CN116183909B - 基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法 - Google Patents

基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法；本发明通过将抗体‑1标记的聚集诱导发光微球溶液和抗体‑2标记的磁性微球溶液混合，再加入含抗原的待测溶液，测定荧光信号值，根据标准曲线得到待测溶液中抗原的浓度。本发明以羧酸修饰的聚集诱导发光（AIE）分子填充的发光微球为信号输出基元，采用识别抗体修饰后再与相应抗体修饰的磁性微球载体复合，利用双抗夹心法或竞争法实现对标志物的选择性识别，进而通过对发光信号强度的测量与标志物形成对应关系，得到一类AIE生物传感器的系统方法；实现对抗原高灵敏度且长程的快速检测。

Description

基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法
技术领域
本发明属于生物检测方法技术领域，尤其涉及基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法。
背景技术
荧光免疫分析(FIA)有更高的灵敏度和检测范围，在临床诊断、食品质量和环境监测等领域有广泛的应用价值【Chemical Engineering Journal2019, 361, 499-507.】。相比较传统酶免疫分析技术(EIA)，FIA可以实现特定蛋白质、小分子毒素和病毒的痕量检测【Immunological Investigations 1987,16, 227-240.】。
如今，为了获得更高的灵敏度和检测限，荧光标记材料不仅要求有较高的荧光效率，而且具有较大的斯托克斯位移以减少串扰。目前，各种荧光标记物广泛应用于荧光免疫分析平台，包括有机染料、量子点、上转化、钙钛矿纳米晶体，使得荧光免疫分析比传统的酶免疫分析技术具有更低的检出限和更高的灵敏度。然而，荧光材料在荧光免疫分析平台上也有一些不可避免的局限性:光稳定性差、细胞毒性高、量子产率低【Nat Med 2014, 20(8), 948-53】。因此，人们做了大量的工作精力来制造明亮的荧光信号，包括将单个分子转化为数亿个荧光聚合体。将荧光分子填充到微载体中获得明亮的荧光是一项巨大的挑战，因为在局部浓度较高时，荧光团聚集会引起自猝灭，从而导致荧光强度下降【BiosensBioelectron 2016, 85, 317-323.】。
唐本忠课题组在2001年首次报道了一种具有独特聚集诱导发射(AIE)特性的新型荧光发光体【Chem. Commun, 2001, 1740.】。AIEgens在聚集态有很强的荧光发射，但在分子溶解状态时不发射荧光，这与聚集诱导猝灭(ACQ)现象相反。具有聚集诱导发射(AIE)特性的荧光材料可能有助于解决上述问题，AIE特性具有高亮度、抗光漂白能力强和良好的生物相容性，特别适合开发新型化学传感器和生物传感器【Biosens Bioelectron 2020,150,111912.】。直到最近，李万万小组开发了AIEgens荧光免疫测定法，然而AIE分子是疏水的，必须要通过复杂的分子设计和合成来适应荧光免疫分析平台【Biosens. Bioelectron.2019,135.】。因此，开发一种直接产生高荧光信号的AIEgens传感器是十分必要的。
发明内容
为解决现有技术存在的不足，本发明旨在提供基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法。
本发明以羧酸修饰的聚集诱导发光（AIE）分子填充的发光微球为信号输出基元，利用其大的斯托克斯位移、良好水分散性、抗磁猝灭荧光能力和优异的光漂白性等特点，采用识别抗体修饰后再与相应抗体修饰的磁性微球载体复合，利用双抗夹心法或竞争法实现对标志物的选择性识别，进而通过对发光信号强度的测量与标志物形成对应关系，得到一类AIE生物传感器的系统方法。进一步调节发光微球的制备工艺、偶联方式及纯化方法、荧光微球和磁性微球的粒径比等因素，实现对其灵敏度和测试范围的调节；其中，以CRP检测为例，在单次不稀释样本的前提下，检测限可以达到0.5ng/mL，并实现1-1000ng/mL的超长程检测，为即时快速检测提供新的策略。
本发明设计了一种新型的磁性–AIE荧光免疫生物传感方法，可直接应用于现有的荧光免疫分析平台上，实现高灵敏度且长程的快速检测。通过溶胀挥发法将数千个AIE分子嵌入到纳米级微球基质中，使AIE纳米粒子具有水分散性、大的stokes位移和高的量子产率。结合磁珠富集和快速分离，利用磁性–AIE生物传感器检测多种标志物；例如常见标志物C反应蛋白（CRP），实现抗原的高灵敏度和大的线性范围检测。
本发明采用的技术方案是：
