CN114250071A - 一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球及其应用 - Google Patents

一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球及其应用，所述荧光微球的制备方法为：制备一种具有超大孔径的树枝状二氧化硅模板，其表面修饰接枝巯基基团，随后在模板上负载三层及以上油酸修饰的CdSe/CdS/ZnS量子点QDs，获得三层及以上量子点组装且最外层为量子点的dSiO2/QDs微球组装体，之后通过正辛基三甲氧基硅烷OTMS在dSiO2/QDs微球组装体表面发生水解缩合反应，实现dSiO2/QDs微球组装体由表面疏水性向亲水性转变，接着通过正硅酸乙酯TEOS在其表面水解生长二氧化硅壳层，最后依次经氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基化修饰和琥珀酸酐进行羧基化修饰。本发明利用巯基‑金属的配位作用可在模板上均匀负载大量量子点，无需对量子点表面改性，最大化的保留了量子点的荧光特性。

Description

一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球及其应用
技术领域
本发明涉及一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球及其应用。
背景技术
目前，COVID-19诊断测试可分为两大类。第一类包括使用逆转录酶实时聚合酶链反应(RT-PCR)和核酸杂交策略识别 SARS-CoV-2病毒RNA的分子诊断测试。RT-PCR方法虽然已成为SARS-CoV-2病毒检测的金标准，但其涉及多个样品处理步骤，繁琐且耗时，需要专业的操作人员以及昂贵的仪器，并且需要在实验室环境中进行，因此不适合大规模检测。第二类包括血清学和免疫学测试，主要侧重于检测抗体，虽然这些检测速度快且所需设备少，然而抗体仅在接触病毒后10-15天产生，存在早期诊断假阴性高的缺点，因此不适合对新冠潜在患者进行早期筛查和诊断。相比之下，抗原测试能够检测症状开始时出现的病毒蛋白。临床研究表明，SARS-CoV-2核衣壳(N)蛋白可在新冠患者血清中被检测出(PCR阳性)，其灵敏度性和特异性分别为92％和97％。在另一项研究中，在新冠患者的血浆中检测到棘突(S1)蛋白和N蛋白分别为8-20000和0.8-1700pg/mL的浓度范围。这些临床研究表明，定量测量血清/血浆中的SARS-CoV-2抗原，如N和S1蛋白，有助于准确和早期检测新冠疾病。2020年世界卫生组织发布了临时指南，即可以考虑使用灵敏度至少达到80％和特异性达到97％的快速抗原诊断试验来诊断SARS-CoV-2感染。
侧流免疫层析(LFIA)是一种基于纸张的即时检测平台，利用特定的抗原和抗体相互作用，快速、灵敏地检测目标分析物，已被广泛用于临床诊断、环境污染、急救医疗、食品安全检测等领域。目前商业化的测流免疫层析技术主要是以胶体金作为标记物进行定性或半定量的比色检测，然而传统的胶体金标记物稳定性差，信号弱，检测灵敏度低，限制了其进一步应用于需要高灵敏度和定量检测的领域。近年来，越来越多的纳米材料被用作构建LFIA体系的新型纳米标签，例如荧光染料掺杂的纳米粒子，上转换纳米粒子，量子点(QDs)，表面增强拉曼散射(SERS)纳米材料和磁性材料。在这些材料中，量子点由于其独特的光学性质而在生物医学研究中的荧光标记、生物成像和荧光传感检测等方面得到了广泛的应用。与常规有机荧光团相比，它的高量子产率和优异的抗漂白性能可有效弥补传统有机染料的缺陷。此外，它还具有尺寸调控发光特性、吸收光谱宽、发射光谱窄等优势。
目前高质量的量子点通常在有机相中合成，表面通常含有疏水性配体，与生物的水介质并不相容，并不能直接应用于生物应用。如何对其进行表面改性使其保持优异的光学特性以及生物相容性是其应用的关键。据报道，通常量子点的亲水化大致可以分为两种：将量子点及其疏水性配体封装到聚合物微球、水凝胶等载体中；用亲水性配体进行表面配体替换。Wang等人通过溶胀蒸发策略将油胺配体封装的油相lnP/ZnS QDs封装到聚苯乙烯纳米球中；Saeger等人使用两种方法对QDs进行亲水化处理，分别通过两亲性聚合物PMAO将CdSe/CdS QDs转移到水相中，以及使用油包水微乳化法将QDs包封在二氧化硅壳中。Podhorodecki等人通过高温热注射法制备油酸封端的CdSe/CdS QDs，并且通过3-巯基丙酸进行配体替换制备水溶性QDs，然而其量子产率却显著降低。
