JP2023516127A - 発光粒子 - Google Patents
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Abstract
マトリックス材料を含むコアと、ポリマーを含む発光システムと、コアと接触し、コアを取り囲む無機酸化物を含むシェル層と、を含む、発光粒子。【選択図】図1
Description
本開示の実施形態は、発光粒子、その形成方法、およびルミネッセントマーカーとしてのその使用に関する。
発光ポリマーは、標識または検出試薬として開示されている。
Geng et al,“A general approach to prepare conjugated polymer dot embedded silica nanoparticles with a SiO2@CP@SiO2 structure for targeted HER2-positive cellular imaging”,Nanoscale,2013,vol.5,pp8593-8601には、「SiO2@CP@SiO2」構造を有するシリカ共役ポリマー(CP)ナノ粒子について記載されている。
Tansub et al,“Synthesis of Antibodies-Conjugated Fluorescent Dye-Doped Silica Nanoparticles for a Rapid Single Step Detection of Campylobacter jejuni in Live Poultry”Journal of Nanomaterials,Volume 2012,Article ID 865186には、トリス(2,2’-ビピリジル)ジクロロルテニウム(II)六水和物の蛍光色素を含有するシリカナノ粒子について開示されている。無水コハク酸によるアミン官能化されたナノ粒子のカルボキシル修飾が開示される。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、マトリックス材料を含むコアと、ポリマーを含む発光システムと、コアと接触し、コアを取り囲む無機酸化物を含むシェル層と、を含む、発光粒子を提供する。
任意選択的に、無機酸化物は、シリカである。
任意選択的に、シェル層は、少なくとも2nmの厚さを有する。
任意選択的に、シェル層は、100nm以下の厚さを有する。
任意選択的に、ポリマーは、発光ポリマーである。
任意選択的に、ポリマーは、少なくとも0.01mg/mlの20℃の水またはC1~8アルコールへの溶解度を有する。
任意選択的に、マトリックス材料は、シリカである。
任意選択的に、粒子は、1000nm未満の直径を有するナノ粒子である。
任意選択的に、表面基は、シェル層に結合される。
任意選択的に、表面基は、カルボン酸基またはその塩もしくはエステルを含む。
任意選択的に、表面基は、ポリエーテル鎖を含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、本明細書に記載されるような発光粒子を含む粉末を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、液体中に分散した、本明細書に記載されるような発光粒子を含む分散液が提供される。
任意選択的に、液体は、緩衝溶液である。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、本明細書に記載されるような発光粒子を形成する方法であって、コアの形成が、ポリマーの存在下でマトリックスを形成するためのモノマーの重合を含む、方法を提供する。
任意選択的に、ポリマーは、溶解した形態である。
任意選択的に、シェルはシリカを含み、シェルの形成は、コアの存在下でシリカを形成するためのモノマーの重合を含む。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、生体分子をマーキングする方法であって、本明細書に記載されるように、生体分子を発光マーカー粒子に結合させるステップを含む、方法を提供する。
いくつかの実施形態によれば、本開示は、標的分析物のアッセイ方法であって、試料を、本明細書に記載されるように、発光マーカー粒子と接触させることと、標的分析物の、発光マーカーへの任意の結合を決定することと、を含む、アッセイ方法を提供する。
いくつかの実施形態では、発光マーカー粒子と接触した試料は、フローサイトメトリーによって分析される。任意選択的に、発光マーカー粒子に結合した標的分析物の量が決定される。任意選択的に、試料は、細胞の混合物を含み、発光マーカーに結合した1つ以上の異なるタイプの標的細胞が同定および/または定量化される。
いくつかの実施形態では、発光粒子に結合した標的分析物は、発光粒子に結合していない標的分析物から分離される。
いくつかの実施形態では、本開示は、
プライミング鋳型核酸分子を、ポリメラーゼおよび試験ヌクレオチドと接触させることと、
試験ヌクレオチドをプライミング鋳型のプライミング鎖に、試験ヌクレオチドが鋳型鎖の次の塩基に相補的な塩基を含む場合にのみ、組み込むことと、
プライミング鎖を照らすことと、
プライミング鎖の輝度から、試験ヌクレオチドがプライミング鎖に組み込まれているかどうかを判定すること、を含む、核酸を配列決定する方法を提供し、
照らされたプライミング鎖の試験ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような発光粒子に結合する。
プライミング鋳型核酸分子を、ポリメラーゼおよび試験ヌクレオチドと接触させることと、
試験ヌクレオチドをプライミング鋳型のプライミング鎖に、試験ヌクレオチドが鋳型鎖の次の塩基に相補的な塩基を含む場合にのみ、組み込むことと、
プライミング鎖を照らすことと、
プライミング鎖の輝度から、試験ヌクレオチドがプライミング鎖に組み込まれているかどうかを判定すること、を含む、核酸を配列決定する方法を提供し、
照らされたプライミング鎖の試験ヌクレオチドは、本明細書に記載されるような発光粒子に結合する。
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼおよび核酸分子と接触した試験ヌクレオチドは、発光粒子に結合する。
いくつかの実施形態では、発光マーカーは、試験ヌクレオチドのプライミング鎖への組み込み後に、試験ヌクレオチドに結合する。
開示される技術および添付の図は、開示される技術のいくつかの実施態様を記載する。