基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，包括以下步骤：
抗体-1标记的聚集诱导发光微球溶液和抗体-2标记的磁性微球溶液混合，再加入含抗原的待测溶液，测定荧光信号值，根据标准曲线得到待测溶液中抗原的浓度。
优选地，所述的检测方法用于非疾病诊断领域；如食品质量检测和环境监测等。
本发明采用三明治夹心结构测试聚集诱导发光微球的荧光免疫的效果。抗体-2标记磁性作为化学分离载体，抗体-1标记的聚集诱导发光微球作为荧光输出单元；在96孔板中加入抗体-1标记聚集诱导发光微球和抗体-2标记磁性微球，再加入稀释后的样本，使用酶标仪测定荧光信号值。
优选地，所述抗体-1和抗体-2可以与抗原特异性结合；所述抗体-1和抗体-2可以相同或不同；所述荧光信号值使用酶标仪测定。
优选地，所述抗体-1标记的聚集诱导发光微球和抗体-2标记的磁性微球的粒径比为0.3以下；所述抗体-1标记的聚集诱导发光微球的粒径为200 nm及以下。
进一步优选地，所述抗体-1标记的聚集诱导发光微球和抗体-2标记的磁性微球的粒径比为0.2；所述抗体-1标记的聚集诱导发光微球的粒径为188 nm。
优选地，所述抗体-1标记的聚集诱导发光微球的制备方法包括以下步骤：
（1）将羧基修饰的纳米级微球基质、乳化剂（水溶性乳化剂）分散于水中，得到水相溶液，
（2）将AIE分子溶解于有机溶剂中，得到油相溶液；
（3）将步骤（2）的油相溶液加入到步骤（1）所述的水相溶液，升高温度，封闭溶胀后，挥发溶剂，制得AIE荧光微球乳液；离心，分散在水中，得到聚集诱导发光微球；
（4）将步骤（3）制得的聚集诱导发光微球加入酸性缓冲液，超声分散后加入碳二亚胺缩合试剂，放入混合仪活化羧基，离心去上清，得活化后的聚集诱导发光微球；
（5）将步骤（4）活化后的聚集诱导发光微球，加入碱性缓冲液和抗体-1，放入混合仪孵育，离心取上清，加入封闭液和保存液，超声分散，得到抗体-1标记的聚集诱导发光微球。
进一步优选地，步骤（1）中，所述羧基修饰的纳米级微球基质的质量用量为水质量用量的0.01%~20%。
进一步优选地，步骤（1）中，所述的羧基修饰的纳米级微球基质的粒径为50 nm~500 nm。微球基质是本领域所知悉的纳米级微球基质。更优选的粒径为200 nm~400 nm。
进一步优选地，步骤（1）中，所述乳化剂的质量用量为水质量用量的0.01%~10%。更优选地，所述乳化剂的质量用量为水质量用量的0.1%~5%。
进一步优选地，步骤（1）中，所述乳化剂选自下列至少一种：MOA-50、O-50、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、吐温20、十二烷基苯磺酸钠。
进一步优选地，步骤（2）中，所述AIE分子质量用量为有机溶剂质量的0.05%~20%；更优选地，所述AIE分子质量用量为有机溶剂质量的0.1%~5%。
进一步优选地，步骤（2）中，所述有机溶剂的质量用量为步骤（1）水质量的0.5%~50%；更优选地，所述有机溶剂的质量用量为水质量的1%~20%。
进一步优选地，步骤（2）中，所述有机溶剂选自下列一种或者两种混合：二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、苯甲醇、苯甲醚、甲苯。
进一步优选地，步骤（2）中，所述的AIE分子选自下列AIE-1至AIE-16分子中的至少一种：
进一步优选地，步骤（3）中，所述温度为20 ℃~70 ℃，所述封闭溶胀的时间为1 h~5 h；所述挥发溶剂的时间为5 h~24 h；所述离心转速为8000 rpm~12000 rpm；所述离心的次数为三次以上。
进一步优选地，步骤（4）中，所述酸性缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液；所述酸性缓冲液pH值为6.0~6.5；所述酸性缓冲液的质量用量为羧基修饰的纳米级微球基质质量用量的10~100倍。
进一步优选地，步骤（4）中，所述碳二亚胺缩合剂选自N,N’-二环己基碳二亚胺、N, N’-二异丙基碳二亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的一种；所述碳二亚胺缩合试剂的质量用量为羧基修饰的纳米级微球基质质量用量的1%~90%。
为了最大化提高缩合反应效率，酸性缓冲液优选pH值在6.0~6.5范围内的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，碳二亚胺缩合剂优选为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。
进一步优选地，步骤（4）中，所述活化的时间为5 min~3 h。
进一步优选地，步骤（4）中，所述离心时间为5 min~90 min，转速为8000 rpm ~16000 rpm，离心次数为三次以上；更优选地，所述离心时间为30 min，转速为12000 rpm。