此外，当前研究表明尽管基于单一量子点探针的检测灵敏度相较于金纳米粒子可高出10倍左右，但仍然难以检测到许多低浓度生物标志物。与单一纳米基元相比，将纳米基元可控负载到载体上能有效的达到信号放大的目的。通过将特定的纳米基元负载或封装到载体中，能够有效的提高单个微/纳结构的信号，是提升性能的有效途径。目前，基于疏水量子点的荧光纳米组装探针在合成策略上主要分为挥发诱导自组装法、聚合物微球包埋法、模板组装法三类。其中，挥发诱导自组装法利用有机溶剂挥发将疏水量子点聚集为团簇结构，所获得的荧光微球存在尺寸大小和尺寸分布均一性难控制的缺点；聚合物微球包埋法利用聚苯乙烯等微球内部疏水腔直接包埋疏水量子点，但存在量子点仅能浅表层负载、量子点易泄露、微球发光强度较低等问题；模板组装法主要利用二氧化硅等载体，通过共价偶连或者静电吸附组装量子点基元，虽可有效解决尺寸控制、并在一定程度上解决负载量低的问题，但现有模板一般为实心无孔模板，无法实现量子点在模板内部填充。基于介孔二氧化硅的模板组装法可提供更多的表面及内部空间进行量子点的负载，其组装率提升的同时，量子点因其包覆在二氧化硅内部稳定性也大大提升，但存在的问题在于组装一层量子点后其大孔结构仍然存在，如何有效利用大孔径内部空间进行量子点的三维负载，进而最大化荧光微球的亮度仍是一项挑战。
本发明以大孔径树枝状二氧化硅为载体，利用其垂直的中心径向孔通道及内部大量的空间，可提供大量的功能纳米基元的负载表面；利用载体表面的配体与纳米粒子表面的亲和作用(如配位作用)将疏水纳米粒子与载体在有机相直接组装，可确保纳米基元的高负载密度以及对其表面化学的保持；同时利用PAMAM表面富含的多个氨基基团与量子点的配位作用，可实现有机相的量子点-PAMAM多层交替负载，大大提升了量子点的载体内部空间利用率，实现疏水量子点对孔道空间的完全填充，有效的增强荧光微球的荧光强度，随后对组装体进行表面修饰使其可在水介质中稳定存在，并进一步将其用于侧流免疫层析试纸条检测新型冠状病毒棘突蛋白(S1)受体结合域(RBD)，一种位于新型冠状病毒S蛋白S1亚基的受体结合域。
发明内容
针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球及其应用，本发明的荧光微球是由量子点、树枝状聚酰胺胺(PAMAM)、巯基化树枝状介孔二氧化硅(dSiO2-SH)微球模板组成的，其制备方法中包含大孔径树枝状二氧化硅模板的制备，量子点-PAMAM多层组装，通过树枝状介孔二氧化硅内高效负载大量的油相量子点，可实现荧光信号增强的目的。本发明的荧光微球具有优异荧光特性、良好生物相容性等优良特性。
所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于该荧光微球的制备方法为：首先通过调整优化反应条件，制备了具有大孔径的树枝状二氧化硅模板，并进一步进行表面修饰接枝巯基，随后以巯基化树枝状二氧化硅dSiO2-SH模板为起始材料，以油酸修饰的CdSe/CdS/ZnS量子点QDs为待组装的油相量子点，利用dSiO2-SH 模板上巯基与量子点中金属的配位作用负载油相量子点，实现油相量子点的第一层组装，之后利用PAMAM聚合物分子的配位连接作用继续组装油相量子点，获得三层及以上量子点组装且最外层为量子点的dSiO2/QDs微球组装体，随后通过正辛基三甲氧基硅烷OTMS在dSiO2/QDs微球组装体表面发生水解缩合反应，实现dSiO2/QDs微球组装体由表面疏水性向表面亲水性转变，接着通过正硅酸乙酯TEOS在其表面水解生长二氧化硅壳层，然后依次经氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基化修饰和琥珀酸酐进行羧基化修饰，即制备完成。
所述超大孔径的树枝状二氧化硅模板的制备方法为：以十六烷基三甲基溴化铵为模板，水杨酸钠为结构导向剂，三乙醇胺作为催化剂，以水为溶剂，于70-90℃下搅拌反应0.5～2h后，加入硅源硅酸四乙酯，继续搅拌反应2～5h，即制得所述超大孔径的树枝状二氧化硅模板。超大孔径的树枝状二氧化硅模板的制备方法中，通过调整十六烷基三甲基溴化铵与水杨酸钠的投料比，反应时间等一系列实验参数，制备了一种具有具有超大孔径的树枝状二氧化硅模板，更有利于用于量子点的多层负载。
所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于制备超大孔径的树枝状二氧化硅模板的过程中，所述十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸钠和三乙醇胺的质量比为1:0.6～0.9:0.1～0.3，优选为1:0.7～0.8:0.18～0.22；所述十六烷基三甲基溴化铵质量与硅酸四乙酯体积之比为(0.06～0.1)g:1mL。
所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于该荧光微球的具体制备方法为，包括以下步骤：