図面は、縮尺通りに描かれておらず、様々な視点および斜視図を有する。図面は、いくつかの実施態様および実施例である。加えて、いくつかの構成要素および/または操作は、開示される技術のいくつかの実施形態の考察の目的のために、異なるブロックに分離され得るか、または単一のブロックに組み合わされ得る。さらに、本技術は、様々な変更および代替形式に対応可能であるが、具体的な実施形態は、例として図面に示されており、以下に詳細に記載される。しかしながら、意図は、記載される特定の実施態様に本技術を限定することではない。対照的に、本技術は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような技術の範囲内に入るすべての変更物、同等物、および代替物を包含することが意図される。
文脈上明らかに別段の要求がない限り、本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む(comprise)」、「含む(comprising)」などの単語は、排他的または網羅的な意味とは対照的に、包括的な意味、すなわち、「含むが、これらに限定されない」という意味で解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「接続される」、「結合される」、またはそれらの任意の変形という用語は、2つ以上の要素間の直接的または間接的ないずれかの任意の接続または結合を意味し、要素間の結合または接続は、物理的、論理的、電磁的、またはそれらの組み合わせであり得る。加えて、「本明細書の」、「上の」、「以下の」という単語、および類似の趣旨の単語は、本出願で使用される場合、本出願全体を指し、本出願の任意の特定の部分を指すものではない。文脈が許容する場合、「発明を実施するための形態」の中で単数または複数を使用する単語は、それぞれ複数または単数も含み得る。「または」という単語は、2つ以上の項目のリストに関連して、リスト内のいずれかの項目、リスト内のすべての項目、およびリスト内の項目の任意の組み合わせ、という単語の解釈のすべてを包含する。原子への言及は、特に明記しない限り、その原子の任意の同位体を含む。
本明細書に提供される技術の教示は、必ずしも以下に記載されるシステムではなく、他のシステムに適用され得る。以下に記載される様々な実施例の要素および行為は、組み合わされて、技術のさらなる実施態様を提供し得る。本技術のいくつかの代替の実施態様は、以下に記述されるこれらの実施態様に追加の要素を含み得るだけでなく、より少ない要素も含み得る。
これらおよび他の変更は、以下の詳細な記載を考慮して、本技術に対して行われ得る。本明細書では、本技術の特定の実施例を記載し、企図される最良のモードを記載するが、記載がどれほど詳細に表示されても、本技術は多くの方法で実施され得る。システムの詳細は、その具体的な実施態様においてかなり異なる場合があるが、本明細書に開示される技術にはなおも包含されている。上に記述されるように、技術のある特定の特色または態様を記載する場合に使用される特定の用語は、その用語に関連する技術の任意の特定の特徴、特色、または態様に制限されるように、その用語が本明細書で再定義されることを意味するものと解釈されるべきではない。概して、以下の特許請求の範囲で使用される用語は、「発明を実施するための形態」の項でそのような用語を明示的に定義しない限り、本技術を本明細書に開示された具体的な実施例に限定するものと解釈されるべきではない。したがって、本技術の実際の範囲は、開示された実施例だけでなく、特許請求の範囲下の技術の実践または実施態様のすべての同等の方法も包含する。
特許請求の範囲の数を低減するために、本技術の特定の態様は、特定の特許請求の範囲の形態で以下に提示されるが、出願人は、任意の数の特許請求の範囲の形態における本技術の様々な態様を企図する。
以下の記載では、説明の目的で、開示された技術の実施態様の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が記載される。しかしながら、当業者には、開示された技術の実施形態は、これらの具体的な詳細のいくつかがなくても実施され得ることは明らかであろう。
図1は、本開示のいくつかの実施形態による発光粒子を概略的に例示する。
発光粒子は、マトリックス材料を含有する複合コア101と、ポリマー105を含む発光システムと、を有する。ポリマーは、複合コア内に分布している。ポリマー鎖は、コアの厚さの一部またはすべてにわたって延在し得る。ポリマー鎖は、コア内に含有され得るか、またはコアの表面から突出し得る。いくつかの実施形態では、1つ以上のポリマー鎖は、コアの表面上に配置されてもよい。
いくつかの実施形態では、ポリマー105は、使用中、ポリマーの吸収波長で照らした時に発光する、発光システムの発光ポリマーである。これらの実施形態によれば、発光システムは、発光ポリマーを含むか、または発光ポリマーからなり得る。
いくつかの実施形態では、ポリマー105は、発光システムのホストポリマーであり、発光システムは、ポリマーからエネルギーを受け取ることができる発光材料をさらに含む。これらの実施形態では、使用中、ホストポリマーからの発光がほとんど存在しないか、または存在しない場合がある。
マトリックス材料は、無機酸化物、任意選択的にシリカ、酸化鉄、またはアルミナ、好ましくはシリカであり得る。
本発明者らは、コア内にポリマー(例えば、別個の発光材料のための発光ポリマーまたはポリマーホスト)を有する発光粒子が、凝集する傾向を有し得ること、および/または官能化が困難な表面を有し得ることを見出した。この結果は、ポリマーが、粒子コアの表面に対する親和性、例えば、親水性シリカ粒子コアの表面における親水性ポリマーを有し、粒子コア表面とポリマーとの間の結合、例えば、ファンデルワールス結合をもたらす場合に特に顕著であり得る。本発明者らは、ポリマーを取り囲むシェルを提供することにより、そのような問題を克服することができることを見出した。
図2は、いくつかの実施形態による、発光粒子を形成する方法を例示する。
発光ポリマーを内部に分布した、マトリックス材料を含有する複合コア101は、任意の好適な方法によって形成され得る。シリカマトリックス材料の場合、シリカを形成するためのモノマーは、ポリマーの存在下で重合され得る。好ましくは、シリカは、溶解ポリマーの存在下で重合される。
コアは、当業者に既知の任意の方法によって、シェル103を用いて封入され得る。シリカシェルの場合、シリカを形成するためのモノマーは、コア101の存在下で重合され得る。
シェル103が形成されると、コア101の表面に配置された任意のポリマー鎖105、またはコアの表面から突出した任意のポリマー鎖が、シェルによって覆われ得る。
いくつかの実施形態では、シェルの形成後、シェルの表面は、表面基107を提供するために、例えば、シェル表面に官能基を提供するため、または溶媒中、例えば、水中の粒子の分散を増強するために処理され得る。シェル表面の官能基は、生体分子基に結合することができ得る。
マトリックス:複合コアの有機発光システム重量比は、99:1~50:50、好ましくは99:1~90:10。
ポリマーは、複合コア層の厚さ全体にわたって均一に分布され得る。
いくつかの実施形態では、複合コア中のポリマーの少なくともいくつかは、マトリックスに共有結合的または非共有結合的に結合している。
