为在合成过程中使用巯基羧酸类试剂进行修饰的CdS、ZnS、HgS、CdSe、ZnSe、CdTe、ZnTe、ZnO、PbSe或InAs半导体量子点，主要由II-VI族或III-VI族元素组成的半导体纳米微晶。即使是同一种量子点，由于粒径不同，也会具有不同的颜色。

进一步地，上述步骤中所述的半导体量子点合成中所使用的巯基羧酸类试剂为3-巯基丙酸、巯基丁二酸、巯基乙酸、半胱氨酸、2-巯基丙酸、巯基丁酸、巯基戊酸、巯基己酸、巯基庚酸、巯基辛酸或巯基壬酸中的一种。

上述步骤中所述的加入的带有氨基的硅烷偶联剂是三甲氧基胺丙基硅烷(APS)和三乙氧基胺丙基硅烷中的一种。它可以与二氧化硅表面的硅醇基相连，使二氧化硅表面偶联上氨基，使其能与多种生物分子相连，增加微球的生物适应性。另外在制备单色核壳结构的磁性荧光微球后，通过偶联上氨基后，它可与第二种量子点(QDs₂)的羧基通过静电作用相连，使第二种量子点紧密地连接在单色磁性荧光微球表面上，形成磁性荧光编码微球。

上述步骤中所述的THPMP全名为3-(trihydroxysilyl)-propylmethylphosphonate(三羟硅基-3-丙基甲膦酸酯)，是一种含有甲基磷酸酯的惰性稳定剂。带有氨基的硅烷偶联剂对二氧化硅表面进行氨基修饰后虽然会增加微球的生物适应性，但修饰上的氨基部分会和二氧化硅表面的硅醇基相连形成回键，这大大减少了二氧化硅表面的电荷密度。微球分散性能正是由于电荷排斥作用所致，所以过量的带有氨基的硅烷偶联剂会减少微球在水中的分散性，引起聚集。而THPMP的加入可以解决这个问题，微球表面的氨基会与甲基磷酸酯基相连，这样就可有效地阻止微球的聚集。

上述步骤中所述的PDDA全名为poly(dimethyldiallyl ammonium chloride)(邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯)，是一种液态的季铵盐强电解质，在很宽的pH范围内都会由于电离而带正电荷。在本发明中，其用来中和反应中由于正硅酸乙酯水解产生的带有负电荷的中间体，避免其与带有负电荷的量子点之间的相互排斥现象，它的加入明显地增加了微球中量子点被包覆的数量，从而提高了微球的荧光强度与检测的灵敏度。

本发明中，我们提出了一种简单易行的制备功能化核壳结构的磁性荧光编码微球的方法，制备过程重复性好、制备的微球形状规整、稳定性高、荧光强度大，粒径易于控制，并且可以通过改变不同荧光颜色量子点的种类和比例来调整微球的荧光峰位置和强度，从而制备出具有不同的荧光编码的磁性微球。

本发明具有实质性的特点和显著的进步，它首次将磁性纳米粒子和两种量子点包覆在同一个二氧化硅微球内。可以方便地对任意两种荧光颜色的量子点进行自由组合并能同时将它们包覆在粒度十分均匀且小于100nm的二氧化硅微球中，可以通过调节改变不同荧光颜色的量子点的种类和比例来调整微球的荧光峰位置和强度，从而实现不同的荧光编码，理论上，n种颜色m个不同荧光强度的量子点可得到mⁿ-1个具有不同荧光特征的磁性荧光编码微。实施例中涉及两种颜色10个不同荧光强度的量子点，理论上可得到99个具有不同荧光特征的磁性荧光编码微球。由于本品包覆了超顺磁性纳米粒子和两种荧光量子点，并且二氧化硅外壳通过氨基的修饰可连接多种生物分子，因此，它可以作为一种生物荧光探针能够广泛地应用在免疫学检测、核酸杂交、基因分析、细胞分类与成像等生物医学的多方面领域。

超顺磁性四氧化三铁的加入，使微球在外加磁场的作用下，能够迅速地靶向聚集和移动。本发明中PDDA，APS，THPMP试剂的使用极大的增强了微球的荧光强度、生物稳定性和在水溶液中的分散性。