1)多层量子点负载的巯基化树枝状二氧化硅/量子点dSiO2/QDs复合微球的制备
步骤A：将巯基化树枝状二氧化硅dSiO2-SH模板，加入至含有油酸修饰的 CdSe/CdS/ZnS量子点QDs溶液中，超声5-10min，之后离心除去上清，洗涤除去多余 QDs，得到一层量子点组装的dSiO2/QDs微球组装体；
步骤B：将步骤A所得组装体加入至含有过量PAMAM的溶液中，超声5-20min 后，离心除去上清，洗涤除去多余PAMAM，得到经PAMAM修饰后的组装体；
步骤C：以步骤B所得PAMAM修饰的组装体为原料，重复上述步骤A的操作，即可在组装体上再次组装一层量子点；按照此方法，制备三层及以上量子点组装且最外层为量子点的dSiO2/QDs微球组装体；
2)表面有机硅烷修饰的SQ-OTMS的制备
步骤S1：向步骤1)所得dSiO2/QDs微球组装体中加入正辛基三甲氧基硅烷OTMS，超声混匀后加入甲醇和氨水，超声混合20-60min实现微球组装体从油相转移至水相，离心后除去上清液，用甲醇洗涤一次除去多余的OTMS；
步骤S2：进一步在沉淀中加入超纯水和氨水，室温下搅拌反应15-20h，反应结束用乙醇洗涤数次并最终分散至乙醇中，获得表面有机硅烷修饰的SQ-OTMS产物的分散液；
3)表面生长二氧化硅壳层的微球组装体的制备
向步骤2)所得表面有机硅烷修饰的SQ-OTMS产物的分散液中，加入超纯水和氨水，搅拌下加入硅酸四乙酯，使得在SQ-OTMS上生长二氧化硅壳，反应结束后将产物离心，并用乙醇洗涤数次，得到巯基化树枝状二氧化硅/量子点/二氧化硅微球，将其标记为SQS；
4)氨基-羧基化SQS微球的制备
将步骤3)所得SQS微球分散于乙醇溶剂中，随后加入氨水和氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应10-15h后，将其离心用乙醇纯化，得到氨基修饰的SQS微球，然后加入至含有琥珀酸酐的有机溶液中，并反应3-5h，离心并乙醇和水洗涤数次后，得到羧基修饰的 SQS微球，即制备完成。
所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于步骤1)中，dSiO2-SH模板上总计组装三层QDs量子点，第一层量子点的投料质量是dSiO2-SH模板质量的200％；第二层量子点的投料质量是dSiO2-SH模板质量的160％；第三层量子点的投料质量是dSiO2-SH模板质量的140％。
所述的一种基于量子点逐层亲和组装的荧光微球，其特征在于步骤2)中正辛基三甲氧基硅烷OTMS的体积与步骤1)中dSiO2-SH模板的质量之比为(15～25)ul:1mg；步骤2)的步骤S1中，正辛基三甲氧基硅烷OTMS、甲醇和氨水的体积之比是 1:100～200:2～4；步骤2)的步骤S1中正辛基三甲氧基硅烷OTMS与步骤S2中氨水体积之比是1:2～4，氨水质量浓度是25～30％。
所述的一种基于量子点逐层亲和组装的荧光微球，其特征在于步骤3)中，硅酸四乙酯与氨水的体积比为1:3～5，氨水质量浓度是25～30％；步骤3)中硅酸四乙酯体积与步骤1)中dSiO2-SH模板的质量之比为(10～20)ul:1mg。
所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于步骤4)中氨丙基三乙氧基硅烷的体积与步骤1)中dSiO2-SH模板的质量之比为(3～5)ul:1mg，步骤 4)中氨丙基三乙氧基硅烷与氨水的体积之比为0.03～0.05:1，氨水质量浓度是25～30％；步骤4)中琥珀酸酐与步骤1)中dSiO2-SH模板的质量之比为8～12:1。
所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球在SARS-CoV-2抗原免疫层析快速检测分析中的应用，其特征在于应用方法包括以下步骤：
1)SQS荧光探针的制备：将荧光微球分散于PB缓冲液中，加入EDC和Sulfo-NHS 并搅拌反应20-40min，以活化缓冲液中的羧基化SQS微球表面羧基；将活化的微球离心弃去上清并分散于PB缓冲液中，然后加入SARS-CoV-2S1蛋白单克隆抗体，于室温下反应2～3h，再加入乙醇胺封闭1～3h；反应结束后，将产物用PB缓冲液洗涤数次，即得SQS荧光探针；
2)检测试纸条的制备：将SQS荧光探针溶于PB缓冲溶液中，并均匀喷涂在结合垫上，干燥；将SARS-CoV-2S1蛋白单克隆抗体和羊抗鼠抗体分别固定在NC膜的T 线和C线上，然后干燥；最后将吸水纸、NC膜、结合垫和样品垫依次组装，切割形成免疫层析试纸，备用；