いくつかの実施形態では、発光ポリマー鎖のいずれも、マトリックスに結合していない。
ポリマーの個々の発光ポリマー鎖は、各々独立して、折り畳まれた、または折り畳まれていない構成を含むが、これらに限定されない、複合コア内の任意の構成を有してもよい。発光ポリマー鎖の構成は、複合コア形成プロセスおよび条件によって影響を受け得る。
いくつかの実施形態では、シェル内には発光材料が存在しない。
任意選択的に、粒子は、ナノ粒子である。
好ましくは、粒子は、60ミクロン以下の数平均直径を有する。好ましくは、粒子は、少なくとも10nmの数平均直径を有する。
好ましくは、コアは、50ミクロン以下の数平均直径を有する。好ましくは、コアは、少なくとも2nmの数平均直径を有する。
好ましくは、シェルは、1ミクロン以下の平均厚さを有する。好ましくは、シェルは、少なくとも2nmの厚さを有する。粒子の明るさは、少なくとも部分的に、シェル厚さの選択によって制御され得る。
本明細書に提供される数平均直径は、Malvern Zetasizer Nano ZSによって測定されたものである。
本明細書に提供されるような平均シェル厚さは、(数平均粒子直径-数平均コア直径)/2で与えられる。
本明細書に記載されるような粒子は、粉末として提供され得る。いくつかの実施形態では、粒子は、乾燥した、任意選択的に凍結乾燥した形態で保存され得る。粒子は、凍結形態で保存され得る。
本明細書に記載されるような粒子は、液体中に懸濁されている粒子を含むコロイド懸濁液で提供され得る。好ましくは、液体は、水、C1~8アルコール、およびこれらの混合物から選択される。好ましくは、粒子は、液体中に均一な(凝集していない)コロイドを形成する。液体は、その中に溶解した塩を含む溶液、任意選択的に緩衝溶液であり得る。
任意選択的に、本明細書に記載されるような発光粒子は、エネルギー源、例えば、光源によって励起されたとき、電磁スペクトルの可視範囲において発光する。
発光粒子からの発光は、350~1,000nmの範囲のピーク波長を有し得る。可視範囲における発光は、赤色、緑色、もしくは青色光、またはそれらの混合物を含んでいてもよく、またはそれらからなっていてもよい。
青色発光粒子は、500nm以下、好ましくは400~500nm、任意選択的に400~490nmの範囲のピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有し得る。
緑色発光粒子は、500nm超~最大580nm、任意選択的に500nm超~最大540nmのピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有し得る。
赤色発光粒子は、580nm超~最大630nm、任意選択的に585nm~最大625nmのピークを有するフォトルミネッセンススペクトルを有し得る。
本明細書に記載されるような発光粒子のフォトルミネッセンススペクトルは、Ocean Optics 2000+分光計を使用して測定され得る。
任意選択的に、発光粒子からの発光は、220~1800nmの範囲のピーク波長を有する光源で照らした時に観測される。本明細書に記載されるような発光粒子のUV/vis吸収スペクトルは、Cary 5000 UV-vis-IR分光計を使用して測定され得る。
発光ポリマーは、10~850nmの範囲のストークスシフトを有してもよい。
ポリマー
本明細書に記載されるような発光システムのポリマーは、蛍光性または燐光性発光ポリマーであり得る。
本明細書に記載されるような発光システムのポリマーは、蛍光性または燐光性発光ポリマーであり得る。
本明細書に記載されるような発光システムのポリマーは、ホストポリマーであり得、発光システムは、発光材料をさらに含む。例示的な発光材料としては、限定されないが、蛍光性または燐光性有機材料、および量子ドットが挙げられる。
発光システムのポリマーは、少なくとも0.01mg/ml、任意選択的に少なくとも0.1、1、5、または10mg/mlの、20℃の水またはC1~8アルコールへの溶解度を有し得る。任意選択的に、溶解度は、0.01~10mg/mlの範囲である。
ポリマーは、少なくとも0.01mg/ml、任意選択的に少なくとも0.1、1、5、または10mg/mlの、20℃のC1~4アルコール、好ましくはメタノールへの溶解度を有し得る。
溶解度は、溶媒と発光ポリマーとの混合物を撹拌しながら60℃で30分間ホットプレート上で加熱し、溶液を20℃まで冷却させた後、白色光および/または紫外線下での目視観測によって決定され得る。
本明細書に記載されるポリマーのゲル浸透クロマトグラフィーによって測定されるポリスチレン当量数平均分子量(Mn)は、約1×103~1×108、好ましくは1×104~5×106の範囲であり得る。本明細書に記載される発光ポリマーのポリスチレン当量重量平均分子量(Mw)は、1×103~1×108、好ましくは1×104~1×107であり得る。
本明細書に記載されるようなポリマーは、共役または非共役ポリマーであり得る。本明細書で使用される場合、「共役ポリマー」とは、ポリマーの骨格が、隣接する繰り返し単位の芳香族基、ヘテロ芳香族基、またはビニレン基に直接共役している芳香族基、ヘテロ芳香族基、またはビニレン基を含有することを意味する。骨格は、その全長に沿って共役されてもよい。骨格は、互いに共役していない複数の共役切片を含有し得る。
本明細書に記載されるような共役ポリマーは、アリーレン繰り返し単位、ヘテロアリーレン繰り返し単位、およびアリールアミン繰り返し単位のうちの1つ以上を含有してもよく、それらの各々は、非置換であり得るか、または1つ以上の置換基で置換され得る。
置換基は、非極性置換基、例えば、C1~30ヒドロカルビル置換基、および極性置換基から選択され得る。極性置換基は、イオン性または非イオン性であり得る。極性置換基は、発光ポリマーに、少なくとも0.1mg/ml、任意選択的に少なくとも0.2、0.3、または0.5mg/mlの、20℃のC1~8アルコールの溶解度を付与し得る。
非極性置換基は、限定されないが、C1~30ヒドロカルビル基、例えば、C1~20アルキル、非置換フェニル、および1つ以上のC1~20アルキル基で置換されたフェニルを含む。
例示的な非イオン性極性基は、式-O(R3O)q-R4を有し、式中、各発生におけるR3は、C1~10アルキレン基、任意選択的にC1~5アルキレン基であり、アルキレン基の1つ以上の非隣接非末端C原子は、Oで置換され得、R4は、HまたはC1~5アルキルであり、qは、少なくとも1、任意選択的に1~10である。好ましくは、qは少なくとも2である。より好ましくは、qは2~5である。qの値は、式-O(R3O)q-R4のすべての極性基において同じであってもよい。qの値は、同じポリマーの非イオン性極性基間で異なっていてもよい。
