CN114989823B - 一种疏水量子点纳米材料、纳米探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种疏水量子点纳米材料、纳米探针、及其制备方法和应用。本发明利用端羧基聚乳酸‑羟基乙酸共聚物(OH‑PLGA‑COOH)作为包覆材料对量子点进行封装得到疏水量子点纳米材料，可稳定存在水相，通过交联剂与生物材料连接，从而获得一种高荧光强度、窄发射的纳米探针。此纳米探针具有耐水氧、无毒、生物相容性好等特性，不仅可用于标记各类生物材料，还可实现高灵敏度生物检测，具有普适性，极大满足现代生物技术和医学检测的需求，在医学检测、医学诊疗领域具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于化学和生物技术领域，涉及一种疏水量子点纳米材料、纳米探针、及其制备方法和应用。
背景技术
随着化学、材料学、生物学等领域的发展，纳米生物技术的研究和应用得到了越来越多研究者的关注，尤其是在生物分析领域。纳米材料得益于其形貌尺寸可控，表面官能团的可修饰性及独特的光学性质，在生物小分子分析领域占据重要地位。相较于传统的检测探针，纳米生物复合探针具有多功能复合、多检测通道、易于信号放大、制备简便等诸多优越性。特别值得关注的是，多种纳米生物探针具有优越的光学性质，可以利用常规光学设备实现生物检测，甚至可以实现裸眼检测。
荧光免疫分析技术是指利用荧光物质对抗体或者抗原分子进行标记，与待分析物的特异性结合后，报告荧光信号，实现对目标分析物的定性或定量检测。纳米荧光探针因其高灵敏度、高特异性且检测仪器简便、低廉的优势，在生物检测、传感和药物分子识别等领域得到了广泛的研究。随着多目标检测物需求的不断增长，对生物检测探针的要求也越来越高。传统的纳米生物探针已满足不了高荧光效率、窄发射、低干扰等检测要求，因此开发一种高荧光强度、窄发射、生物相容性好的新型纳米生物检测探针具有重大意义。
钙钛矿量子点材料相比于传统的荧光材料，具有量子产率高、发射峰窄、斯托克斯位移大、表面易修饰等优势，成为热点研究对象。但是钙钛矿量子点不耐水氧，从而限制了其在生物科学和医学等研究领应用。因此，如何对钙钛矿量子点进行改性，以构建一种能够充分发挥材料优势且具有生物相容性好的纳米生物探针是亟待解决的。
发明内容
本发明提供一种疏水量子点纳米材料、纳米材料的纳米探针、及二者的制备方法和应用。
本发明提供的疏水量子点纳米材料，包括量子点和包覆在所述量子点表面的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(OH-PLGA-COOH)。
根据本发明的实施方案，所述疏水量子点纳米材料为纳米晶。
根据本发明的实施方案，所述量子点的平均粒径为5～20nm，例如10～15nm；示例性地，所述量子点的平均粒径为12nm。
根据本发明的实施方案，所述疏水量子点纳米材料的平均粒径大于所述量子点的平均粒径，例如5～100nm，优选10～80nm，示例性地，10nm、15nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm。
根据本发明的具体实施方案，所述疏水量子点纳米材料的平均粒径为80nm。
根据本发明的实施方案，所述包覆为全部包覆。
根据本发明的实施方案，所述疏水量子点纳米材料由端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(OH-PLGA-COOH)包覆在量子点表面制备得到。
根据本发明的实施方案，所述量子点可以选自修饰或未修饰的如下所示的量子点：钙钛矿量子点、碳量子点、镉量子点或硫量子点等，优选为修饰或未修饰的钙钛矿量子点。其中，所述修饰指可以采用荧光基团对(例如巯基十一氨酸(Sulfydryl))对量子点进行修饰。示例性地，所述量子点可以为CsPbBr3钙钛矿量子点或Sulfydryl-PQDs钙钛矿量子点。
根据本发明的实施方案，所述CsPbBr3钙钛矿量子点在可见光下呈淡黄色，在紫外光(例如365nm激发)下呈绿色。
根据本发明示例性地实施方案，所述Sulfydryl-PQDs钙钛矿量子点在可见光下呈青色，在紫外光(例如365nm激发)下呈现蓝色。