3)标准曲线的绘制：将一系列不同浓度的含SARS-CoV-2S1 RBD蛋白的溶液，分别滴加到免疫层析试纸的样品垫上，溶液在毛细作用下逐渐向免疫层析试纸的NC膜上层析，20-30min后，拍摄NC膜上T线的照片，T线区上显示红色信号，用颜色识别软件读取T线RGB值获得T线区的红色信号强度R值，以该红色信号R值为纵坐标、 SARS-CoV-2S1 RBD蛋白的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程；
4)实际样品的检测：将含有样品的溶液滴加到免疫层析试纸的样品垫上，溶液在毛细作用下逐渐向免疫层析试纸的NC膜上层析，20-30min后，拍摄NC膜上T线的照片，T线区上显示红色信号，用颜色识别软件读取T线RGB值获得T线区的红色信号强度R值，代入步骤3)所得线性回归方程，即可推断出样品中的SARS-CoV-2S1 RBD 蛋白含量。
本发明基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球的制备方法中，提供了一种在树枝状二氧化硅微球表面巯基改性的方法，通过乙醇/氨水/水解体系，3-巯基丙基三甲氧基硅烷在表面水解并接枝在树枝状二氧化硅表面。并提供了一种基于PAMAM介导的逐层组装方法，利用PAMAM表面氨基与金属量子点的配位作用，可实现油相自组装，突破常规依赖静电作用的水相层层自组装技术的局限性。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果是：
1、使用具有垂直径向孔通道的树枝状介孔二氧化硅微球为载体，由于其大量的孔道提供了大量的内部空间可用于量子点进行组装，与常规的胶体二氧化硅相比其大的比表面积能够负载更多的量子点，从而实现最大化的信号放大策略。
2、利用巯基-金属的配位作用可在模板上均匀负载大量量子点，无需对量子点表面进行改性，最大化的保留了量子点的荧光特性。
3、使用富含氨基基团的PAMAM，能够实现多层组装量子点的同时，很大程度保持量子点的荧光性能，极大的减小了实验过程中因表面修饰带来的荧光损失。
4、通过配位作用进行多层组装量子点，可直接负载高荧光性能的油相量子点而无需对量子点进行改性或相转移步骤，突破常规依赖静电作用的水相层层自组装技术的局限性。
总之，本发明利用巯基化树枝状介孔二氧化硅作为模板，以PAMAM作为中间介质层，分别利用巯基-金属配位作用和氨基-金属配位作用实现了QDs量子点在二氧化硅模板上的多层负载，目的是最大化的利用树枝状介孔二氧化硅的内部空间，实现量子点的高密度填充，制备具有高发光性能的荧光探针。随后利用正辛基三甲氧基硅烷进行表面改性，表面生长二氧化硅，使其易与生物介质相容。最后将其用于侧流免疫层析试纸条，检测新型冠状病毒棘突蛋白受体结合域(SARS-CoV-2S1 RBD)，实现低浓度下的目标检测。
附图说明
图1为本发明实施例2中制备基于量子点逐层亲和组装的荧光微球的工艺流程示意图；
图2a为本发明实施例2中dSiO2-SH模板的透射电镜图以及对应的切片电镜图；
图2b为本发明实施例2中dSiO2-SH模板负载一层量子点之后的透射电镜图以及对应的切片电镜图；
图2c为本发明实施例2中dSiO2-SH模板负载二层量子点之后的透射电镜图以及对应的切片电镜图；
图2d为本发明实施例2中dSiO2-SH模板负载三层量子点之后的透射电镜图以及对应的切片电镜图；
图2e为本发明实施例2中巯基化树枝状二氧化硅/量子点/二氧化硅(SQS)微球的透射电镜图以及对应的切片电镜图；
图3a为实施例1中不同投料比率下的五种dSiO2/QDs1微球的负载比率结果；
图3b实施例1中不同投料比率下的五种dSiO2/QDs2微球的负载比率结果；
图3c为不同投料比率下的五种dSiO2/QDs3微球的负载比率结果；
图3d为复合微球的荧光强度结果对比图；
图4A为免疫层析试纸检测SARS-CoV-2S1 RBD蛋白溶液后的NC膜的拍摄照片；
图4B为实施例2中绘制的标准曲线图；
图4C为实施例2中得到的线性回归方程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明中氨水的质量分数均在25～28％。
实施例1：
1、巯基化树枝状二氧化硅(dSiO2-SH)模板的合成
将0.136g三乙醇胺溶于50ml超纯水中，在油浴锅中80℃磁力搅拌反应0.5h，加入0.684g十六烷基三甲基溴化铵、0.515g水杨酸钠继续反应1h，加入8ml硅酸四乙酯继续搅拌反应3.5h，反应结束离心除去上清液，沉淀用无水乙醇洗涤，将沉淀溶于100ml 盐酸和100ml的甲醇混合溶液中，在水浴锅中60℃磁力搅拌6h萃取除去有机模板，重复萃取一次，然后将产物用无水乙醇溶解洗涤三遍，产品溶解分散在100ml的无水乙醇中。在上述溶液中加入100ml乙醇、2.5ml氨水、300ul(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，室温下剧烈搅拌反应12h。最后离心收集沉淀，用乙醇洗涤三遍，分散在100ml乙醇中，获得dSiO2-SH模板。