R3に関して、本明細書で使用される場合、「C1~5アルキレン基」とは、式-(CH2)f-の基を意味し、式中、fは、1~5である。
任意選択的に、ポリマーは、式-O(CH2CH2O)qR4の非イオン性極性基を含み、式中、qは、少なくとも1、任意選択的に1~10であり、R4は、C1~5アルキル基、好ましくはメチルである。好ましくは、qは少なくとも2である。より好ましくは、qは2~5であり、最も好ましくは、qは3である。
イオン性置換基は、アニオン性またはカチオン性であり得る。
例示的なアニオン性基は、-COO-、スルホネート基、水酸化物、スルフェート、ホスフェート、ホスフィネート、またはホスホネートである。アニオン性基のカウンターカチオンは、金属カチオン、任意選択的にLi+、Na+、K+、Cs+、好ましくはCs+、および有機カチオン、任意選択的にテトラアルキルアンモニウムなどのアンモニウム、エチルメチルイミダゾリウム、またはピリジニウムから選択され得る。
例示的なカチオン性基は、-N(R5)3
+であり、式中、各発生におけるR5は、HまたはC1~12ヒドロカルビルである。好ましくは、各R5は、C1~12ヒドロカルビル、例えば、C1~12アルキル、非置換フェニル、および1つ以上のC1~6アルキル基で置換されたフェニルである。カチオン性基のカウンターアニオンは、ハロゲン化物、スルホネート基、任意選択的にメシレートもしくはトシレート、水酸化物、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ホスフィネート、ホスホネート、またはボレートであり得る。
極性置換基は、式-Sp-(R1)nを有してもよく、式中、Spは、スペーサ基であり、nは、少なくとも1、任意選択的に1、2、3、または4であり、各発生におけるR1は、独立して、イオン性または非イオン性極性基である。
好ましくは、Spは、
-1つ以上の非隣接C原子が、O、S、N、またはC=Oで置換され得る、C1~20アルキレンまたはフェニレン-C1~20アルキレン、
-1つ以上の置換基R1以外が、非置換であり得るか、または1つ以上の非極性置換基、任意選択的に1つ以上のC1~20アルキル基で置換され得る、C6~20アリーレンまたは5~20員ヘテロアリーレン、より好ましくはフェニレンから選択される。
-1つ以上の非隣接C原子が、O、S、N、またはC=Oで置換され得る、C1~20アルキレンまたはフェニレン-C1~20アルキレン、
-1つ以上の置換基R1以外が、非置換であり得るか、または1つ以上の非極性置換基、任意選択的に1つ以上のC1~20アルキル基で置換され得る、C6~20アリーレンまたは5~20員ヘテロアリーレン、より好ましくはフェニレンから選択される。
本明細書で使用される場合、「アルキレン」とは、分岐または線状の二価アルキル鎖を意味する。
任意選択的に、共役発光ポリマーは、C6~20アリーレン繰り返し単位、例えば、フェニレンフルオレン、インデノフルオレン、ベンゾフルオレン、ジヒドロフェナントレン、フェナントレン、ナフタレン、およびアントラセン繰り返し単位から選択される、1つ以上のアリーレン繰り返し単位を含有する。
任意選択的に、ポリマーは、式(III)~(VI)から選択される1つ以上のアリーレン繰り返し単位を含有し、
式中、各発生におけるR13は、独立して、置換基であり、2つのR13基は、連結されて、環を形成し、cは、0、1、2、3、または4、好ましくは1または2であり、各dは、独立して、0、1、2、または3、好ましくは0または1であり、eは、0、1、または2、好ましくは2である。
各R13基は、存在する場合、本明細書に記載されるような非極性または極性置換基から選択され得る。
いくつかの実施形態では、2つのR13基は、連結されて、6員環または7員環を形成し得る。任意選択的に、2つのR13基は、連結されて、環を形成し、連結されたR13基は、C4-またはC5-アルキレン鎖を形成し、アルキレン鎖の1つ以上の非隣接C原子は、O、S、NR10、またはSi(R10)2で置換され得、式中、各発生におけるR10は、独立して、C1~20ヒドロカルビル基である。
いくつかの実施形態では、R13基は、互いに連結されていない。
ポリマー骨格中に1つ以上の非置換または置換5~20員ヘテロアリーレン基を含むか、またはそれらからなる繰り返し単位としては、チオフェン繰り返し単位、ビチオフェン繰り返し単位、ベンゾチアジアゾール繰り返し単位、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なヘテロアリーレン繰り返し単位としては、式(VIII)~(XI)の繰り返し単位が挙げられ、
式中、R11は、各発生において独立して、C1~20ヒドロカルビル基であり、各発生におけるZは、独立して、置換基、好ましくはFまたはC1~20ヒドロカルビル基であり、fは、0、1、または2であり、R12、R13、およびdは、上述のとおりである。
本明細書の任意の場所に記載されるようなC1~20ヒドロカルビル基は、任意選択的に、C1~20アルキル、非置換フェニル、および1つ以上のC1~12アルキル基で置換されたフェニルから選択される。
各R13は、上述のように、独立して、極性および非極性置換基から選択され得る。
アリールアミン繰り返し単位は、式(XII)を有していてもよく、
式中、各発生におけるAr8、Ar9、およびAr10は、独立して、置換もしくは非置換アリールまたはヘテロアリールから選択され、gは、0、1、または2、好ましくは0または1であり、R13は、各発生において独立して、置換基であり、x、y、およびzは、各々独立して、1、2、または3である。
R9は、gが1または2の場合、各発生において、同じまたは異なっていてもよく、好ましくは、アルキル、任意選択的にC1~20アルキル、Ar11、およびAr11基の分岐状または直鎖状鎖からなる群から選択され、各発生におけるAr11は、独立して、置換または非置換アリールまたはヘテロアリールである。
同じN原子に直接結合しているAr8、Ar9、ならびに存在する場合、Ar10、およびAr11から選択される任意の2つの芳香族またはヘテロ芳香族基は、直接結合、または二価の連結原子もしくは基によって連結され得る。好ましい二価の連結原子および基としては、O、S、置換されたN、および置換されたCが挙げられる。
Ar8およびAr10は、好ましくはC6~20アリール、より好ましくはフェニルであり、それらは、非置換であり得るか、または1つ以上の置換基で置換され得る。
g=0の場合、Ar9は、好ましくはC6~20アリール、より好ましくはフェニルであり、それらは、非置換であり得るか、または1つ以上の置換基で置換され得る。
g=1の場合、Ar9は、好ましくはC6~20アリール、より好ましくはフェニル、または多環芳香族基、例えば、ナフタレン、ペリレン、アントラセン、もしくはフルオレンであり、それらは、非置換であり得るか、または1つ以上の置換基で置換され得る。g=1のとき、Ar9がアントラセンであることが特に好ましい。