根据本发明的实施方案，所述端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(OH-PLGA-COOH)的数均分子量为100～100000，优选为30000。优选地，所述端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物由外消旋丙交酯(DLLA)与乙交酯(GA)无规共聚合成，所述外消旋丙交酯(DLLA)与乙交酯(GA)的百分比为(50～90):(10～50)，优选为90:10、75:25、80:20、60:40、50:50。
根据本发明示例性地实施方案，所述疏水量子点纳米材料为疏水钙钛矿纳米材料，记为PQDs@PLGA，其包括CsPbBr3钙钛矿量子点和包覆在所述CsPbBr3钙钛矿量子点表面的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(OH-PLGA-COOH)。
根据本发明的实施方案，所述疏水量子点纳米材料具有与量子点几乎相同的光学性质；例如，PQDs@PLGA具有与CsPbBr3钙钛矿量子点几乎相同的光学性质。
本发明还提供上述疏水量子点纳米材料的制备方法，包括如下步骤：以端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(OH-PLGA-COOH)对量子点的表面进行包覆，得到所述疏水量子点纳米材料。
根据本发明的实施方案，所述疏水量子点纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(A1)将量子点的制备原料与端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物在溶剂中混合，待完全溶解后，加入配体材料，形成稳定溶液；
(A2)将上述稳定溶液加入到反溶剂中，形成疏水量子点纳米材料溶液，而后利用反溶剂过饱和法析出所述疏水量子点纳米材料。
根据本发明的实施方案，步骤(A1)中，所述量子点具有如上文所述的含义。根据所用的量子点，可以选择制备原料。例如，CsPbBr3钙钛矿量子点的制备原料包括CsBr和PbBr2。
其中，所述量子点可以采用本领域已知方法制备得到。
根据本发明的实施方案，步骤(A1)中，对于量子点的制备原料与端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物的混合顺序不做限定，例如可以同时将量子点的制备原料与端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物加入溶剂中，也可以先将量子点的制备原料加入溶剂中，再向溶剂中加入端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
根据本发明的实施方案，步骤(A1)中，所述量子点和端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(OH-PLGA-COOH)的摩尔质量比为1mmol:(300～600)mg，例如为0.2mmol:90mg。
根据本发明的实施方案，步骤(A1)中，所述端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物与溶剂的质量体积比为(5～30)mg:1mL，例如为90mg:5mL。
根据本发明的实施方案，步骤(A1)中，所述溶剂可以选自的N,N-二甲基二酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)中的一种或两种。
根据本发明的实施方案，步骤(A1)中，所述配体材料可以选自油酸、油胺和/或巯基十一氨酸(Sulfydryl)，优选为油酸和油胺，或者为油酸、油胺和巯基十一氨酸。
优选地，所述配体材料的加入量与溶剂的体积之比为(0.5～5):10，例如(1～3):10，示例性为0.75:5。
根据本发明的实施方案，步骤(A1)在无水无氧条件下进行。优选为惰性气氛中进行，例如氮气。
根据本发明的实施方案，步骤(A2)中，所述反溶剂选自甲苯、氯苯、正己烷中的至少一种。
根据本发明的实施方案，步骤(A2)包括：先将所述稳定溶液滴加到反溶剂中，得到疏水量子点纳米材料溶液；再将所述疏水量子点纳米材料溶液加入到过量的反溶剂中，使疏水量子点纳米材料析出。
优选地，所述稳定溶液与反溶剂的体积之比为(0.1～5):10，例如为(0.5～3):10。