2、一层量子点负载的巯基化树枝状二氧化硅/量子点复合微球的制备
取含有10mg上述制备的dSiO2-SH模板的乙醇分散液，离心除去上清，待沉淀稍干后，加入10mg/ml油酸修饰的CdSe/CdS/ZnS量子点(QDs)的甲苯溶液0.4、0.8、1.2、1.6 或2.0ml，超声7min，离心除去上清，加入少量甲苯洗涤除去多余QDs，即得一层量子点负载的巯基化树枝状二氧化硅/量子点复合微球，将其标记为dSiO2/QDs1。
按照投料比率＝QDs量子点的投料质量/dSiO2-SH模板的质量×100％，按照上述的操作步骤，上述方法制备的五种dSiO2/QDs1微球，第一层量子点的投料比率依次分别为40％、80％、120％、160％、200％。
按照负载比率＝QDs量子点的负载质量/dSiO2-SH模板的质量×100％。(通常溶液中量子点浓度与其荧光强度呈现正相关的线性关系，由于量子点高密度存在将引起荧光的自吸收现象，因此采用检测量子点母液及对应组装后剩余上清液的荧光之差，来计算实际组装率，计算公式：量子点负载质量＝量子点母液浓度*(量子点负载前母液荧光强度 -量子点负载之后的上清液荧光强度)/量子点负载前母液荧光强度，计算出QDs量子点在dSiO2-SH模板上的实际负载量。
不同投料比率下，上述五种dSiO2/QDs1微球的负载比率结果见图3a。从图3a中可以看出，第一层量子点的投料比率在200％时，实验效果最好。
3、二层量子点负载的巯基化树枝状二氧化硅/量子点复合微球的制备
第一层量子点的投料比率在200％后，继续负载第二层量子点，步骤如下：将步骤2制备的dSiO2/QDs1微球(投料比率200％)加入4ml含3mg/ml PAMAM的乙醇溶液中，超声10min，离心除去上清，用乙醇洗涤除去多余PAMAM，待乙醇挥发后，加入含 10mg/ml QDs的甲苯溶液0.4、0.8、1.2、1.4或1.6ml，超声7min，离心除去上清，加入少量甲苯洗涤除去多余QDs，得到第二层量子点的投料比率依次分别为40％、80％、 120％、140％、160％的五种复合微球，将其均标记为dSiO2/QDs2。不同投料比率下，上述六种dSiO2/QDs2微球的负载比率结果见图3b。从图3b中可以看出，第二层量子点的投料比率在160％时，实验效果最好。
4、三层量子点负载的巯基化树枝状二氧化硅/量子点复合微球的制备
第二层量子点的投料比率在160％后，继续负载第三层量子点，步骤如下：将步骤3制备的dSiO2/QDs2微球(投料比率160％)，加入4ml含3mg/ml PAMAM的乙醇溶液，超声10min，离心除去上清，用乙醇洗涤除去多余PAMAM，待乙醇挥发后，再加入含 10mg/ml QDs的甲苯溶液0.4、0.8、1.0、1.2或1.4ml，超声7min，离心除去上清，加入少量甲苯洗涤除去多余QDs，最后分散至甲苯溶液中，获得三层量子点负载的SQ微球，即得到第三层量子点的投料比率依次分别为40％、80％、100％、120％或140％的五种复合微球，将其均标记为dSiO2/QDs3。不同投料比率下，上述五种dSiO2/QDs3微球的负载比率结果见图3c。从图3c中可以看出，第三层量子点的投料比率在140％时，实验效果最好。
将步骤2制备的五种负载一层量子点的dSiO2/QDs1复合微球，步骤3制备的五种负载两层量子点的dSiO2/QDs2复合微球，以及步骤4中制备的五种dSiO2/QDs3复合微球，上述复合微球检测的荧光强度结果一并汇总于图3d中。图3d是用图3a-c选取点的纵坐标作为横坐标，表明负载量提高-荧光强度增加的关系。可以看出，第一层、第二层、第三层量子点的投料比率分别在200％、160％和140％时，最终复合微球产品的荧光强度较高。
实施例2：
一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球(即SQS荧光探针)的制备工艺，制备工艺的步骤如以下步骤1～步骤5(制备工艺参见图1中)：
1、巯基化树枝状二氧化硅(dSiO2-SH)模板的合成
将0.136g三乙醇胺溶于50ml超纯水中，在油浴锅中80℃磁力搅拌反应0.5h，加入0.684g十六烷基三甲基溴化铵、0.515g水杨酸钠继续反应1h，加入8ml硅酸四乙酯继续搅拌反应3.5h，反应结束离心除去上清液，沉淀用无水乙醇洗涤，将沉淀溶于100ml 盐酸和100ml的甲醇混合溶液中，在水浴锅中60℃磁力搅拌6h萃取除去有机模板，重复萃取一次，然后将产物用无水乙醇溶解洗涤三遍，产品溶解分散在100ml的无水乙醇中。在上述溶液中加入100ml乙醇、2.5ml氨水、300ul(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，室温下剧烈搅拌反应12h。最后离心收集沉淀，用乙醇洗涤三遍，分散在100ml乙醇中，获得dSiO2-SH模板。dSiO2-SH模板的透射电镜图以及对应的切片电镜图如图2a中所示。