进一步优选地，步骤（5）中，所述碱性缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液或磷酸缓冲盐（PBS）溶液；所述碱性缓冲液pH值为7.0~9.0；所述碱性缓冲液的质量用量为羧基修饰的纳米级微球基质质量用量的5~90倍。
为了最大化提高缩合反应效率，碱性缓冲液优选pH值在7.5~8.5范围内的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
进一步优选地，步骤（5）中，所述抗体-1的质量用量为羧基修饰的纳米级微球基质质量用量的0.01%~10%。
进一步优选地，步骤（5）中，考虑到活化后活性酯没有被完全反应，需要对活性酯进行封闭，所述的封闭液为牛血清白蛋白（BSA）。
进一步优选地，步骤（5）中，所述的保存液为Tris 微球保存液。
优选地，所述抗体-2标记的磁性微球的制备方法包括以下步骤（抗体-2标记磁性微球类似AIE荧光微球的标记，区别在于纯化方式不同）：
（a）将磁性微球加入酸性缓冲液，超声分散后加入碳二亚胺缩合试剂，放入混合仪活化羧基，磁吸方式去上清，得活化后的磁性微球；所述磁性微球为羧基修饰的磁性微球；
（b）将步骤（a）活化后的磁性微球，加入碱性缓冲液和抗体-2，放入混合仪孵育，磁吸方式取上清，加入封闭液和保存液，超声分散，得到抗体-2修饰的磁性微球。
进一步优选地，步骤（a）中，所述酸性缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液；所述酸性缓冲液pH值为6.0~6.5；所述酸性缓冲液的质量用量为磁性微球质量用量的10~100倍。
进一步优选地，步骤（a）中，所述磁性微球的粒径在1μm ~5μm之间；磁性微球是市面常见免疫磁珠，粒径在1μm ~5μm之间，可以通过JSR、赛默飞和博岳厂家等购买。
进一步优选地，步骤（a）中，所述碳二亚胺缩合剂选自N,N’-二环己基碳二亚胺、N, N’-二异丙基碳二亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的一种；所述碳二亚胺缩合试剂的质量用量为磁性微球质量用量的5%~90%。
更优选地，酸性缓冲液优选pH值在6.0~6.5范围内的2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，碳二亚胺缩合剂优选为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。
进一步优选地，步骤（a）中，所述活化的时间为5 min~3 h。
进一步优选地，步骤（a）中，所述磁吸的时间为5 s ~300 s，磁吸的次数为三次以上。更优选地，所述磁吸的时间为10 s。
进一步优选地，步骤（b）中，所述碱性缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液或磷酸缓冲盐（PBS）溶液；所述碱性缓冲液pH值为7.0~9.0；所述碱性缓冲液的质量用量为磁性微球质量用量的5~90倍；为了最大化提高缩合反应效率，碱性缓冲液优选pH值在7.5~8.5范围内的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
进一步优选地，步骤（b）中，所述抗体-2的质量用量为磁性微球质量用量的0.01%~10%。
进一步优选地，步骤（b）中，考虑到活化后活性酯没有被完全反应，需要对活性酯进行封闭，所述的封闭液为牛血清白蛋白（BSA）。
进一步优选地，步骤（b）中，所述的保存液为Tris 微球保存液。
关于本发明，经过深入研究，纳米级微球的粒径对抗原定量检测的灵敏度起着重要作用，选用不同粒径的纳米微球基质，可以制备出不同粒径的聚集诱导发光微球；随着粒径的降低，抗原检测的荧光信号值增加，最终的抗原检测的最低检测限会降低，提高检测的灵敏度，最适合的微球粒径范围为40 nm~300 nm。因此，要根据不同产品需求选择合适的微球粒径。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
本发明提出了一种结合溶胀技术和碳二亚胺反应高效制备抗体标记修饰的聚集诱导发光荧光微球的新方法，通过三明治夹心结构检测聚集诱导发光微球的检测效果，验证了AIE荧光微球在体外诊断中潜在的应用价值。将AIE分子嵌入在纳米级微球基质中。利用碳二亚胺活化反应高效制备抗体标记的AIE荧光微球，最后加入封闭液和保存液，得到抗体标记的AIE荧光微球。结合磁性快速富集和分离的效果，可以做到10 min 内检测抗原浓度。
该方法的优点是：
（1）与传统AIE荧光微球制备方法相比，解决了染料掺杂后微球形貌被破坏的问题，保证AIE荧光微球的尺寸均一性和高羧基密度，从而提高检测过程中的线性度和灵敏度。