优选地，所述滴加为缓慢滴加。
优选地，所述滴加在剧烈搅拌反溶剂的条件下进行。
优选地，所述疏水量子点纳米材料溶液与反溶剂的体积之比为(0.5～3):15，例如为(1～2.5):15。
优选地，将所述疏水量子点纳米材料溶液加入到过量的反溶剂中，加热搅拌反应，析出得到所述疏水量子点纳米材料。例如，搅拌反应的时间为20～60h，比如30h、40h、48h、50h。例如，搅拌反应的温度为30～60℃、例如40～50℃，比如30℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃、60℃。
根据本发明的实施方案，所述疏水量子点纳米材料的制备方法还包括步骤(A3)，从溶液体系中将析出的疏水量子点纳米材料分离出来，干燥，得到固态的疏水量子点纳米材料。
根据本发明的实施方案，所述疏水量子点纳米材料的制备方法还包括步骤(A4)，将步骤(A3)得到的固态的疏水量子点纳米材料分散在水中，得到疏水量子点纳米材料的水分散液。
本发明还提供由上述方法制备得到的疏水量子点纳米材料。
本发明还提供上述疏水量子点纳米材料在医疗诊断探针或试剂盒中的应用。例如，所述医疗诊断探针可以为荧光生物检测探针或细胞成像探针。
本发明还提供一种纳米探针，所述纳米探针包含所述疏水量子点纳米材料。
根据本发明的实施方案，所述纳米探针为所述疏水量子点纳米材料标记的生物材料，由所述疏水量子点纳米材料与生物材料偶联形成。
根据本发明的实施方案，所述生物材料可以选自抗体、适配体、多肽等中的一种、两种或更多种，优选为抗体。示例性地，所述抗体为IgG抗体；例如人IgG抗体。
根据本发明的实施方案，所述纳米探针在365±5nm激发下，可在500～540nm范围内产生强荧光，在515±5nm产生最强发射。
根据本发明示例性地方案，所述纳米探针为疏水钙钛矿纳米材料PQDs@PLGA标记的人IgG抗体，由PQDs@PLGA与人IgG抗体偶联形成。
根据本发明的实施方案，疏水量子点纳米材料与生物材料的质量比为(10～50):1，优选为20:1。
根据本发明的实施方案，所述纳米探针的平均粒径在100～500nm，优选为200nm。
本发明还提供上述纳米探针的制备方法，所述制备方法包括将疏水量子点纳米材料和生物材料偶联形成所述纳米探针。
根据本发明的实施方案，所述制备方法包括如下步骤：将疏水量子点纳米材料分散在交联反应剂溶液中，向其中加入生物材料和表面活性剂，得到所述纳米探针；
所述疏水量子点纳米材料和生物材料具有如上文所述的含义。
根据本发明的实施方案，所述纳米探针的制备方法包括如下步骤：
(B1)将疏水量子点纳米材料分散在交联反应剂溶液中，搅拌，活化所述疏水量子点纳米材料表面的羧基；
(B2)将生物材料和表面活性剂加入步骤(B1)得到的溶液中，得到所述纳米探针。
根据本发明的实施方案，所述交联反应剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；优选地，EDC和NHS的质量比为1:(3～10)，例如1:5。
根据本发明的实施方案，所述交联反应剂溶液中的溶剂为PBS缓冲液(例如pH＝7.3的PBS缓冲液)。
根据本发明的具体实施方案，所述交联反应剂溶液为EDC和NHS的混合液；例如，可以分别配制1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，并将两种溶液混合，得到EDC和NHS的混合液。优选地，所述EDC和NHS的混合液的使用方法为现配现用。
根据本发明的具体实施方案，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液的质量浓度为6mg/mL；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液的质量浓度为30mg/mL。优选地，两种溶液混合时，EDC溶液和NHS溶液的体积比为1:1。
根据本发明的实施方案，所述生物材料和交联反应剂的质量比为(5～15):1，例如为15:1、14:1、13:1、12:1、11:1、10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1。