2、多层量子点负载的巯基化树枝状二氧化硅/量子点(dSiO2/QDs3)复合微球的制备，按照第一层、第二层、第三层量子点的投料比率分别在200％、160％和140％进行制备：
取含有10mg上述制备的dSiO2-SH模板的乙醇分散液，离心除去上清，待沉淀稍干后，加入10mg/ml油酸修饰的CdSe/CdS/ZnS量子点(QDs)的甲苯溶液2ml，超声7min，离心除去上清，加入少量甲苯洗涤除去多余QDs，待沉淀稍干后，加入4ml含3mg/ml PAMAM的乙醇溶液，超声10min，离心除去上清，用乙醇洗涤除去多余PAMAM，待乙醇挥发后，加入1.6ml含10mg/ml的QDs的甲苯溶液，超声7min，离心除去上清，加入少量甲苯洗涤除去多余QDs，待沉淀稍干后，加入4ml含3mg/ml PAMAM的乙醇溶液，超声10min，离心除去上清，用乙醇洗涤除去多余PAMAM，待乙醇挥发后，再加入1.4ml 10mg/ml的QDs甲苯溶液，超声7min，离心除去上清，加入少量甲苯洗涤除去多余QDs，最后分散至甲苯溶液中，获得三层量子点负载的SQ微球。
dSiO2-SH模板负载一层量子点之后的透射电镜图以及对应的切片电镜图如图2b中所示，负载二层量子点之后的透射电镜图以及对应的切片电镜图如图2c中所示，负载三层量子点之后的透射电镜图以及对应的切片电镜图如图2d中所示。如图可知由图2a 到图2d，图中量子点的负载量逐渐增加，与实验获得的负载率逐渐提高相符合，证实了量子点多层负载的成功。
3、巯基化树枝状二氧化硅/量子点/二氧化硅(SQS)微球的制备
将步骤2获得的SQ微球分散液离心后除去上清液，向固体沉淀中加入200ul正辛基三甲氧基硅烷(OTMS)，超声混合均匀后向溶液中加入30ml甲醇和750ul氨水的混合溶液，超声混合30min以实现SQ微球从油相转移至水相。将反应物离心后除去上清液，用甲醇洗涤一次除去多余的OTMS，进一步在沉淀中加入33ml超纯水和625ul氨水，室温下搅拌反应18h，反应结束用乙醇洗涤三次并最终分散至20ml乙醇中，获得表面有机硅烷修饰的SQ-OTMS产物。向上述的产物加入5ml超纯水，0.625ml氨水，搅拌反应8h生长二氧化硅壳，每小时加入20ul硅酸四乙酯，在8h内共计加入160ul硅酸四乙酯。反应结束将产物离心，并用乙醇洗涤三次获得最终产品(SQS)。
所述巯基化树枝状二氧化硅/量子点/二氧化硅(SQS)微球的透射电镜图以及对应的切片电镜图如图2e中所示，可观察到较薄的硅层，证明二氧化硅的成功包覆。
4、羧基化SQS微球的制备
将步骤3获得的SQS微球溶于40ml乙醇溶液，随后加入1mL氨水，40ul氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应12h，得到氨基修饰的SQS微球。将其离心用乙醇纯化，然后分散在20mL含有5mg/mL琥珀酸酐的N,N-二甲基甲酰胺中并反应4h，得到羧基修饰的SQS微球。用乙醇和水洗涤数次后，将其分散在PB缓冲液(0.01M，pH＝6.0)中以供进一步使用。
5、SQS荧光探针的制备
首先，取步骤4中含有2mg羧基化SQS微球的PB缓冲液(0.01M，pH＝6.0)，加入1.25mg EDC和1.25mg Sulfo-NHS并搅拌反应30min，以活化缓冲液中的羧基化 SQS微球表面羧基。将活化的微球离心弃去上清并重新分散于相同体积的PB缓冲液 (0.01M，pH＝7.4)中，然后加入80ug SARS-CoV-2S1蛋白单克隆抗体(RBD5313，海肽)，于室温下反应2.5h，再加入终浓度为2mg/ml的乙醇胺封闭2h。将产物用PB缓冲液(0.01M，pH＝7.4)洗涤两次，然后通过离心收集，并分散于PB缓冲液(0.02M， pH＝7.4，含2.5％BSA，1％蔗糖)中，于4℃下保存。
6、基于SQS荧光探针的免疫层析试纸的制备
首先用样品垫处理液(纯水，含1.2％Tris，0.12％EDTA，0.04％酪蛋白酸钠，1％海藻糖，0.5％吐温-20，pH＝7.4左右)处理样品垫，将SQS荧光探针溶于PB缓冲溶液(0.02M，pH＝7.4，含05％BSA，0.1％酪蛋白酸钠，3％海藻糖，0.5％吐温-20)中，并均匀喷涂在结合垫上，并在37℃下干燥。将SARS-CoV-2S1蛋白单克隆抗体(RBD5308，海肽) (1mg/mL)和羊抗鼠抗体(1mg/mL)用划膜喷金仪以1μL/cm的用量分别固定在NC膜的T线和C线上，然后在37℃下干燥。最后将吸水纸、NC膜、结合垫和样品垫依次组装，并用切条机切成3.8mm宽的纸条于干燥条件下密封保存，即制得基于SQS荧光探针的免疫层析试纸。