R9は、好ましくはAr11、またはAr11基の分岐状もしくは直鎖状鎖である。各発生におけるAr11は、好ましくはフェニルであり、それは、非置換であり得るか、または1つ以上の置換基で置換され得る。
Ar8、Ar9、ならびに存在する場合、Ar10、およびAr11は、各々独立して、非置換であるか、または1つ以上、任意選択的に1、2、3、または4つの置換基で置換される。
置換基は、独立して、本明細書に記載されるような非極性または極性置換基から選択され得る。
Ar8、Ar9、ならびに存在する場合、Ar10、およびAr11の好ましい置換基は、C1~40ヒドロカルビル、好ましくはC1~20アルキルである。
本明細書に記載されるような共役ポリマーは、モノマーの重合時に脱離して、共役繰り返し単位を形成する脱離基を含むモノマーを重合することによって形成され得る。例示的な重合方法としては、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、T.Yamamoto,「Electrically Conducting And Thermally Stable pi-Conjugated Poly(arylene)s Prepared by Organometallic Processes」,Progress in Polymer Science 1993,17,1153-1205に記載されているようなYamamoto重合、ならびに例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、WO00/53656、WO2003/035796、およびUS5777070に記載されるようなSuzuki重合が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されるポリマーのゲル浸透クロマトグラフィーによって測定されるポリスチレン当量数平均分子量(Mn)は、約1×103~1×108、好ましくは1×104~5×106の範囲であり得る。本明細書に記載されるポリマーのポリスチレン換算重量平均分子量(Mw)は、1×103~1×108、好ましくは1×104~1×107であり得る。
複合コア形成
シリカマトリックスの場合、複合コアは、ポリマーの存在下で複合コアに組み込まれる溶解ポリマーの存在下でシリカを形成するためのモノマーを反応させることによって形成され得る。
シリカマトリックスの場合、複合コアは、ポリマーの存在下で複合コアに組み込まれる溶解ポリマーの存在下でシリカを形成するためのモノマーを反応させることによって形成され得る。
任意選択的に、シリカモノマーは、アルコキシシラン、好ましくはトリアルコキシまたはテトラアルコキシシラン、任意選択的にC1~12トリアルコキシまたはテトラアルコキシシラン、例えば、テトラエチルオルトシリケートである。シリカモノマーは、アルコキシ基のみで置換され得るか、または1つ以上の基で置換され得る。
任意選択的に、シリカモノマーは、イオン性溶媒またはプロトン性溶媒、好ましくは、水、アルコール、およびそれらの混合物から選択される溶媒を含むか、またはそれからなる液体中で重合される。例示的なアルコールとしては、メタノール、エタノール、1-プロパノール、イソプロパノール、1-ブタノール、2-ブタノール、t-ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されることはない。好ましくは、溶媒系は、水以外の非アルコール溶媒を含まない。好ましくは、ポリマーは、液体中に溶解する。
重合は、塩基、例えば、金属水酸化物、好ましくは、アルカリ金属水酸化物、水酸化アンモニウム、または水酸化テトラアルキルアンモニウムの存在下で行われてもよい。
シリカシェルの場合、シェルの形成は、コアの存在下で、コアに関して説明され得るシリカモノマーの重合によって行われ得る。
好ましくは、シェルは、コアの存在下、および発光システムの任意の遊離ポリマー、すなわち、コアの一部ではないポリマーの不存在下で形成される。
いくつかの実施形態では、シリカマトリックスを含むコアは、第1のステップで形成され、シリカを含むシェルは、コアが形成された反応混合物から最初に単離することなく、第2のステップで形成される。好ましくは、発光システムのポリマーは、第1のステップ後に溶液中に残っていない。これは、例えば、第1のステップで形成されたコアから分離された溶液を残留蛍光について試験することによって検証され得る。
粒子を、シェルの形成後に単離し、水性溶媒、有機溶媒、またはそれらの混合物に再懸濁させてもよい。複合粒子を、遠心分離により反応混合物から単離してもよい。
表面基
1つ以上の表面基は、シェルの外面に結合、例えば、共有結合し得る。
1つ以上の表面基は、シェルの外面に結合、例えば、共有結合し得る。
いくつかの実施形態では、官能基は、シェルに結合している。官能基は、シェルの表面に直接結合し得るか、または表面結合基を介して結合し得る。
いくつかの実施形態では、官能基は、カルボン酸基、またはその塩、エステル、もしくは酸塩化物を含む。官能性カルボン酸基は、アルコール、例えば、ポリエチレングリコールなどのグリコール、およびアジドを含むが、これらに限定されない広範囲の基と反応させてもよい。
いくつかの実施形態では、酸官能基は、生体分子を粒子の表面、例えば、ビオチンに結合するために使用され得、これは次に、アッセイにおいて標的生体分子に結合するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、酸基は、アッセイにおいて、標的生体分子、例えば、標的抗体、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドのアミノ基に直接結合するために使用され得る。
シェルの表面は、反応性基、例えば、反応して官能基を粒子に結合し得るヒドロキシル基を担持し得る。
いくつかの実施形態では、反応性材料は、反応性表面基と直接反応される。
いくつかの実施形態では、反応性表面基は、官能基が反応性表面基に結合する前に修飾される。いくつかの実施形態では、アミノ基は、粒子の表面において形成される。任意選択的に、ヒドロキシル反応性表面基は、アミノシラン、例えば、式(I)の化合物と反応され得、
(R1O)3Si-R2-N(R3)2
(I)
式中、各発生におけるR1は、C1~20ヒドロカルビル基、好ましくはC1~12アルキル基であり、R2は、C1~20ヒドロカルビレン基、好ましくはC1~20アルキレン基であり、各発生におけるR3は、HまたはC1~20ヒドロカルビル基、好ましくはHである。
(R1O)3Si-R2-N(R3)2
(I)
式中、各発生におけるR1は、C1~20ヒドロカルビル基、好ましくはC1~12アルキル基であり、R2は、C1~20ヒドロカルビレン基、好ましくはC1~20アルキレン基であり、各発生におけるR3は、HまたはC1~20ヒドロカルビル基、好ましくはHである。