根据本发明的实施方案，为了充分活化疏水量子点纳米材料表面的羧基，在分散时，需在室温下进行磁力搅拌。比如，搅拌的时间为10～60min，例如为10min、20min、30min、40min、50min、60min。
根据本发明的实施方案，所述表面活性剂的加入可以避免疏水量子点纳米材料的团聚。优选地，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，例如为曲拉通X-100、烷基多苷APG、脂肪醇聚氧乙烯醚AEO中的一种、两种或三种。
根据本发明的实施方案，所述生物材料与所述表面活性剂的质量体积比为1mg:(0.1～1)μL。
根据本发明的实施方案，所述生物材料和疏水量子点纳米材料的质量比为1:(10～50)，例如为1:20。
根据本发明的实施方案，步骤(B2)中，将生物材料和表面活性剂加入步骤(B1)得到的溶液中时，需进行摇床温和反应；优选地，摇床温和反应的时间为10～60min，例如为10min、20min、30min、40min、50min、60min。
根据本发明的实施方案，步骤(B2)中还包括将得到的纳米探针冷藏保存。比如，所述冷藏保存的温度为1～5℃，例如1℃、2℃、3℃、4℃、5℃。
本发明还提供由上述方法制备得到的纳米探针。
本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含所述纳米探针。
本发明还提供上述疏水量子点纳米材料、纳米探针或试剂盒在医学检测、医学诊疗等领域中的应用。优选地，所述医学检测可以为细胞成像或生物检测。
根据本发明的实施方案，所述纳米探针或试剂盒可以特异性识别下述目标分析物：抗体、适配体、多肽、抗原、靶分子、蛋白酶等。例如为抗体，例如人IgG抗体等。例如为抗原，例如羊抗人IgG、兔抗人IgG、鼠抗人IgG等。
本发明还提供了上述纳米探针或试剂盒特异性识别上述目标分析物的方法，所述方法包括：将纳米探针与所述目标分析物接触，通过荧光检测进行识别。
根据本发明的实施方案，所述方法包括如下步骤：
(S1)用目标分析物或元素标记的目标分析物包被孔板，孵育后清洗被目标分析物或元素标记的目标分析物包被的孔板；
(S2)对步骤(S1)得到的包被孔板进行封闭处理，清洗；
(S3)将纳米探针加入至步骤(S2)得到的封闭的包被孔板中，与所述目标分析物接触、清洗，通过荧光检测，识别目标分析物。
根据本发明的实施方案，所述目标分析物具有如上文所述的含义。示例性地，所述目标分析物为抗原，例如为Eu标记的抗人IgG。
根据本发明的实施方案，所述清洗的方式为：采用PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，含万分之五体积浓度的Tween-20)进行清洗。优选地，清洗的次数为3～5次。
根据本发明的实施方案，步骤(S1)中，标记目标分析物的元素为Eu。
根据本发明的实施方案，所述孔板为96孔板。
根据本发明的实施方案，步骤(S1)中，所述孵育在孔板上进行，例如96孔板上进行。
根据本发明的实施方案，所述孵育为低温过夜孵育。例如，孵育的温度为1～5℃，比如1℃、2℃、3℃、4℃、5℃。例如，孵育的时间为8～18h，比如8～14h、10～12h。
根据本发明的实施方案，所述封闭处理包括：用脱脂奶粉溶液封闭步骤(S2)得到的包被孔板。例如，所述脱脂奶粉可以为脱脂牛奶粉。例如，所述脱脂奶粉溶液的质量分数为5％。
根据本发明的实施方案，所述封闭处理的时间为0.5～2h，温度为30～45℃。根据本发明的具体实施方案，所述封闭处理的时间为1h，温度为37℃。
根据本发明的实施方案，步骤(S3)中，所述接触的时间为0.5～2h，温度为30～45℃。示例性地，所述接触的时间为1h，温度为37℃。
本发明的有益效果：
1.本发明利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物(OH-PLGA-COOH)对量子点进行封装，实现量子点材料在水相的稳定存在，且几乎完全保留了量子点的光学性能；
2.本发明产品通过调整量子点组分，可以得到不同发射波长范围的荧光基团；
3.本发明使用可降解的聚乳酸包覆量子点材料，构建生物纳米探针，既保留量子点高荧光强度、窄发射的同时，又赋予了其良好的生物相容性、无毒、环保等特性；
4.因钙钛矿量子点具有发射峰窄(<20nm)的特点，本发明的疏水量子点纳米晶作为生物纳米探针，可在医学领域用于多分析物的同时检测，并可避免荧光物质发射峰交叉导致的假阴性结果，提升检测可信度，具有普适性，极大满足现代生物技术和医学检测的需求，在医学诊疗领域具有重要意义；