（2）通过简便的溶胀挥发技术，将大量的AIE分子嵌入到聚合物基质中，使AIE荧光微球分子不仅具有水分散性，AIE荧光微球耐光性大大提高。同时选择不同的粒径，使用AIE荧光微球作为信号输出单元，得到不同抗原检测的检测限和灵敏度。
（3）与传统ACQ分子或者荧光标记物相比，AIE分子具有典型的聚集诱导发光现象，在聚集体中能够发出强烈的荧光；所以AIE分子嵌入纳米级微球基质后，可以发出强烈荧光，并且AIE荧光微球的发光波长可以覆盖红、蓝、绿等多个波段，满足检测领域各场景的应用。
（4）由于AIE荧光微球具有优异的稳定性和发光性质，结合磁珠富集和快速分离特点，用磁吸收支架代替复杂和耗时的传统的离心操作，利用磁性-AIE微球生物传感器实现对抗原样品的高灵敏度定量检测测定，同时检测时间可以缩短到10 min以内，提高检测效率。本发明制备得到AIE荧光微球为经典荧光标记材料增加了重要的荧光材料，为即时快速检测技术提供了一种新的策略。
附图说明
图1为实施例1所制的AIE荧光微球的扫描电镜图。
图2为实施例1所制的AIE荧光微球的激发光谱和发射光谱图。
图3为实施例1所制的AIE荧光微球连续激发下的荧光衰减程度。
图4为实施例1所制的AIE荧光微球检测不同CRP抗原的线性关系曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例中的磁性微球为不同粒径的羧基修饰的聚合物磁珠，来自AIE研究院，产品货号为MBPC。
实施例中的CRP抗原为原核重组表达出来的蛋白质。CRP-1抗体为小鼠hsCRP抗体，浓度为5.2 mg/mL。CRP-2抗体为小鼠hsCRP抗体，浓度为0.3 mg/mL。
实施例1
一、抗体标记的AIE荧光微球的制备
称取0.1 g羧基修饰的纳米微球基质（296 nm、188 nm、102 nm、44nm）和0.05 g十二烷基硫酸钠0.05 g分散于12.5 g水中，用作连续相的乳化剂水溶液；
将1 mg AIE-1分子溶解于1 mL二氯甲烷中，得到油相溶液。将两种溶液混合并在700 rpm磁力搅拌下，升高温度到40 ℃，封闭溶胀1h后，敞口挥发溶剂6 h，制得AIE荧光微球乳液；将乳液离心，再重新分散在水中，按照此方法循环三次，得到纯化后的AIE荧光微球；
将AIE荧光微球加入10 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.0095 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5 min。使用离心方式去上清得活化AIE荧光微球，加入3 g硼酸缓冲液（pH=8）和50μg CRP-1抗体，放入混合仪孵育，离心取上清液，加入封闭液BSA和Tris 微球保存液，超声分散，得到抗体修饰的AIE荧光微球。
二、CRP-2抗体标记的磁性微球
将0.1g磁性微球（粒径分别为1μm、2.5μm和3μm）加入10 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.0095 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5 min。使用磁吸方式去上清得活化AIE荧光微球，加入3 g硼酸缓冲液（pH=8）和10μg CRP-2抗体，放入混合仪孵育，磁吸取上清液，加入封闭液BSA和Tris 微球保存液，超声分散，得到抗体修饰的磁性微球。
三、聚集诱导发光微球的荧光免疫效果的测定
在96孔板中加入10μLCRP-1抗体标记AIE荧光微球（10 mg/mL）和10μLCRP-2抗体标记磁性微球（10 mg/mL），再加入5μLCRP样本抗原，磁吸去掉上清液，重悬后使用酶标仪测定荧光信号值。
不同粒径的荧光微球和磁性微球的检测结果见表1。其中，188 nm荧光微球和1000nm磁性微球测试的荧光信号值为452104，最低检测限为0.35 ng/mL。
对比例1
羧基修饰的纳米微球基质选用405nm，荧光微球和磁性微球的制备方法、用量和种类、标记抗体和上述方法一致，最后使用酶标仪测定荧光信号值。因为AIE荧光微球和磁性微球的粒径比偏大，测试的荧光信号值为45104，荧光信号值较低，最低检测限为4.3 ng/mL。
对比例2
羧基修饰的纳米微球基质选用510 nm，荧光微球和磁性微球的制备方法、标记抗体和上述方法一致，最后使用酶标仪测定荧光信号值。因为AIE荧光微球和磁性微球的粒径比偏大，测试的荧光信号值为45104，荧光信号值较低，最低检测限为1.9 ng/mL。
对比例3
称取十二烷基硫酸钠0.05g，溶于12.5g水中，用作连续相的乳化剂水溶液。