粒子の表面におけるアミノ反応性基は、官能基を形成するための反応性材料と反応され得る。
反応性材料は、官能基またはその誘導体、および反応性表面基と反応するための反応性基を含有し得る。
反応性材料は、反応性表面基との反応のために、カルボキシル基またはその誘導体、例えば、酸塩化物、酸無水物、またはNHSエステルを含むが、これらに限定されない、エステルを含有し得る。
いくつかの実施形態では、反応性材料は、式(II)を有し、
HOOC-(C2H5O)n-COOH
(II)
式中、nは、少なくとも1、任意選択的に1~100である。
HOOC-(C2H5O)n-COOH
(II)
式中、nは、少なくとも1、任意選択的に1~100である。
いくつかの実施形態では、反応性材料は、粒子表面との反応時に、粒子表面に結合した第1のカルボン酸誘導体、および第2の遊離カルボン酸官能基を形成する無水物(例えば、無水コハク酸)である。
発光粒子は、2つ以上の異なる表面基を含み得る。任意選択的に、1つの表面基は、官能基を含み、別の表面基は、官能基を含まない。表面基または各表面基は、ポリエーテル鎖を含み得る。本明細書で使用される場合、「ポリエーテル鎖」とは、複数のエーテル基、例えば、ポリエチレングリコール鎖を含む二価鎖を意味する。
用途
本明細書に記載されるような発光粒子は、ラテラルフローまたは固体イムノアッセイなどのイムノアッセイにおけるルミネッセントプローブとして使用され得る。任意選択的に、発光粒子は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、例えば、次世代シーケンシングのための核酸配列決定方法、インビボイメージング、または標的分析物に結合するように構成された発光マーカーが、分析対象の試料と接触する任意の他の用途に使用するためのものである。本用途は、患者(該当する場合)が関与しているか、または研究目的であるかにかかわらず、医療、獣医、農業、または環境用途であり得る。
本明細書に記載されるような発光粒子は、ラテラルフローまたは固体イムノアッセイなどのイムノアッセイにおけるルミネッセントプローブとして使用され得る。任意選択的に、発光粒子は、蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、例えば、次世代シーケンシングのための核酸配列決定方法、インビボイメージング、または標的分析物に結合するように構成された発光マーカーが、分析対象の試料と接触する任意の他の用途に使用するためのものである。本用途は、患者(該当する場合)が関与しているか、または研究目的であるかにかかわらず、医療、獣医、農業、または環境用途であり得る。
発光マーカー粒子として使用する場合、発光粒子は、発光ポリマーの吸収波長で照らされ得るか、または存在する場合、発光ポリマーにエネルギーを移送するように構成された材料の吸収波長で照らされ得、発光ポリマーからの発光が検出され得る。いくつかの実施形態では、粒子との接触後の試料は、フローサイトメトリーによって分析される。フローサイトメトリーでは、粒子は、少なくとも1つの光の波長、任意選択的に2つ以上の異なる波長、例えば、355、405、488、530、562、および640nm±10nmのうちの少なくとも1つを含む、1つ以上の波長によって照らされる。粒子によって放出された光は、1つ以上の検出器によって収集され得る。検出器は、限定されないが、光電子増倍管およびフォトダイオードから選択され得る。染色指数の計算のためのバックグラウンド信号を提供するために、測定は、粒子に結合しない細胞と混合された粒子で行われてもよい。
いくつかの実施形態では、標的分析物は、標的分析物に結合し得る基を担持する表面上に、標的分析物が粒子に結合する前または後のいずれかに、固定化され得る。次いで、表面上に固定化された標的分析物に結合した粒子は、標的分析物に結合していない任意の発光粒子から分離され得る。
発光粒子は、DNA、RNA、ペプチド、炭水化物、抗体、抗原、酵素、タンパク質、およびホルモンが挙げられるが、これらに限定されない、標的生体分子に結合するように構成され得る。いくつかの実施形態では、標的生体分子は、細胞の表面における生体分子(例えば、タンパク質)である。
生体分子結合基は、標的生体分子に従って粒子の表面に提供され得ることが理解されよう。
いくつかの好ましい実施形態では、粒子は、標的分析物に直接結合するビオチンを含む。
いくつかの実施形態では、第1のビオチン基は、粒子に結合し、次に、複数のビオチン結合部位、好ましくは、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、またはそれらの組換え変異体もしくは誘導体を有するタンパク質に結合し、第2のビオチン基を有するビオチン化生体分子は、同じタンパク質に結合する。ビオチン化生体分子は、標的分析物に従って選択され得る。ビオチン化生体分子は、標的抗原に従って選択され得る抗原結合断片、例えば、抗体を含み得る。
発光粒子が核酸配列決定方法に使用される場合、発光粒子の表面は、ヌクレオチドに結合して試験ヌクレオチドを形成することができる基を担持し得る。例えば、試験ヌクレオチドおよび発光粒子のうちの一方は、ビオチンで官能化され得、試験ヌクレオチドおよび共役ポリマーのうちの他方は、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはそれらの組換え変異体で官能化され得る。
実施例1 シェル化されていないシリカ-LEPナノ粒子の合成
発光ポリマー1(LEP1)を1mg/mLの濃度の無水メタノール中で溶解し、その溶液を60℃で15分間加熱し、次いで、室温まで冷却した。10mLの琥珀色の小瓶中のこのLEP溶液0.5mLに、0.83mLの無水メタノール、0.66mLのオクタノール、および0.13mLの水酸化アンモニウム(28~30%の水溶液)を添加した。この小瓶をセプタム付の密嵌キャップで閉じ、反応混合物を撹拌しながら60℃まで加熱した。5分後、テトラエチルオルトシリケートの溶液(TEOS、0.025mL)、メタノール(0.33mL)、およびオクタノール(0.17mL)を反応混合物に急速に注入し、60℃でさらに1時間撹拌し続けた。室温まで冷却した後、反応混合物を2×1.5mLの微小遠心管に移し、14,000rpmで4分間遠心分離し、上清をデカントした。微小遠心管を閉じ、超音波ホーン(振幅20%、5×5秒パルス)を装着した水浴に浸すことにより、ペレット化されたナノ粒子をメタノール(総体積=2.5mL)中に再分散させた。各洗浄に2.5mLの新しいメタノールを使用して、さらに遠心分離、デカンテーション、および超音波処理により、洗浄を2回繰り返した。ナノ粒子を、保管のために2.5mLのメタノール中に再懸濁させ、これらの大きさをMalvern Zetasizer Nano Sを使用するDLSによって測定した.