5.本发明提供的基于水相中稳定量子点材料构建的新型生物纳米探针，实现了高灵敏度、高荧光强度的生物检测。
附图说明
图1为制备例1的PQDs量子点的透射电镜图及其晶格条纹；左图代表量子点的透射电镜图，量子点的粒径～12nm；右图代表其条纹间距为0.295nm。
图2为制备例1的PQDs量子点的荧光发射光谱及吸收波谱，量子点的发射峰位为515nm。
图3为制备例2的Sulfydryl-PQDs量子点的荧光发射光谱及吸收波谱，量子点的发射峰为461nm。
图4为实施例1的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶的透射电镜图。
图5为实施例1的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶的光学显微镜图，左图代表纳米晶在420～450nm激发下的荧光成像图，右图代表纳米晶的明场图。
图6为实施例1的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶的荧光发射光谱及吸收波谱。
图7为实施例2的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶与人IgG抗体偶联形成生物纳米探针PQDs@PLGA@IgG的SEM图以及EDS能谱。
图8为实施例3的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶与人IgG抗体偶联形成生物纳米探针PQDs@PLGA@IgG，并与Eu标记抗人IgG进行识别验证的实验示意图。
图9为实施例3的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶与人IgG抗体偶联形成生物纳米探针PQDs@PLGA@IgG，并与Eu标记抗人IgG识别验证的Confocal荧光成像图，双通道488nm和561nm激发。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
下述实施例中使用的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(OH-PLGA-COOH)购买于济南岱罡生物工程有限公司，数均分子量为30000，DLLA:GA的百分比为75:25。
制备例1
PQDs钙钛矿量子点的制备步骤如下：
(1)将42.5mg CsBr和73.4mg PbBr2溶解于5mL的N,N-二甲基二酰胺(DMF)溶剂中，待完全溶解后，加入0.5mL油酸和0.25mL油胺用于稳定溶液；
(2)取上述溶液500μL，置于手套箱中，N2氛围保护下缓慢滴加到10mL剧烈搅拌的甲苯溶液中，即得到PQDs量子点溶液。
(3)将制得的PQDs钙钛矿量子点于10000r/min，20min离心，分离获得上清液，即得到纯化后的PQDs钙钛矿量子点溶液，溶液呈透亮绿色。
图1是制备得到的PQDs钙钛矿量子的透射电镜图及其晶格条纹，左图代表透射电镜图，量子点的粒径大小～12nm，符合CsPbBr3量子点尺寸；右图代表其的条纹间距为0.295nm。说明该方法合成的量子点质量较好，且粒径均一。
图2是制备得到的PQDs钙钛矿量子的荧光发射光谱及吸收波谱。从图2中可以看出，PQDs钙钛矿量子点在365nm激发下可产生强荧光，其发射峰位为515nm，半峰宽为18nm，说明该量子点荧光发射较窄，吸收边同时对应发射峰为515nm。
制备例2Sulfydryl-PQDs钙钛矿量子点的制备
(1)将42.5mg CsBr和73.4mg PbBr2溶解于5mL的N,N-二甲基二酰胺(DMF)溶剂中，待完全溶解后，加入0.5mL油酸、0.25mL油胺、0.2mL巯基十一氨酸(Sulfydryl)用于稳定溶液；
(2)取上述溶液500μL，置于手套箱中，N2氛围保护下，缓慢滴加到10mL剧烈搅拌的甲苯溶液中，即得到PQDs量子点溶液。
(3)将制得的Sulfydryl-PQDs钙钛矿量子点于10000r/min，20min离心，分离获得上清液，即得到纯化后的PQDs钙钛矿量子点溶液，溶液呈透亮青色；紫外灯(365nm)照射下，溶液呈现蓝色。