7、检测及标准曲线的绘制
将一系列不同浓度的含SARS-CoV-2S1 RBD蛋白的溶液，浓度依次为0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20ng/ml的SARS-CoV-2S1 RBD蛋白溶液进行测试，溶液在毛细作用下逐渐向免疫层析试纸的NC膜上层析，30min后，使用智能手机拍照NC 膜，照片结果如图4A所示。图4A所示上的T线区上显示红色信号，图中箭头标识所代表肉眼可视化可见的最低浓度，最低浓度为0.01ng/ml，显示出高的灵敏度。用颜色识别软件Colorpicker读取NC膜上T线区红色信号的RGB值，获得T线区的红色信号强度R值。
以SARS-CoV-2S1 RBD蛋白的浓度作横坐标，以对应NC膜上T线区获得的R值为纵坐标标绘制标准曲线，计算线性回归方程。标准曲线结果图以及线性回归方程分别如图4B和图4C所示。从图4C中可以看出：获得线性回归方程的R2值在0.97以上，准确性较高。由于线性回归方程的R2值较高，能够证明本发明的基于SQS荧光探针的免疫层析试纸，在检测检测SARS-CoV-2S1 RBD蛋白溶液时，具有较高的准确性。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。

Claims (9)

1.一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于该荧光微球的制备方法为：制备一种具有超大孔径的树枝状二氧化硅模板，其表面修饰接枝巯基基团得到巯基化树枝状二氧化硅dSiO2-SH模板，随后以巯基化树枝状二氧化硅dSiO2-SH模板为起始材料，以油酸修饰的CdSe/CdS/ZnS量子点QDs为待组装的油相量子点，利用dSiO2-SH模板上巯基与量子点中金属的配位作用负载油相量子点，实现油相量子点的第一层组装，之后利用树枝状聚酰胺胺(PAMAM)聚合物分子的配位连接作用继续组装油相量子点，获得三层及以上量子点组装且最外层为量子点的dSiO2/QDs微球组装体，随后通过正辛基三甲氧基硅烷OTMS在dSiO2/QDs微球组装体表面发生水解缩合反应，实现dSiO2/QDs微球组装体由表面疏水性向表面亲水性转变，接着通过正硅酸乙酯TEOS在其表面水解生长二氧化硅壳层，然后依次经氨丙基三乙氧基硅烷进行氨基化修饰和琥珀酸酐进行羧基化修饰，即制备完成。
2.如权利要求1所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于所述超大孔径的树枝状二氧化硅模板的制备方法为：以十六烷基三甲基溴化铵为模板，水杨酸钠为结构导向剂，三乙醇胺作为催化剂，以水为溶剂，于70-90℃下搅拌反应0.5～2h后，加入硅源硅酸四乙酯，继续搅拌反应2～5h，即制得所述超大孔径的树枝状二氧化硅模板。
3.如权利要求2所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于制备超大孔径的树枝状二氧化硅模板的过程中，所述十六烷基三甲基溴化铵、水杨酸钠和三乙醇胺的质量比为1:0.6～0.9:0.1～0.3，优选为1:0.7～0.8:0.18～0.22；所述十六烷基三甲基溴化铵质量与硅酸四乙酯体积之比为(0.06～0.1)g:1mL。
4.如权利要求1所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于该荧光微球的具体制备方法为，包括以下步骤：
1)多层量子点负载的巯基化树枝状二氧化硅/量子点dSiO2/QDs复合微球的制备
步骤A：将巯基化树枝状二氧化硅dSiO2-SH模板，加入至含有油酸修饰的CdSe/CdS/ZnS量子点QDs溶液中，超声5-10min，之后离心除去上清，洗涤除去多余QDs，得到一层量子点组装的dSiO2/QDs微球组装体；
步骤B：将步骤A所得组装体加入至含有过量PAMAM的溶液中，超声5-20min后，离心除去上清，洗涤除去多余PAMAM，得到经PAMAM修饰后的组装体；
步骤C：以步骤B所得PAMAM修饰的组装体为原料，重复上述步骤A的操作，即可在组装体上再次组装一层量子点；按照此方法，制备三层及以上量子点组装且最外层为量子点的dSiO2/QDs微球组装体；
2)表面有机硅烷修饰的SQ-OTMS的制备
步骤S1：向步骤1)所得dSiO2/QDs微球组装体中加入正辛基三甲氧基硅烷OTMS，超声混匀后加入甲醇和氨水，超声混合20-60min实现微球组装体从油相转移至水相，离心后除去上清液，用甲醇洗涤一次除去多余的OTMS；
