CN116254110B - 一种用于荧光免疫层析的量子点微球及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于荧光免疫层析的量子点微球及其制备方法、应用。制备方法包括形成巯基改性的量子点二氧化硅微球以及使巯基改性的量子点二氧化硅微球与偏硅酸钠水溶液反应,在二氧化硅微球表面包覆二氧化硅;本发明还公开上述量子点微球在荧光免疫层析中的应用。本发明通过对微球进行二氧化硅包覆,避免了量子点在包覆过程中的淬灭,同时到达包覆防止量子点脱落的作用,进而在荧光免疫层析中的应用实现了高灵敏度和高选择性;另外,偏硅酸钠材料成本低廉,降低了制备成本。

Description

一种用于荧光免疫层析的量子点微球及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及量子点制备技术领域,具体涉及的是一种用于荧光免疫层析的量子点微球材料及其制备方法。
背景技术
量子点具有荧光强度大、荧光发射峰窄而对称、荧光颜色的组成和尺寸可控、激发光谱为连续谱带、易于实现单元激发多元发射等优良的光学性能。为了提高量子点的稳定性,要求在其表面包裹上一层惰性材料,二氧化硅是一种理想的选择。制备包含有量子点的二氧化硅纳米粒(二氧化硅/量子点)的方法主要有两种:Stober方法和反相微乳液法。
Stober方法是一种合成单分散硅颗粒的物理化学方法,由Werner等人最先发现。一般是指通过将TEOS加入乙醇和氨水中生成纳米二氧化硅颗粒的方法。Stober方法是基于配体交换完成的,但是氨水和TEOS的加入往往造成量子点效率的下降以及二氧化硅/量子点的荧光强度降低很多;反相微乳液法所得的二氧化硅/量子点的荧光强度也有明显下降,并且量子产率也不高。
荧光免疫检测技术具有专一性强、灵敏度高、实用性好等优点,因此它被用于测量含量很低的生物活性化合物,例如蛋白质(酶、接受体、抗体)、激素(甾族化合物、甲状腺激素、酞激素)、药物及微生物等,但是因为测试基质往往比较复杂,对于检测的灵敏度提出了更高的要求。
所以亟待一种避免量子点效率下降的新型量子点微球及其制备方法,可以应用在荧光免疫层析领域。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题,本发明使用廉价的偏硅酸钠材料对微球进行二氧化硅包覆,提供一种用于荧光免疫层析的量子点微球材料及其制备方法,避免了量子点在包覆过程中的淬灭,同时达到包覆并防止量子点脱落的作用。
为实现上述技术目的,达到上述技术效果,本发明通过以下技术方案实现:本发明的第一个目的在于提供一种用于荧光免疫层析的量子点微球的制备方法,包括如下步骤:
S1、制备巯基改性的二氧化硅微球;
S2、使用巯基改性的二氧化硅微球吸附量子点,并加入量子点表面改性剂对量子点表面进行配体交换,形成醇溶性或水溶性的量子点二氧化硅微球;
S3、所述醇溶性或水溶性的量子点二氧化硅微球与偏硅酸钠水溶液反应,通过调节溶剂极性或溶液pH值,在所述量子点二氧化硅微球表面包覆二氧化硅。
作为本发明实施方式的进一步改进,所述溶剂选用醇类,包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇;溶液pH值的范围在7-11。
作为本发明实施方式的进一步改进,所述步骤S3中的具体方式为:配体交换后的所述醇溶性的量子点二氧化硅微球用乙醇洗涤后分散于乙醇中,形成量子点二氧化硅微球的乙醇溶液,再加入偏硅酸钠水溶液;形成游离状态的二氧化硅,沉积吸附于量子点二氧化硅微球上。