图3是制备得到的Sulfydryl-PQDs钙钛矿量子的荧光发射光谱及吸收波谱。从图3中可以看出，Sulfydryl-PQDs钙钛矿量子点在365nm激发下可产生强荧光，其发射峰位为461nm。因此，通过调整钙钛矿量子点组分，可以得到不同发射波长范围的荧光基团。
实施例1PQDs@PLGA疏水性钙钛矿纳米晶
为达到疏水效果，在制备例1的基础上，将疏水性的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(OH-PLGA-COOH)包覆到高荧光钙钛矿量子点表面，形成疏水性钙钛矿纳米晶，步骤如下：
(1)将42.5mg CsBr和73.4mg PbBr2与90mg端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物(OH-PLGA-COOH)溶解于5mL的N,N-二甲基二酰胺(DMF)溶剂中，待完全溶解后，加入0.5mL油酸和0.25mL油胺用于稳定溶液；
(2)取上述溶液500μL，缓慢滴加到10mL剧烈搅拌的甲苯溶液中，即得到PQDs@PLGA量子点溶液；再取1mL所得溶液加入15mL甲苯溶液中，搅拌反应48h，使包覆完全，得到疏水PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶。
(3)分离提纯PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶，将其于10000r/min，20min离心，将获得的沉淀物在60℃烘箱中干燥1h，得到淡黄色粉末，紫外灯照射下粉末成绿色。
(4)将粉末分散于水中，室温保存疏水PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶。
图4是实施例1制备得到的疏水PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶的透射电镜图。从图4中可以看出，PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶的平均粒径为80nm，粒径较制备例1变大，说明该端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物对多个PQDs量子点包覆成一个整体形貌，包覆效果好。
图5为实施例1的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶的光学显微镜图。其中，左图代表纳米晶在420～450nm激发下的荧光成像图，右图代表纳米晶的明场图。
图6为在水中放置至少90天的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶的荧光发射光谱及吸收波谱。从图6中可以看出，放置至少90天的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶的PL光谱与纯钙钛矿量子点PQDs所处发射峰位置和半峰宽几乎一致，虽然因其外层包覆一层聚合物导致吸收谱强度降低，但也正因如此PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶能够在水相中稳定存在，且几乎保留了PQDs量子点的光学性质，且包覆粒径均一。
实施例2偶联法制备疏水钙钛矿纳米晶生物纳米探针
为了进一步将疏水钙钛矿纳米晶与生物材料偶联构建新型纳米生物探针，在实施例1的基础上，利用封装包覆材料聚乳酸表面基团，以EDC/NHS作交联剂，与生物材料进行偶联构建一种新型荧光检测探针。具体实施步骤如下：
(1)配制6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和30mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，交联反应使用体积比为1:1，现配现用。
(2)将10mg PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶加入2mL EDC和NHS的混合溶液中，室温、磁力搅拌300r/min，30min，充分活化PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶表面的-COOH。