将1mg FITC分子（市面常规染料）、0.06g 正十六烷和0.1g聚苯乙烯溶解在4mL二氯甲烷溶剂中，用作分散相的油性溶液。将两种溶液混合并在700 rpm磁力搅拌下，升高温度到40 ℃，封闭溶胀1h后，敞口挥发溶剂6 h，制得荧光微球乳液；将乳液离心，再重新分散在水中，按照此方法循环三次，得到纯化后的荧光微球，测试得到粒径为190 nm。
荧光微球的标记抗体和上述实施例1一致，最后使用酶标仪测定荧光信号值。因为市面常规染料是聚集诱导猝灭性质，斯托克斯位移小、荧光稳定性较差，测试的荧光信号值为1.2104，荧光信号值较低，最低检测限为47.9 ng/mL。
表1不同粒径的AIE荧光微球、普通荧光微球和磁性微球对CRP检测信号值和检测限的影响
实施例2
一、抗体标记的AIE荧光微球的制备
称取0.5 g羧基修饰的纳米微球基质（188 nm）和0.25 g十二烷基硫酸钠分散于50g水中，用作连续相的乳化剂水溶液；
将1 mg AIE-3分子溶解于1 mL四氢呋喃中，得到油相溶液。将两种溶液混合并在700 rpm磁力搅拌下，升高温度到40 ℃，封闭溶胀1h后，敞口挥发溶剂6 h，制得AIE荧光微球乳液；将乳液离心，再重新分散在水中，按照此方法循环三次，得到纯化后的AIE荧光微球；
将AIE荧光微球加入50 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.0445 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5 min。使用离心方式去上清得活化AIE荧光微球，加入10 g硼酸缓冲液（pH=8）和50μgCRP-1，放入混合仪孵育，离心取上清液，加入封闭液BSA和Tris 微球保存液，超声分散，得到抗体修饰的AIE荧光微球。
二、CRP-2抗体标记的磁性微球
将0.1g磁性微球（粒径为1μm）加入10 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.0095 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300rpm，时间5 min。使用磁吸方式去上清得活化AIE荧光微球，加入3 g硼酸缓冲液（pH=8）和10μgCRP-2抗体，放入混合仪孵育，磁吸取上清液，加入封闭液BSA和Tris 微球保存液，超声分散，得到抗体修饰的磁性微球。
三、聚集诱导发光微球的荧光免疫效果的测定
在96孔板中加入10μLCRP-1抗体标记AIE荧光微球（10 mg/mL）和10μLCRP-2抗体标记磁性微球（10 mg/mL），再加入5μLCRP样本抗原，磁吸去掉上清液，重悬后使用酶标仪测定荧光信号值，测试的荧光信号值为342104，最低检测限为0.35 ng/mL。
实施例3
一、抗体标记的AIE荧光微球的制备
称取1 g羧基修饰的纳米微球基质（102 nm）和0.5 g十二烷基硫酸钠分散于75 g水中，用作连续相的乳化剂水溶液；
将5 mg AIE-5分子溶解于2 mL四氢呋喃中，得到油相溶液。将两种溶液混合并在500 rpm磁力搅拌下，升高温度到50 ℃，封闭溶胀2h后，敞口挥发溶剂8 h，制得AIE荧光微球乳液；将乳液离心，再重新分散在水中，按照此方法循环三次，得到纯化后的AIE荧光微球；
将AIE荧光微球加入50 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.0445 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5 min。使用离心方式去上清得活化AIE荧光微球，加入10 g硼酸缓冲液（pH=6）和50μgCRP-1，放入混合仪孵育，离心取上清液，加入封闭液BSA和保存液，超声分散，得到抗体修饰的AIE荧光微球。
二、CRP-2抗体标记的磁性微球
将0.1g磁性微球（粒径为1μm）加入10 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.0095 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300rpm，时间5 min。使用磁吸方式去上清得活化AIE荧光微球，加入3 g硼酸缓冲液（pH=8）和10μgCRP-2，放入混合仪孵育，磁吸取上清液，加入封闭液BSA和保存液，超声分散，得到抗体修饰的磁性微球。
三、聚集诱导发光微球的荧光免疫效果的测定
在96孔板中加入10μLCRP-1抗体标记AIE荧光微球（10 mg/mL）和10μL CRP-2抗体标记磁性微球（10 mg/mL），再加入5μLCRP样本抗原，磁吸去掉上清液，重悬后使用酶标仪测定荧光信号值，测试的荧光信号值为492104，最低检测限为0.29 ng/mL。
实施例4
一、抗体标记的AIE荧光微球的制备
称取2.5 g羧基修饰的纳米微球基质（42 nm）和1.25 g十二烷基硫酸钠分散于150g水中，用作连续相的乳化剂水溶液；