作为本发明实施方式的进一步改进,所述步骤S3中的具体方式为:配体交换后的所述水溶性的量子点二氧化硅微球用乙醇洗涤后分散于水中,形成量子点二氧化硅微球的水溶液,加入带正电聚合物,吸附在微球上以改变微球表面的电荷性质;再加入偏硅酸钠水溶液,调节pH值,形成游离状态的二氧化硅,通过静电作用沉积吸附于量子点二氧化硅微球上。
作为本发明实施方式的进一步改进,所述带正电荷的聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚胺及其衍生物、壳聚糖中的一种或多种。
作为本发明实施方式的进一步改进,所述巯基改性的二氧化硅微球的粒径为100-500nm。
作为本发明实施方式的进一步改进,所述配体交换至醇溶性量子点二氧化硅微球所用的量子点表面改性剂选自6-巯基-1-己醇、2-巯基-3-丁醇、3-巯基-1-丙醇、2,3-二巯基丙醇、巯丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷中的一种或多种;
所述配体交换至水溶性量子点二氧化硅微球所用的量子点表面改性剂选自巯基丙酸、巯基乙酸、巯基丁二酸、二氢硫辛酸、巯丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷中的一种或多种。
作为本发明实施方式的进一步改进,所述步骤S2的具体方式为:使用巯基改性的二氧化硅微球,在非极性溶剂中与油溶性量子点混合,使所述油溶性量子点吸附固定在二氧化硅微球的表面;再加入量子点表面改性剂,形成醇溶性或水溶性的量子点二氧化硅微球;
所述步骤S2中,所述油溶性量子点的多个表面原子与作为核心的二氧化硅的表面巯基通过配位键结合,以提供80%至100%之间的表面覆盖率。
作为本发明实施方式的进一步改进,所述量子点选自CdSe/ZnS、InP/ZnS、Cu2InS/ZnS中的一种或多种;所述量子点表面的配体选自油酸、油胺、硬脂酸、三辛基膦、辛硫醇、十二硫醇中一种或多种的混合;
所述量子点的尺寸为3nm至15nm。
本发明的第二个目在于提供一种用于荧光免疫层析的量子点微球,所述量子点微球采用上述的制备方法制备得到,所述量子点微球的荧光发射峰位于400-1400nm,所述量子点微球的粒径为0.1~10μm。
本发明的第三个目的在于提供上述量子点微球在荧光免疫层析领域的应用。
本发明具体公开了一种基于上述量子点微球的荧光免疫层析试剂卡,包括试纸条,所述试纸条包括样品垫、结合垫和层析膜;
所述层析膜上设有检测线和质控线,所述检测线上包被有SARS-CoV-2-N蛋白,所述质控线上包被有阴性对照抗体;
所述结合垫上包被有上述量子点微球-SARS-CoV-2-N抗体、上述量子点微球-阴性对照抗原。
与现有技术相比,本发明至少具有如下优点:
本发明提供的量子点微球具有以下优点:
(1)稳定、优良的光学性质:本发明的量子点微球经荧光光谱仪、紫外可见光谱仪和电子透射显微镜等进行了表征;由图3可知修饰前后的量子点微球的紫外可见吸收光谱峰位和形状均无明显变化,说明本量子点微球保持了良好的光学特性;
(2)通过与对比例比较,相同的浓度下,本发明的量子点微球具有更强的荧光强度,大约为对比例的2倍;
(3)量子产率高达80%以上;由图5扫描电子显微镜照片可以看出,本发明的量子点微球单分散性良好,颗粒均匀;
(4)本发明的量子点微球具有良好的稳定性,存放两个月后,其性能未改变;
(5)量子点的覆盖率高且引进了大量的识别位点,能实现其在生物方面的高灵敏度和高选择性的应用。
本发明提供的量子点微球的制备方法具有以下优点:
(1)修饰方法简便可行、工艺条件稳定、重复性好、所用试剂安全易得,仅通过成本低廉的偏硅酸钠就实现了二氧化硅对量子点微球的表面包覆。
(2)修饰方法对量子点造成的淬灭作用小,可以保留量子点的几乎全部荧光,得到的量子点微球亮度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例涉及的量子点溶液的荧光发射光谱图;