(3)取10μL人IgG抗体(1mg/mL)和4μL曲拉通X-100加入上述(2)溶液中，摇床温和反应30min，即可得到PQDs@PLGA标记人IgG探针PQDs@PLGA@IgG。
图7为实施例2中的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶与人IgG抗体偶联形成生物纳米探针PQDs@PLGA@IgG的SEM图以及EDS能谱图。从图中可以看中，生物纳米探针PQDs@PLGA@IgG的平均粒径为200nm；聚合物封装包覆的钙钛矿量子点与抗体蛋白偶联成功，且EDS能谱进一步证明其中形成钙钛矿量子点的主元素Pb、Cs、Br的存在。
实施例3纳米探针识别抗原
完成生物纳米探针的构建后，对该探针进行识别功能验证。在实施例2的基础上，采用生物实验中常规实验方法验证该探针识别功能。本实施例使用实施例2制备的纳米探针PQDs@PLGA标记人IgG作为抗体，目标分析物为Eu标记的抗人IgG作为抗原。图8为本实施例生物纳米探针PQDs@PLGA@IgG与Eu标记抗人IgG进行识别验证的实验示意图。
(1)采用96孔板对板底进行包被，将Eu-标记的抗人IgG(10μg/mL)以50μL/well用量包被孔板设定为实验组，4℃过夜孵育；此时，设定对照实验组，板底对其他物质，将牛血清蛋白BSA进行包被孵育的对照组和全空白对照的空白组。
取出包被过的96孔板，分别对实验组、对照组、空白组的孵育孔板进行PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，含万分之五体积浓度的Tween-20)清洗3～5次，洗去多余未包被的Eu-标记的抗人IgG或BSA。
(2)对包被孔板进行封闭处理，配制质量分数为5％脱脂牛奶粉，以200μL/well用量封闭孵育孔板，37℃，1h，对板底为包被抗体的位点进行占据，降低非特异性吸附；对封闭孔板进行PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，含万分之五体积浓度的Tween-20)清洗3～5次，洗去多余脱脂牛奶粉溶液。
(3)加入100μL实施例3中制备的生物纳米探针PQDs@PLGA@IgG到封闭后包被Eu-标记的抗人IgG及包被牛血清蛋白BSA的96孔板中，37℃，1h；对识别孔板进行PBST(PBS缓冲液，pH＝7.3，含万分之五体积浓度的Tween-20)清洗3～5次，洗去多余未被识别的PQDs@PLGA@IgG。
图9为实施例3中的PQDs@PLGA钙钛矿纳米晶与人IgG抗体偶联形成生物纳米探针PQDs@PLGA@IgG，并与Eu标记抗人IgG识别验证的Confocal荧光成像图，双通道488nm和561nm激发。
其中，第一行为实验组，以Eu标记抗人IgG包被孔板，对应图片编号为1～3，PQDs@PLGA标记人IgG识别，在561nm激发通道呈现红色荧光(即编号3图片)，在488nm激发通道呈现绿色荧光(即编号2图片)；Merge代表488nm和561nm双通道激发，呈现红色和绿色荧光的叠加色黄色荧光成像(即编号1图片)。第二行为牛血清蛋白对照组，采用牛血清蛋白进行包被孔板，并加入PQDs@PLGA标记人IgG识别，对应图片编号为4～6；第三行为空白组(Blank)，未进行抗原包被的孔板，加入PQDs@PLGA标记人IgG识别，对应图片编号为7～9。
从图9的荧光成像图中可以看出，实验组因板底包被Eu标记抗人IgG，在561nm激发光下呈现红色荧光图像，识别的人IgG在PQDs@PLGA标记在488nm激发条件下，呈现绿色荧光成像，可以证明抗体-抗原识别成功；同时，对照组使用不能够相互识别的抗原代替及空白组，则分别呈现无红色荧光图像和绿色荧光图像，进一步证明该生物纳米探针不仅偶联成功，同时保留原有识别功能。
上述实施例中的生物材料亦可替换为适配体或多肽，得到钙钛矿纳米晶与适配体或多肽偶联的纳米探针，得到的纳米探针同样具有特异性识别功能。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种纳米探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
（B1）将疏水量子点纳米材料分散在交联反应剂溶液中，搅拌，活化所述疏水量子点纳米材料表面的羧基；