附图说明

图1：温度为300K时，氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球的磁滞回线；

图2：氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球和两种用于制备微球的荧光可区分的CdTe量子点的荧光发射光谱(a)和紫外吸收光谱(b)；图2中1为QDs₂的光谱图，2为QDs₁的光谱图，3为氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的光谱图。

图3：氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球的透射电子显微镜照片，其中右下方插图为其中一个功能化的磁性荧光编码微球的高分辨透射电子显微镜照片。

上述各图对应的是实施例2中的结果。图1说明了本发明制备的氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球，具体很好的超顺磁性。图2说明了本发明制备的氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球，具有较好的荧光性质。图3表明本发明制备的氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球的尺度大小为40nm左右。

具体实施方式

实施例1：

制备荧光强度比(I_QDs1/I_QDs2)为3：1的氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球

步骤a)超顺磁性四氧化三铁纳米粒子的制备：

四氧化三铁纳米粒子的制备采用最常用的共沉淀法。称取0.54g的FeCl₃·6H₂O和0.2g的FeCl₂·4H₂O，用10ml经过通氮除氧的去离子水溶解得到混合溶液。取70ml去离子水在250ml的三颈瓶中通氮除氧30分钟，加入10ml的质量分数比浓度为28％的浓氨水，在剧烈的搅拌下迅速向其中加入上述的铁盐混合溶液，在室温下反应30分钟。反应完毕后，用永磁铁(磁强为0.1T)从反应溶液中分离出黑色的固体，所得固体用去离子水清洗3～5次后即可得到粒径为5～12nm的四氧化三铁纳米晶，制备的四氧化三铁的摩尔浓度为0.02M。

步骤b)高荧光强度的巯基丁二酸修饰的CdTe量子点的制备：

称取80mg的硼氢化钠，将其放于一个通氮除氧后的密闭小烧瓶中，然后向其中加入1ml的去离子水，再加入127.5mg的碲粉。在小烧瓶上方留一可以排气的小孔，以便排除反应所产生的氢气。在常温下电磁搅拌反应8小时，得到NaHTe中间体。按照摩尔比Cd²⁺/MSA/NaHTe＝1：2.4：0.5的比例，将NaHTe溶液加入到通氮去氧后、巯基丁二酸(MSA)稳定的CdCl₂溶液中。然后将混合溶液加入到50ml的聚四氟乙烯反应釜中，在160℃保持40分钟，制备了最大发射波长为573nm(橙色)的巯基丁二酸修饰的CdTe量子点(QDs₁)，摩尔浓度为0.003mM；

重复上述步骤，只是在160℃保持80分钟，则制备了最大发射波长为650nm(深红色)的巯基丁二酸修饰的CdTe量子点(QDs₂)，制备的巯基丁二酸修饰的CdTe量子点摩尔浓度为0.003mM。

步骤c)制备氨基修饰的单色核壳结构的单色磁性荧光微球(Fe₃O₄-QDs₁/SiO₂)：

在50ml的锥形瓶中加入7.5ml环己烷，1.77ml的Triton X-100，1.8ml的正己醇，800μL的QDs₁(0.0024μmol)水溶液，200μL上述的Fe₃O₄(4μmol)水溶液和90μL正硅酸乙酯，机械搅拌30分钟形成微乳液，然后向锥形瓶中加入60μL PDDA水溶液(0.075％ v/v)和120μL质量分数比浓度为28％的NH₃·H₂O，在避光的条件下持续搅拌24h，然后将30μL APS加入到上述混合液中，继续搅拌24h。再向锥形瓶中加入10ml的丙酮进行破乳，停止搅拌。通过离心的方法(8000rpm，15分钟)使产物沉淀下来，分别用乙醇和去离子水清洗3～5次即可得到氨基修饰的核壳结构的单色磁性荧光微球，最后将产物分散在4ml的去离子水中，待用。

步骤d)制备荧光强度比(I_QDs1/I_QDs2)为3：1的氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球：