将5 mg AIE-7分子溶解于2 mL四氢呋喃中，得到油相溶液。将两种溶液混合并在500 rpm磁力搅拌下，升高温度到50 ℃，封闭溶胀2h后，敞口挥发溶剂8 h，制得AIE荧光微球乳液；将乳液离心，再重新分散在水中，按照此方法循环三次，得到纯化后的AIE荧光微球；
将AIE荧光微球加入100 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.9 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5 min。使用离心方式去上清得活化AIE荧光微球，加入50 g PBS缓冲液（pH=9）和100μgCRP-1，放入混合仪孵育，离心取上清液，加入封闭液BSA和保存液，超声分散，得到抗体修饰的AIE荧光微球。
二、CRP-2抗体标记的磁性微球
将1g磁性微球（粒径为1μm）加入100 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.9g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5 min。使用磁吸方式去上清得活化AIE荧光微球，加入50 g PBS缓冲液（pH=8）和100μgCRP-2，放入混合仪孵育，磁吸取上清液，加入封闭液BSA和保存液，超声分散，得到抗体修饰的磁性微球。
三、聚集诱导发光微球的荧光免疫效果的测定
在96孔板中加入10μLCRP-1抗体标记AIE荧光微球（10 mg/mL）和10μLCRP-2抗体标记磁性微球（10 mg/mL），再加入5μLCRP样本抗原，磁吸去掉上清液，重悬后使用酶标仪测定荧光信号值，测试的荧光信号值为598104，最低检测限为0.15 ng/mL。
实施例5
一、抗体标记的AIE荧光微球的制备
称取5 g羧基修饰的纳米微球基质（188 nm）和2.5 g十二烷基硫酸钠分散于500 g水中，用作连续相的乳化剂水溶液；
将50 mg AIE-9分子溶解于10 mL四氢呋喃中，得到油相溶液。将两种溶液混合并在900 rpm磁力搅拌下，升高温度到50 ℃，封闭溶胀4 h后，敞口挥发溶剂24 h，制得AIE荧光微球乳液；将乳液离心，再重新分散在水中，按照此方法循环三次，得到纯化后的AIE荧光微球；
将AIE荧光微球加入250 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入2.5 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速400 rpm，时间10 min。使用离心方式去上清得活化AIE荧光微球，加入100 g PBS缓冲液（pH=8）和200μgCRP-1，放入混合仪孵育，离心取上清液，加入封闭液BSA和保存液，超声分散，得到抗体修饰的AIE荧光微球。
二、CRP-2抗体标记的磁性微球
将1g磁性微球（粒径为1.5μm）加入100 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.9 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5 min。使用磁吸方式去上清得活化AIE荧光微球，加入50 g PBS缓冲液（pH=8）和100μgCRP-2，放入混合仪孵育，磁吸取上清液，加入封闭液BSA和保存液，超声分散，得到抗体修饰的磁性微球。
三、聚集诱导发光微球的荧光免疫效果的测定
在96孔板中加入10μLCRP-1抗体标记AIE荧光微球（10 mg/mL）和10μLCRP-2抗体标记磁性微球（10 mg/mL），再加入5μLCRP样本抗原，磁吸去掉上清液，重悬后使用酶标仪测定荧光信号值，测试的荧光信号值为432104，最低检测限为0.25 ng/mL。
实施例6
一、抗体标记的AIE荧光微球的制备
称取0.1 g羧基修饰的纳米微球基质（188 nm）和0.05 g十二烷基硫酸钠0.05 g分散于12.5 g水中，用作连续相的乳化剂水溶液；
将1 mg AIE-10分子溶解于1 mL二氯甲烷中，得到油相溶液。将两种溶液混合并在700 rpm磁力搅拌下，升高温度到40 ℃，封闭溶胀1h后，敞口挥发溶剂6 h，制得AIE荧光微球乳液；将乳液离心，再重新分散在水中，按照此方法循环三次，得到纯化后的AIE荧光微球；
将AIE荧光微球加入10 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.0095 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5 min。使用离心方式去上清得活化AIE荧光微球，加入3 g硼酸缓冲液（pH=8）和50μgCRP-1抗体，放入混合仪孵育，离心取上清液，加入封闭液BSA和保存液，超声分散，得到抗体修饰的AIE荧光微球。