图2为本发明实施例涉及的量子点微球的透射电镜图;
图3为本发明实施例涉及的具体例1的量子点微球修饰前后的色谱图;
图4为本发明实施例涉及的具体例和对比例的荧光强度对比图;
图5为本发明实施例涉及的具体例1的量子点微球扫描电子显微镜图;
图6为本发明实施例涉及的量子点微球的荧光免疫层析试剂卡的结构示意图;
图7为本发明实施例涉及的不同抗原浓度的标准曲线图;
图8为本发明实施例涉及的不同检测极限的量子点微球的荧光免疫层析试剂卡的对比图;
图中示例表示为:
1-样品垫;2-结合垫;3-层析膜;31-检测线;32-质控线;4-吸收垫。
具体实施方式
下面将结合本申请的实施方式,对实施例中的技术方案进行详细地描述。应注意的是,该实施方式仅仅是部分方式,而不是全部。
如本文中表述例如“的至少一种(个)”当在要素列表之前或之后时修饰整个要素列表而不修饰列表的单独要素。如果未另外定义,说明书中的所有术语(包括技术和科学术语)可如本领域技术人员通常理解的那样定义。常用字典中定义的术语应被解释为与它们在相关领域的背景和本公开内容中的含义一致,并且不可以理想方式或者过宽地解释,除非清楚地定义。此外,除非明确地相反描述,措辞“包括”和措辞“包含”当用于本说明书中时表明存在所陈述的特征、区域、整体、步骤、操作、要素、和/或组分,但是不排除存在或添加一个或多个其它特征、区域、整体、步骤、操作、要素、组分、和/或其集合。因此,以上措辞将被理解为意味着包括所陈述的要素,但不排除任何其它要素。
如本文中使用的,术语“和/或”包括相关列举项目的一个或多个的任何和全部组合。术语“或”意味着“和/或”。
实施例1
为了解决现有技术中,亮度低、外量子效率差的问题,不能满足应用要求的问题,本发明实施例公开了一种用于荧光免疫层析的量子点微球的制备方法,包括如下步骤:
S1、制备巯基改性的二氧化硅微球;具体操作为,加入巯基硅烷偶联剂和催化剂,对二氧化硅微球表面进行功能化修饰,形成巯基改性的二氧化硅微球;巯基改性的二氧化硅微球的粒径为100-500nm;在本发明实施例中,巯基改性所用的有机试剂可以选自6-巯基-1-己醇、2-巯基-3-丁醇、3-巯基-1-丙醇、2,3-二巯基丙醇中的一种或多种。
S2、使用巯基改性的二氧化硅微球吸附量子点,并对量子点表面进行配体交换,形成醇溶性或水溶性的量子点二氧化硅微球;具体方式为:使用巯基改性的二氧化硅微球,在非极性溶剂中与油溶性量子点混合,通过超声,油溶性量子点与二氧化硅微球表面的巯基结合,使所述油溶性量子点均匀紧密吸附固定在二氧化硅微球的表面;再加入量子点表面改性剂,对量子点表面进行配体交换,形成醇溶性或水溶性的量子点二氧化硅微球;其中,油溶性量子点的多个表面原子与作为核心的二氧化硅的表面巯基通过配位键结合,以提供80%至100%之间的表面覆盖率。
S3、所述醇溶性或水溶性的量子点二氧化硅微球与偏硅酸钠水溶液反应,通过调节溶剂极性或溶液pH值,在所述量子点二氧化硅微球表面包覆二氧化硅。
优选地,溶剂选用醇类,包括但不限于甲醇、乙醇、异丙醇;溶液pH值的范围在7-11。
具体地,步骤S3中的具体方式为:配体交换后的所述醇溶性的用乙醇洗涤并超声分散于乙醇,形成量子点二氧化硅微球的乙醇溶液,再加入偏硅酸钠水溶液;偏硅酸钠从乙醇中析出,形成游离状态的二氧化硅,沉积吸附于量子点二氧化硅微球上。
可选地,步骤S3中的具体方式为:配体交换后的所述水溶性的量子点二氧化硅微球用乙醇洗涤并超声分散于水中,形成量子点二氧化硅微球的水溶液,加入带正电聚合物,通过静电作用吸附在微球上以改变微球表面的电荷性质;再加入偏硅酸钠水溶液,调节pH值使得偏硅酸钠形成游离状态的二氧化硅,通过静电作用沉积吸附于量子点二氧化硅微球上。