（B2）将生物材料和表面活性剂加入步骤（B1）得到的溶液中，得到所述纳米探针；所述生物材料选自抗体、适配体、多肽中的一种、两种或多种；
所述交联反应剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS；EDC和NHS的质量比为1:(3~10)；
所述疏水量子点纳米材料包括量子点和包覆在所述量子点表面的端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物；所述疏水量子点纳米材料为纳米晶；
所述量子点为CsPbBr3钙钛矿量子点或巯基十一氨酸修饰的CsPbBr3钙钛矿量子点；所述CsPbBr3钙钛矿量子点在可见光下呈淡黄色，在紫外光下呈绿色；所述巯基十一氨酸修饰的CsPbBr3钙钛矿量子点在可见光下呈青色，在紫外光下呈现蓝色。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物的数均分子量为100~100000；
和/或，所述包覆为全部包覆；
和/或，所述量子点的平均粒径为5~20 nm；所述疏水量子点纳米材料的平均粒径大于所述量子点的平均粒径；
和/或，步骤（B1）中，所述疏水量子点纳米材料的制备方法，包括如下步骤：
(A1)将量子点的制备原料与端羧基聚乳酸-羟基乙酸共聚物在溶剂中混合，待完全溶解后，加入配体材料，形成稳定溶液；所述配体材料选自油酸、油胺和/或巯基十一氨酸；
(A2)将稳定溶液加入到反溶剂中，形成疏水量子点纳米材料溶液，而后利用反溶剂过饱和法析出所述疏水量子点纳米材料；所述反溶剂选自甲苯、氯苯、正己烷中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述交联反应剂溶液中的溶剂为PBS缓冲液；
所述生物材料和交联反应剂的质量比为(5~15):1；
所述表面活性剂为非离子表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述非离子表面活性剂为曲拉通X-100、烷基多苷APG、脂肪醇聚氧乙烯醚AEO中的一种、两种或三种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（B2）中，将生物材料和表面活性剂加入步骤（B1）得到的溶液中时，需进行摇床温和反应；
步骤（B2）中还包括将纳米探针冷藏保存。
6.由权利要求1-5任一项所述的制备方法制备得到的纳米探针。
7.根据权利要求6所述的纳米探针，其特征在于，所述纳米探针包含所述疏水量子点纳米材料；
所述纳米探针为所述疏水量子点纳米材料标记的生物材料，由所述疏水量子点纳米材料与生物材料偶联形成；
所述纳米探针的平均粒径在100~500nm。
8.根据权利要求7所述的纳米探针，其特征在于，疏水量子点纳米材料与生物材料的质量比为(10~50):1。
9.一种试剂盒，其特征在于，其包含权利要求6-8任一项所述的纳米探针。
10.权利要求6-8任一项所述的纳米探针或权利要求9所述的试剂盒在医学检测领域中的应用。
11.根据权利要求10的所述应用，其特征在于，所述医学检测为细胞成像或生物检测；所述纳米探针或试剂盒能够特异性识别下述目标分析物：抗体、适配体、多肽、抗原、靶分子或蛋白酶。
12.一种特异性识别目标分析物的方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求6-8任一项所述的纳米探针与目标分析物接触，通过荧光检测进行识别；所述目标分析物为抗体、适配体、多肽、抗原、靶分子或蛋白酶。
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| Matthew G. Panthani et al..In Vivo Whole Animal Fluorescence Imaging of a Microparticle-Based Oral Vaccine Containing (CuInSexS2−x)/ZnS Core/Shell Quantum Dots.《Nano Lett.》.2013,第13卷第4294-4298页. * |
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