二、CRP-2抗体标记的磁性微球
将0.1g磁性微球（粒径为2μm）加入10 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.0095 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300rpm，时间5 min。使用磁吸方式去上清得活化AIE荧光微球，加入3 g硼酸缓冲液（pH=8）和10μgCRP-2抗体，放入混合仪孵育，磁吸取上清液，加入封闭液BSA和保存液，超声分散，得到抗体修饰的磁性微球。
三、聚集诱导发光微球的荧光免疫效果的测定
在96孔板中加入20μLCRP-1抗体标记AIE荧光微球（10 mg/mL）和20μL CRP-2抗体标记磁性微球（10 mg/mL），再加入10μLCRP样本抗原，磁吸去掉上清液，重悬后使用酶标仪测定荧光信号值，测试的荧光信号值为552104，最低检测限为0.15 ng/mL。
实施例7
一、抗体标记的AIE荧光微球的制备
称取0.1 g羧基修饰的纳米微球基质（188 nm）和0.05 g十二烷基硫酸钠0.05 g分散于12.5 g水中，用作连续相的乳化剂水溶液；
将1 mg AIE-11分子溶解于1 mL二氯甲烷中，得到油相溶液。将两种溶液混合并在700 rpm磁力搅拌下，升高温度到40 ℃，封闭溶胀1h后，敞口挥发溶剂6 h，制得AIE荧光微球乳液；将乳液离心，再重新分散在水中，按照此方法循环三次，得到纯化后的AIE荧光微球；
将AIE荧光微球加入10 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.0095 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300 rpm，时间5 min。使用离心方式去上清得活化AIE荧光微球，加入3 g硼酸缓冲液（pH=8）和50μgCRP-1抗体，放入混合仪孵育，离心取上清液，加入封闭液BSA和保存液，超声分散，得到抗体修饰的AIE荧光微球。
二、CRP-2抗体标记的磁性微球
将0.1g磁性微球（粒径为3μm）加入10 g MES缓冲液（pH=6.5），超声分散后加入0.0095 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，放入混合仪活化羧基，转速300rpm，时间5 min。使用磁吸方式去上清得活化AIE荧光微球，加入3 g硼酸缓冲液（pH=8）和10μgCRP-2抗体，放入混合仪孵育，磁吸取上清液，加入封闭液BSA和保存液，超声分散，得到抗体修饰的磁性微球。
三、聚集诱导发光微球的荧光免疫效果的测定
在96孔板中加入100μLCRP-1抗体标记AIE荧光微球（10 mg/mL）和100μLCRP-2抗体标记磁性微球（10 mg/mL），再加入50μLCRP样本抗原，磁吸去掉上清液，重悬后使用酶标仪测定荧光信号值，测试的荧光信号值为652104，最低检测限为0.43 ng/mL。
以上实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
抗体-1标记的聚集诱导发光微球溶液和抗体-2标记的磁性微球溶液混合，再加入含抗原的待测溶液，测定荧光信号值，根据标准曲线得到待测溶液中抗原的浓度；
所述抗体-1标记的聚集诱导发光微球和抗体-2标记的磁性微球的粒径比为0.2以下；所述抗体-1标记的聚集诱导发光微球的粒径为188nm及以下；所述抗体-2标记的磁性微球的粒径在1μm~5μm之间。
2.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，所述抗体-1和抗体-2可以与抗原特异性结合；所述抗体-1和抗体-2可以相同或不同；所述荧光信号值使用酶标仪测定；所述的检测方法用于非疾病诊断领域。
3.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，所述抗体-1标记的聚集诱导发光微球的制备方法包括以下步骤：
（1）将羧基修饰的纳米级微球基质、乳化剂分散于水中，得到水相溶液，
（2）将AIE分子溶解于有机溶剂中，得到油相溶液；
（3）将步骤（2）的油相溶液加入到步骤（1）所述的水相溶液，升高温度，封闭溶胀后，挥发溶剂，制得AIE荧光微球乳液；离心，分散在水中，得到聚集诱导发光微球；
（4）将步骤（3）制得的聚集诱导发光微球加入酸性缓冲液，超声分散后加入碳二亚胺缩合试剂，放入混合仪活化羧基，离心去上清，得活化后的聚集诱导发光微球；
（5）将步骤（4）活化后的聚集诱导发光微球，加入碱性缓冲液和抗体-1，放入混合仪孵育，离心取上清，加入封闭液和保存液，超声分散，得到抗体-1标记的聚集诱导发光微球。