优选地,带正电荷的聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚胺及其衍生物、壳聚糖中的一种或多种。
具体地,配体交换至醇溶性量子点二氧化硅微球所用的量子点表面改性剂选自6-巯基-1-己醇、2-巯基-3-丁醇、3-巯基-1-丙醇、2,3-二巯基丙醇、巯丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷中的一种或多种;
而配体交换至水溶性量子点二氧化硅微球所用的量子点表面改性剂选自巯基丙酸、巯基乙酸、巯基丁二酸、二氢硫辛酸、巯丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷中的一种或多种。
优选地,量子点选自CdSe/ZnS、InP/ZnS、Cu2InS/ZnS中的一种或多种;量子点表面的配体选自油酸、油胺、硬脂酸、三辛基膦、辛硫醇、十二硫醇中一种或多种的混合;
本发明实施例中,量子点具有约3nm至15nm之间的峰值尺寸。
本发明实施例提供的量子点微球的制备方法具有以下优点:
(1)本发明实施例涉及的修饰方法简便可行、工艺条件稳定、重复性好、所用试剂安全易得,通过成本低廉的偏硅酸钠就实现了二氧化硅对量子点微球的表面包覆。
(2)本发明实施例涉及的修饰方法对量子点造成的淬灭作用小,可以保留量子点的几乎全部荧光,得到的量子点微球亮度高。
实施例2
本发明实施例提供一种用于荧光免疫层析的量子点微球,采用实施例1所公开的制备方法制备得到,如图1所示,所得到的量子点微球的荧光发射峰位于400-1400nm,优选为440~900nm;如图2所示,量子点微球的粒径为0.1~10μm,优选为150~600nm。
与现有技术相比,本发明实施例提供的量子点微球具有以下优点:
(1)稳定、优良的光学性质:本发明公开的量子点微球经荧光光谱仪、紫外可见光谱仪和电子透射显微镜等进行了表征;由图3可知修饰前后的量子点微球的紫外可见吸收光谱峰位和形状均无明显变化,说明本量子点微球保持了良好的光学特性;
(2)通过与对比例比较,相同的浓度下,本发明公开的量子点微球具有更强的荧光强度,由图4可以看出,本申请大约为对比例的2倍;
(3)量子产率高达80%以上;由图5扫描电子显微镜照片可以看出,本发明公开的量子点微球单分散性良好,颗粒均匀;
(4)本发明量子点微球具有良好的稳定性,存放两个月后,其性能未改变;
(5)量子点的覆盖率高且引进了大量的识别位点,可能实现其在生物方面的高灵敏度和高选择性的应用。
实施例3
本发明实施例公开了上述量子点微球在荧光免疫层析领域的应用。
本发明实施例具体公开了一种基于上述量子点微球的荧光免疫层析试剂卡,如图6所示,包括试纸条,试纸条包括样品垫1、结合垫2和层析膜3、吸收垫4;
层析膜3上设有检测线31和质控线32,检测线31上包被有SARS-CoV-2-N蛋白,质控线32上包被有阴性对照抗体;
结合垫2上包被有上述量子点微球-SARS-CoV-2-N抗体。
将上述制备得到的量子点微球制备成荧光免疫层析试剂卡,制备方法采用现有技术中常规方法,此处不赘述。
制备结合垫2上负载量子点微球-SARS-CoV-2-N抗体的荧光免疫层析试剂卡,在样品垫1上分别加入抗原浓度为0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、1μg/ml、5μg/ml的检测样本,作出的标准曲线如图7所示。如图8所示,不同抗原浓度的量子点微球的荧光免疫层析试剂卡的对比图;可见针对不同抗原浓度本发明实施例公开的荧光免疫层析试剂卡显示出了梯度分明的色度,对应着不同的荧光强度,也证明了本发明实施例所公开的量子点的覆盖率高且引进了大量的识别位点,实现其在生物方面的高灵敏度和高选择性的应用。