在50ml的锥形瓶中加入7.5ml环己烷，1.77ml的Triton X-100，1.8ml的正己醇，100μL的QDs₂(0.0003μmol)水溶液，900μL氨基修饰核壳结构的单色磁性荧光微球水溶液和90μL正硅酸乙酯，机械搅拌30分钟形成微乳液，然后向锥形瓶中加入120μL质量分数比浓度为28％的NH₃·H₂O，在避光的条件下持续搅拌24h，然后将30μL APS和80μL THPMP加入到上述混合液中，继续搅拌24h。向锥形瓶中加入10ml的丙酮进行破乳，停止搅拌。通过离心的方法(5000rpm，15分钟)使产物沉淀下来，分别用乙醇和去离子水清洗3～5次，将产物分散在4ml的去离子水中即可得到荧光强度比(I_QDs1/I_QDs2)为3：1的氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球。

实施例2：

制备荧光强度比(I_QDs1/I_QDs2)为1：1氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球

步骤a)超顺磁性四氧化三铁纳米晶的制备同实施例1的步骤a)；

步骤b)高荧光强度的巯基丁二酸修饰的CdTe量子点的制备同实施例1的步骤b)；

步骤c)氨基修饰核壳结构的单色磁性荧光微球(Fe₃O₄-QDs₁/SiO₂)同实施例1的步骤c)；

步骤d)制备荧光强度比(I_QDs1/I_QDs2)为1：1氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球：在50ml的锥形瓶中加入7.5ml环己烷，1.77ml的Triton X-100，1.8ml的正己醇，200μL的QDs₂(0.0006μmol)水溶液，800μL上述的单色磁性荧光微球水溶液和90μL正硅酸乙酯，机械搅拌30分钟形成微乳液，然后向锥形瓶中加入120μL质量分数比浓度为28％的NH₃·H₂O，在避光的条件下持续搅拌24h，然后将30μL APS和80lμL THPMP加入到上述混合液中，继续搅拌24h。向锥形瓶中加入10ml的丙酮进行破乳，停止搅拌。通过离心的方法(5000rpm，15分钟)使产物沉淀下来，分别用乙醇和去离子水清洗3～5次，将产物分散在4ml的去离子水中即得到荧光强度比(I_QDs1/I_QDs2)为1：1的氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球。

实施例3：

制备QDs₁荧光强度/QDs₂荧光强度为2：5氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球

步骤d)制备QDs₁荧光强度/QDs₂荧光强度为2：5氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球：在50ml的锥形瓶中加入7.5ml环己烷，1.77ml的TritonX-100，1.8ml的正己醇，400μL的QDs₂(0.0012μmol)水溶液，600μL上述的单色磁性荧光微球水溶液和90μL正硅酸乙酯，机械搅拌30分钟形成微乳液，然后向锥形瓶中加入120μL质量分数比浓度为28％的NH₃·H₂O，在避光的条件下持续搅拌24h，然后将30μL APS和80μLTHPMP加入到上述混合液中，继续搅拌24h。向锥形瓶中加入10ml的丙酮进行破乳，停止搅拌。通过离心的方法(5000rpm，15分钟)使产物沉淀下来，分别用乙醇和去离子水清洗3～5次，将产物分散在4ml的去离子水中即得到荧光强度比(I_QDs1/I_QDs2)为2：5的氨基功能化双核壳结构的磁性荧光编码微球。

Claims

1、氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法，其具体步骤如下：

A.室温的条件下，制备水相的超顺磁性氧化铁纳米粒子MNs和两种颜色可分的表面带有巯基羧酸类基团的水相半导体量子点QDs₁和QDs₂；

B.用反相微乳液法对水相的氧化铁纳米粒子和一种表面带有巯基羧酸类基团的水相半导体量子点QDs₁进行二氧化硅包覆，形成MNs-QDs₁/SiO₂核壳结构，并用带有氨基的硅烷偶联剂对其表面进行氨基修饰，制备得到氨基修饰的单色MNs-QDs₁/SiO₂核壳结构的磁性荧光微球；

C.将氨基修饰的单色MNs-QDs₁/SiO₂核壳结构的磁性荧光微球与另一种表面带有巯基羧酸类基团的半导体量子点QDs₂混合，并采用反相微乳液法进行第二次二氧化硅包覆，制备得到具有双核壳结构的磁性荧光编码微球；

D.用带有氨基的硅烷偶联剂和三羟硅基-3-丙基甲膦酸酯对双核壳结构的磁性荧光编码微球进行功能化修饰，得到可用于免疫分析的氨基功能化的双核壳结构的磁性荧光编码微球。