步骤S2：进一步在沉淀中加入超纯水和氨水，室温下搅拌反应15-20h，反应结束用乙醇洗涤数次并最终分散至乙醇中，获得表面有机硅烷修饰的SQ-OTMS产物的分散液；
3)表面生长二氧化硅壳层的微球组装体的制备
向步骤2)所得表面有机硅烷修饰的SQ-OTMS产物的分散液中，加入超纯水和氨水，搅拌下加入硅酸四乙酯，使得在SQ-OTMS上生长二氧化硅壳，反应结束后将产物离心，并用乙醇洗涤数次，得到巯基化树枝状二氧化硅/量子点/二氧化硅微球，将其标记为SQS；
4)氨基-羧基化SQS微球的制备
将步骤3)所得SQS微球分散于乙醇溶剂中，随后加入氨水和氨丙基三乙氧基硅烷，搅拌反应10-15h后，将其离心用乙醇纯化，得到氨基修饰的SQS微球，然后加入至含有琥珀酸酐的有机溶液中，并反应3-5h，离心并乙醇和水洗涤数次后，得到羧基修饰的SQS微球，即制备完成。
5.如权利要求4所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于步骤1)中，dSiO2-SH模板上总计组装三层QDs量子点，第一层量子点的投料质量是dSiO2-SH模板质量的40～220％，优选为200％；第二层量子点的投料质量是dSiO2-SH模板质量的40～180％，优选为160％；第三层量子点的投料质量是dSiO2-SH模板质量的40～160％，优选为140％。
6.如权利要求4所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于步骤2)中正辛基三甲氧基硅烷OTMS的体积与步骤1)中dSiO2-SH模板的质量之比为(15～25)ul:1mg；步骤2)的步骤S1中，正辛基三甲氧基硅烷OTMS、甲醇和氨水的体积之比是1:100～200:2～4；步骤2)的步骤S1中正辛基三甲氧基硅烷OTMS与步骤S2中氨水体积之比是1:2～4，氨水质量浓度是25～30％。
7.如权利要求4所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于步骤3)中，硅酸四乙酯与氨水的体积比为1:3～5，氨水质量浓度是25～30％；步骤3)中硅酸四乙酯体积与步骤1)中dSiO2-SH模板的质量之比为(10～20)ul:1mg。
8.如权利要求4所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球，其特征在于步骤4)中氨丙基三乙氧基硅烷的体积与步骤1)中dSiO2-SH模板的质量之比为(3～5)ul:1mg，步骤4)中氨丙基三乙氧基硅烷与氨水的体积之比为0.03～0.05:1，氨水质量浓度是25～30％；步骤4)中琥珀酸酐与步骤1)中dSiO2-SH模板的质量之比为8～12:1。
9.如权利要求1所述的一种基于量子点逐层亲和组装的高亮度荧光微球在SARS-CoV-2抗原免疫层析快速检测分析中的应用，其特征在于应用方法包括以下步骤：
1)SQS荧光探针的制备：将荧光微球分散于PB缓冲液中，加入EDC和Sulfo-NHS并搅拌反应20-40min，以活化缓冲液中的羧基化SQS微球表面羧基；将活化的微球离心弃去上清并分散于PB缓冲液中，然后加入SARS-CoV-2S1蛋白单克隆抗体，于室温下反应2～3h，再加入乙醇胺封闭1～3h；反应结束后，将产物用PB缓冲液洗涤数次，即得SQS荧光探针；
2)检测试纸条的制备：将SQS荧光探针溶于PB缓冲溶液中，并均匀喷涂在结合垫上，干燥；将SARS-CoV-2S1蛋白单克隆抗体和羊抗鼠抗体分别固定在NC膜的T线和C线上，然后干燥；最后将吸水纸、NC膜、结合垫和样品垫依次组装，切割形成免疫层析试纸，备用；
3)标准曲线的绘制：将一系列不同浓度的含SARS-CoV-2S1 RBD蛋白的溶液，分别滴加到免疫层析试纸的样品垫上，溶液在毛细作用下逐渐向免疫层析试纸的NC膜上层析，20-30min后，拍摄NC膜上T线的照片，T线区上显示红色信号，用颜色识别软件读取T线RGB值获得T线区的红色信号强度R值，以该红色信号R值为纵坐标、新冠S1蛋白的浓度为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程；
4)实际样品的检测：将含有样品的溶液滴加到免疫层析试纸的样品垫上，溶液在毛细作用下逐渐向免疫层析试纸的NC膜上层析，20-30min后，拍摄NC膜上T线的照片，T线区上显示红色信号，用颜色识别软件读取T线RGB值获得T线区的红色信号强度R值，代入步骤3)所得线性回归方程，即可推断出样品中的SARS-CoV-2S1 RBD蛋白含量。
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