以下将以具体例对本申请做出详细的阐述。
具体例1:
1.2g红光CdSe/ZnS量子点(PL=625nm,油酸、十二硫醇混合配体)溶于2000mL氯仿,加入1g巯基二氧化硅微球(160nm),超声10min,加入30mL乙醇,10mL巯丙基三甲氧基硅烷,2mL氨水,50℃搅拌12小时后,离心,乙醇洗涤2遍,分散于200mL乙醇中,加入20mL 1%偏硅酸钠水溶液,50℃搅拌2小时,离心,去离子水洗涤2遍,分散于去离子水中。
具体例2:
1.2g绿光CdSe/ZnS量子点(PL=525nm,油酸、十二硫醇混合配体)溶于2000mL氯仿,加入1g巯基二氧化硅微球(160nm),超声10min,加入30mL乙醇,10mL巯丙基三甲氧基硅烷,2mL氨水,50℃搅拌12小时,乙醇洗涤2遍,分散于200mL水中,加入10mL 1%PVP K30水溶液,搅拌1小时,离心,分散于200mL水中,加入20mL 1%偏硅酸钠水溶液,加入盐酸将pH调节值10.8,50℃搅拌2小时,离心,去离子水洗涤2遍,分散于去离子水中。
具体例3:
1.6g红光InP/ZnS量子点(PL=617nm,油胺配体)溶于2000mL氯仿,加入1g巯基二氧化硅微球(100nm),超声10min,加入30mL乙醇,5mL 6-巯基-1-己醇,50℃搅拌12小时夜后,离心,乙醇洗涤2遍,分散于200mL乙醇中,加入20mL 1%偏硅酸钠水溶液,50℃搅拌2小时,离心,去离子水洗涤2遍,分散于去离子水中。
具体例4:
0.6g红光CuInS2/ZnS量子点(PL=631nm,油胺配体)溶于2000mL氯仿,加入1g巯基二氧化硅微球(500nm),超声10min,加入30mL乙醇,5mL巯基丙酸,50℃搅拌2小时,离心,乙醇洗涤2遍,分散于200mL水中,加入10mL 1%PVP K30水溶液,搅拌1小时,离心,分散于200mL水中,加入20mL 1%偏硅酸钠水溶液,加入盐酸将pH调节值10.8,50℃搅拌2小时,离心,去离子水洗涤2遍,分散于去离子水中。
具体例5:
1g PbS量子点(PL=850nm,油酸配体)溶于2000mL氯仿,加入1g巯基二氧化硅微球(250nm),超声10min,加入30mL乙醇,10mL巯基乙酸,50℃搅拌2小时,离心,乙醇洗涤2遍,分散于200mL水中,加入10mL 1%聚乙烯亚胺水溶液,搅拌1小时,离心,分散于200mL水中,加入20mL 1%偏硅酸钠水溶液,加入盐酸将pH调节值10.8,50℃搅拌2小时,离心,去离子水洗涤2遍,分散于去离子水中。
对比例1:
1.2g红光CdSe/ZnS量子点(PL=625nm油酸、十二硫醇混合配体)溶于2000mL氯仿,加入1g巯基二氧化硅微球(250nm),超声10min,加入30mL乙醇,10mL巯丙基三甲氧基硅烷,2mL氨水,50℃搅拌过夜。搅拌过夜后,离心,乙醇洗涤2遍,分散于200mL乙醇中,加入20mL水,2mL 25%氨水,加入10mL TEOS,搅拌过夜,离心,去离子水洗涤2遍,分散于去离子水中。
对比例2:
1.2g绿光CdSe/ZnS量子点(PL=525nm油酸、十二硫醇混合配体)溶于2000mL氯仿,加入1g巯基二氧化硅微球(250nm),超声10min,加入30mL乙醇,10mL巯丙基三甲氧基硅烷,2mL氨水,50℃搅拌过夜。搅拌过夜后,离心,乙醇洗涤2遍,分散于200mL乙醇中,加入20mL水,2mL 25%氨水,加入10mL TEOS,搅拌过夜,离心,去离子水洗涤2遍,分散于去离子水中。
将上述制备得到的量子点微球制备成荧光免疫层析装置,制备方法采用现有技术中常规方法,此处不赘述。