発光ポリマー1(LEP1)を1mg/mLの濃度の無水メタノール中で溶解し、その溶液を60℃で15分間加熱し、次いで、室温まで冷却した。10mLの琥珀色の小瓶中のこのLEP溶液0.5mLに、0.83mLの無水メタノール、0.66mLのオクタノール、および0.13mLの水酸化アンモニウム(28~30%の水溶液)を添加した。この小瓶をセプタム付の密嵌キャップで閉じ、反応混合物を撹拌しながら60℃まで加熱した。5分後、テトラエチルオルトシリケートの溶液(TEOS、0.025mL)、メタノール(0.33mL)、およびオクタノール(0.17mL)を反応混合物に急速に注入し、60℃でさらに1時間撹拌し続けた。室温まで冷却した後、反応混合物を2×1.5mLの微小遠心管に移し、14,000rpmで4分間遠心分離し、上清をデカントした。微小遠心管を閉じ、超音波ホーン(振幅20%、5×5秒パルス)を装着した水浴に浸すことにより、ペレット化されたナノ粒子をメタノール(総体積=2.5mL)中に再分散させた。各洗浄に2.5mLの新しいメタノールを使用して、さらに遠心分離、デカンテーション、および超音波処理により、洗浄を2回繰り返した。ナノ粒子を、保管のために2.5mLのメタノール中に再懸濁させ、これらの大きさをMalvern Zetasizer Nano Sを使用するDLSによって測定した.
実施例1に記載の方法により形成された1mLのナノ粒子懸濁液を1.5mLの微小遠心管に移し、14000rpmで4分間遠心分離して固形物を単離し、上清をデカンテーションにより除去した。次いで、ペレット化されたナノ粒子を、超音波ホーン(振幅20%、5×5秒パルス)を装着した水浴に浸すことにより、メタノールおよびオクタノールの2:1混合物1mL中に再懸濁させた。水酸化アンモニウム(0.075mL、28~30%水溶液)をこの反応混合物と混合し、続いて0.003mLまたは0.005mLのTEOSと混合した。次いで、分散液を、ローラー上に1時間放置することによって室温で混合し、続いて、実施例1に記載されるように、1mLのメタノール中で遠心分離、デカンテーション、および再懸濁によって3回洗浄した。ナノ粒子を、DLS分析および保管のために、1mLのメタノール中に最終的に再懸濁させた。
表1を参照すると、粒子へのTEOSの添加は、メタノール中でDLSによって測定されたように、Z平均および数平均(N平均)直径の増加を示している。多分散性(PdI)は、シェリング反応後も非常に低い(<0.1)ままである。
シェル厚さ、したがって粒子直径に対するTEOSの量の影響は、より広範囲のTEOS量にわたって検討された。図3に提示された結果は、TEOSの量と粒子直径との間の明確な関係を例示している。
実施例3 シリカ-LEPナノ粒子のアミノ表面修飾
(実施例1の方法を使用して形成されたような)シェル化されていないシリカ-LEPナノ粒子または(実施例2の方法を使用して形成されたような)シェル化されたシリカ-LEPナノ粒子を、以下のようにさらに修飾した。メタノール中のナノ粒子分散液の1mLに、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(0.04mL)を添加した。次いで、分散液を、ローラー上に1時間放置することによって室温で混合し、続いて、実施例1に記載されるように、1mLのメタノール中で遠心分離、デカンテーション、および再懸濁によって3回洗浄した。アミノ化ナノ粒子を、保管のために1mLのメタノール中に最終的に再懸濁させた。
(実施例1の方法を使用して形成されたような)シェル化されていないシリカ-LEPナノ粒子または(実施例2の方法を使用して形成されたような)シェル化されたシリカ-LEPナノ粒子を、以下のようにさらに修飾した。メタノール中のナノ粒子分散液の1mLに、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(0.04mL)を添加した。次いで、分散液を、ローラー上に1時間放置することによって室温で混合し、続いて、実施例1に記載されるように、1mLのメタノール中で遠心分離、デカンテーション、および再懸濁によって3回洗浄した。アミノ化ナノ粒子を、保管のために1mLのメタノール中に最終的に再懸濁させた。
実施例4 無水コハク酸との反応によるアミノ化シリカ-LEPナノ粒子のカルボキシ官能化
実施例3で形成されたような、メタノール(1mL)中のアミノ化ナノ粒子を1.5mLの微小遠心管に移し、14,000rpmで4分間遠心分離し、上清をデカンテーションにより除去した。ペレット化されたナノ粒子に、ジメチルホルムアミド中の無水コハク酸の5重量%溶液1mLを添加し、その粒子を、超音波ホーン(振幅20%、5×5秒パルス)を装着した水槽に浸すことにより、この溶液中に再懸濁させた。次いで、分散液を、ローラー上に1時間放置することによって室温で混合し、続いて、実施例1に記載されるように、1mLのメタノール中で遠心分離、デカンテーション、および再懸濁によって3回洗浄した。アミノ化ナノ粒子を、保管のために1mLのメタノール中に最終的に再懸濁させた。