4.根据权利要求3所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，步骤（1）中，所述羧基修饰的纳米级微球基质的质量用量为水质量用量的0.01%~20%；
所述乳化剂的质量用量为水质量用量的0.01%~10%；
所述乳化剂选自下列至少一种：MOA-50、O-50、十二烷基硫酸钠、聚乙烯醇、吐温20、十二烷基苯磺酸钠。
5.根据权利要求3所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，步骤（2）中，所述AIE分子质量用量为有机溶剂质量的0.05%~20%；
所述有机溶剂的质量用量为步骤（1）水质量的0.5%~50%；
所述有机溶剂选自下列一种或者两种混合：二氯甲烷、四氢呋喃、氯仿、苯甲醇、苯甲醚、甲苯；
所述的AIE分子选自下列AIE-1至AIE-16分子中的至少一种：
6.根据权利要求3所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，步骤（3）中，所述温度为20 ℃~70 ℃，所述封闭溶胀的时间为1 h~5 h；所述挥发溶剂的时间为5 h~24 h；所述离心转速为8000 rpm~12000 rpm；所述离心的次数为三次以上；
步骤（4）中，所述酸性缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液；所述酸性缓冲液pH值为6.0~6.5；所述酸性缓冲液的质量用量为羧基修饰的纳米级微球基质质量用量的10~100倍；
步骤（4）中，所述碳二亚胺缩合剂选自N, N’-二环己基碳二亚胺、N, N’-二异丙基碳二亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的一种；所述碳二亚胺缩合试剂的质量用量为羧基修饰的纳米级微球基质质量用量的1%~90%；
步骤（4）中，所述活化的时间为5 min~3 h；
步骤（4）中，所述离心时间为5 min~90 min，转速为8000 rpm ~16000 rpm，离心次数为三次以上；
步骤（5）中，所述碱性缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液或磷酸缓冲盐溶液；所述碱性缓冲液pH值为7.0~9.0；所述碱性缓冲液的质量用量为羧基修饰的纳米级微球基质质量用量的5~90倍；
步骤（5）中，所述抗体-1抗体的质量用量为羧基修饰的纳米级微球基质质量用量的0.01%~10%；
步骤（5）中，所述的封闭液为牛血清白蛋白；
步骤（5）中，所述的保存液为Tris 微球保存液。
7.根据权利要求1所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，所述抗体-2标记磁性微球的制备方法包括以下步骤：
（a）将磁性微球加入酸性缓冲液，超声分散后加入碳二亚胺缩合试剂，放入混合仪活化羧基，磁吸方式去上清，得活化后的磁性微球；所述磁性微球为羧基修饰的磁性微球；
（b）将步骤（a）活化后的磁性微球，加入碱性缓冲液和抗体-2，放入混合仪孵育，磁吸方式取上清，加入封闭液和保存液，超声分散，得到抗体-2修饰的磁性微球。
8.根据权利要求7所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，步骤（a）中，所述酸性缓冲液为甘氨酸-盐酸缓冲液、邻苯二甲酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液或2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液；所述酸性缓冲液pH值为6.0~6.5；所述酸性缓冲液的质量用量为磁性微球质量用量的10~100倍；
所述碳二亚胺缩合剂选自N, N’-二环己基碳二亚胺、N, N’-二异丙基碳二亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的一种；所述碳二亚胺缩合试剂的质量用量为磁性微球质量用量的5%~90%；
所述活化的时间为5 min~3 h；
所述磁吸的时间为5 s ~300 s，磁吸的次数为三次以上。
9.根据权利要求7所述的基于聚集诱导发光微球及磁性分离技术的免疫检测方法，其特征在于，步骤（b）中，所述碱性缓冲液为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、硼酸缓冲液或磷酸缓冲盐溶液；所述碱性缓冲液pH值为7.0~9.0；所述碱性缓冲液的质量用量为磁性微球质量用量的5~90倍；
所述抗体-2的质量用量为磁性微球质量用量的0.01%~10%；
所述的封闭液为牛血清白蛋白；
所述的保存液为Tris 微球保存液。
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