将具体例1-5获得的量子点微球和对比例1-2中获得的量子点微球分别测试其荧光光谱和荧光量子产率,具体测试结果如下表所示。
从表格中可以看出,与对比例相比,本发明具体例量子产率高达80%以上;且由图5扫描电子显微镜照片可以看出,本发明的量子点微球单分散性良好,颗粒均匀;量子点的覆盖率高且引进了大量的识别位点,可能实现其在生物方面的高灵敏度和高选择性的检测应用。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种用于荧光免疫层析的量子点微球的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、制备巯基改性的二氧化硅微球,所述巯基改性的二氧化硅微球的粒径为100-500nm;
S2、使用巯基改性的二氧化硅微球吸附量子点,并加入量子点表面改性剂对量子点表面进行配体交换,形成醇溶性或水溶性的量子点二氧化硅微球;
S3、所述醇溶性或水溶性的量子点二氧化硅微球与偏硅酸钠水溶液反应,通过调节溶剂极性或溶液pH值,在所述量子点二氧化硅微球表面包覆二氧化硅;
其中,配体交换后的所述醇溶性的量子点二氧化硅微球用乙醇洗涤后分散于乙醇中,形成量子点二氧化硅微球的乙醇溶液,再加入偏硅酸钠水溶液,形成游离状态的二氧化硅,沉积吸附于量子点二氧化硅微球上;
配体交换后的所述水溶性的量子点二氧化硅微球用乙醇洗涤后分散于水中,形成量子点二氧化硅微球的水溶液,加入带正电聚合物,吸附在微球上以改变微球表面的电荷性质;再加入偏硅酸钠水溶液,调节pH值,形成游离状态的二氧化硅,通过静电作用沉积吸附于量子点二氧化硅微球上。
2.根据权利要求1所述的用于荧光免疫层析的量子点微球的制备方法,其特征在于,所述带正电聚合物选自聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯亚胺及其衍生物、壳聚糖中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的用于荧光免疫层析的量子点微球的制备方法,其特征在于,所述配体交换至醇溶性量子点二氧化硅微球所用的量子点表面改性剂选自6-巯基-1-己醇、2-巯基-3-丁醇、3-巯基-1-丙醇、2,3-二巯基丙醇、巯丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷中的一种或多种;
所述配体交换至水溶性量子点二氧化硅微球所用的量子点表面改性剂选自巯基丙酸、巯基乙酸、巯基丁二酸、二氢硫辛酸、巯丙基三甲氧基硅烷、巯丙基三乙氧基硅烷中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的用于荧光免疫层析的量子点微球的制备方法,其特征在于,所述步骤S2的具体方式为:使用巯基改性的二氧化硅微球,在非极性溶剂中与油溶性量子点混合,使所述油溶性量子点吸附固定在二氧化硅微球的表面;再加入量子点表面改性剂,形成醇溶性或水溶性的量子点二氧化硅微球。
5.根据权利要求1所述的用于荧光免疫层析的量子点微球的制备方法,其特征在于,所述量子点选自CdSe/ZnS、InP/ZnS、Cu2InS/ZnS中的一种或多种;所述量子点表面的配体选自油酸、油胺、硬脂酸、三辛基膦、辛硫醇、十二硫醇中一种或多种的混合。
6.一种用于荧光免疫层析的量子点微球,其特征在于:采用如权利要求1-5中任一所述的制备方法制备得到,所述量子点微球的荧光发射峰位于400-1400 nm,所述量子点微球的粒径为0.1~10 μm。
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