2、如权利要求1所述的氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法，其特征在于：步骤A中，水相的超顺磁性氧化铁纳米粒子MNs的浓度为0.01～0.1M；水相半导体量子点QDs₁和QDs₂的浓度为0.0015～0.01mM。

3、如权利要求1所述的氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法，其特征在于：步骤B中，所述的制备氨基修饰的单色核壳结构的磁性荧光微球，是在20℃～40℃温度条件下，首先将10～500μL超顺磁性氧化铁纳米粒子水溶液与100～1000μL巯基羧酸类基团修饰的一种颜色的量子点水溶液混合，然后同5～10ml的油相环己烷、1～3ml的助表面活性剂正己醇、1～3ml的表面活性剂Triton X-100、30～200μL的正硅酸乙酯一起加入到容器中，搅拌30～60min后加入50～100μL质量分数比浓度为20％～40％的氨水和20～100μL、0.05％～0.10v/v％的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯水溶液，再搅拌24～36小时后形成混合的W/O型微乳液，在该微乳液的乳滴中通过正硅酸乙酯的水解生成二氧化硅壳，然后加入10～50μL带有氨基的硅烷偶联剂进行表面修饰，继续搅拌24～36小时；再向容器中加入10～20ml的丙酮进行破乳，停止搅拌后离心使反应物沉淀分离出来，用有机试剂和水洗涤沉淀产物，然后分散于水中，进而得到粒度为20～50nm范围内氨基修饰的单色核壳结构的磁性荧光微球溶液。

4、如权利要求1所述的氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法，其特征在于：步骤C中，是在20℃～40℃温度条件下，首先将100～1000μL氨基修饰的单色核壳结构的磁性荧光微球溶液与100～1000μL巯基羧酸类基团修饰的另一种颜色的量子点水溶液混合，然后同5～10ml的油相环己烷、1～3ml的助表面活性剂正己醇、1～3ml的表面活性剂Triton X-100、30～200μL的正硅酸乙酯一起加入到容器中，搅拌30～60min分钟后加入50～100μL、质量分数比浓度为20％～40％的氨水和20～100μL、0.05％～0.10v/v％的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯水溶液，搅拌24～36小时后形成混合的W/O型微乳液，在该微乳液的乳滴中通过正硅酸乙酯的水解生成第二层二氧化硅壳，从而得到粒度在40～100nm范围内的双核壳结构的磁性荧光编码微球溶液。

5、如权利要求1所述的氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法，其特征在于：步骤D中，是在20℃～40℃温度条件下，在双核壳结构的磁性荧光编码微球溶液中加入10～50μL带有氨基的硅烷偶联剂和30-100μL三羟硅基-3-丙基甲膦酸酯，继续搅拌24～36小时，再向容器中加入10～20ml的丙酮进行破乳，停止搅拌后离心使反应物沉淀分离出来，用有机试剂和水洗涤沉淀产物，然后分散于水中，得到氨基修饰的双核壳磁性荧光编码微球溶液，该微球的粒度在40～100nm范围内。

6、如权利要求1所述的氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法，其特征在于：超磁性氧化铁纳米粒子是粒径为5～12nm的超顺磁性氧化铁纳米粒子，为Fe₃O₄或r-Fe₂O₃中的一种。

7、如权利要求1所述的氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法，其特征在于：两种颜色可分的表面带有巯基羧酸类基团的水相半导体量子点QDs₁和QDs₂为在合成过程中使用巯基羧酸类试剂进行修饰的CdS、ZnS、HgS、CdSe、ZnSe、CdTe、ZnTe、ZnO、PbSe或InAs半导体量子点。

8、如权利要求1所述的氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法，其特征在于：半导体量子点合成中所使用的巯基羧酸类试剂为3-巯基丙酸、巯基丁二酸、巯基乙酸、半胱氨酸、2-巯基丙酸、巯基丁酸、巯基戊酸、巯基己酸、巯基庚酸、巯基辛酸或巯基壬酸中的一种。

9、如权利要求1所述的氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法，其特征在于：带有氨基的硅烷偶联剂是三甲氧基胺丙基硅烷APS和三乙氧基胺丙基硅烷中的一种。

10、如权利要求1所述的氨基功能化双核壳结构磁性荧光编码微球的制备方法，其特征在于：水相的溶剂为去离子水或者蒸馏水。