実施例3で形成されたような、メタノール(1mL)中のアミノ化ナノ粒子を1.5mLの微小遠心管に移し、14,000rpmで4分間遠心分離し、上清をデカンテーションにより除去した。ペレット化されたナノ粒子に、ジメチルホルムアミド中の無水コハク酸の5重量%溶液1mLを添加し、その粒子を、超音波ホーン(振幅20%、5×5秒パルス)を装着した水槽に浸すことにより、この溶液中に再懸濁させた。次いで、分散液を、ローラー上に1時間放置することによって室温で混合し、続いて、実施例1に記載されるように、1mLのメタノール中で遠心分離、デカンテーション、および再懸濁によって3回洗浄した。アミノ化ナノ粒子を、保管のために1mLのメタノール中に最終的に再懸濁させた。
実施例5 リン酸緩衝生理食塩水中のカルボキシ官能化シリカ-LEPナノ粒子の安定性
メタノール中のカルボキシ修飾ナノ粒子の固形分は、0.2mLのアリコートを遠心分離し(14,000rpm、4分)、上清をデカントし、16時間空気中に放置して乾燥させ、次いで残留固形物の重さを量ることによって決定した。この測定後、1mgの固形物を含有するナノ粒子の体積を、遠心分離して上清をデカントすることによって単離した。次いで、固体ナノ粒子を、超音波ホーン(振幅20%、5×5秒パルス)を装着した水浴に浸すことにより、1mLのリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)中に再懸濁させた。DLS測定は、再懸濁直後および表2に示される時間間隔後に行われた。
メタノール中のカルボキシ修飾ナノ粒子の固形分は、0.2mLのアリコートを遠心分離し(14,000rpm、4分)、上清をデカントし、16時間空気中に放置して乾燥させ、次いで残留固形物の重さを量ることによって決定した。この測定後、1mgの固形物を含有するナノ粒子の体積を、遠心分離して上清をデカントすることによって単離した。次いで、固体ナノ粒子を、超音波ホーン(振幅20%、5×5秒パルス)を装着した水浴に浸すことにより、1mLのリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)中に再懸濁させた。DLS測定は、再懸濁直後および表2に示される時間間隔後に行われた。
表2に示されるように、シリカおよびLEP1のコアを含有するシェル化されているナノ粒子は、シェル化されていないナノ粒子よりも凝集傾向が非常に低い。
比較のために、これらのナノ粒子の安定性を、シリカのみからなるコアを有する、シェル化されていないナノ粒子と比較した。表3に示されるように、このようなナノ粒子は、シリカおよびLEP1のコアを有する、シェル化されていないナノ粒子よりも著しく高い安定性を示す。表3では、安定期は、動的光散乱法で測定したZ平均直径が10%増加するのにかかる時間である。
実施例6 シェル化されたシリカ-LEPナノ粒子のワンポット形成
無水メタノール(2.5mL、実施例1に記載のように形成)中のLEP1の溶液に、無水メタノール(5.33mL)、オクタノール(4.17mL)、および水酸化アンモニウム(28~30%、水溶液)を添加した。この溶液を、セプタム付の20mLの琥珀色の小瓶に密栓し、撹拌しながら60℃まで加熱した。5分後、メタノール(0.5mL)中のTEOSの溶液(0.125mL)を反応混合物に急速に注入し、さらに1時間撹拌し続けた。この後、反応混合物を室温まで冷却し、追加のTEOS(19μL)を添加し、続いて室温で1時間撹拌した。次いで、ナノ粒子を、実施例1に記載の手順を使用して洗浄した。保管のために、ナノ粒子を再懸濁させるために使用したメタノールの最終体積は、11mLであった。比較のために、シェル化されていないナノ粒子は、同じプロセスによって作製したが、1時間後に追加の19μLのTEOSを添加することなく作製した。
無水メタノール(2.5mL、実施例1に記載のように形成)中のLEP1の溶液に、無水メタノール(5.33mL)、オクタノール(4.17mL)、および水酸化アンモニウム(28~30%、水溶液)を添加した。この溶液を、セプタム付の20mLの琥珀色の小瓶に密栓し、撹拌しながら60℃まで加熱した。5分後、メタノール(0.5mL)中のTEOSの溶液(0.125mL)を反応混合物に急速に注入し、さらに1時間撹拌し続けた。この後、反応混合物を室温まで冷却し、追加のTEOS(19μL)を添加し、続いて室温で1時間撹拌した。次いで、ナノ粒子を、実施例1に記載の手順を使用して洗浄した。保管のために、ナノ粒子を再懸濁させるために使用したメタノールの最終体積は、11mLであった。比較のために、シェル化されていないナノ粒子は、同じプロセスによって作製したが、1時間後に追加の19μLのTEOSを添加することなく作製した。
Claims (24)
- マトリックス材料を含む複合コアと、ポリマーを含む発光システムであって、前記ポリマーが前記コア内に分布している、発光システムと、前記コアと接触し、前記コアを取り囲む無機酸化物を含むシェル層と、を含む、発光粒子。
- 前記無機酸化物が、シリカである、請求項1に記載の発光粒子。
- 前記シェル層が、少なくとも2nmの厚さを有する、請求項1または2に記載の発光粒子。
- 前記シェル層が、100nm以下の厚さを有する、先行請求項のいずれか一項に記載の発光粒子。
- 前記ポリマーが、発光ポリマーである、先行請求項のいずれか一項に記載の発光粒子。
- 前記ポリマーが、少なくとも0.01mg/mlの20℃の水またはC1~8アルコールへの溶解度を有する、先行請求項のいずれか一項に記載の発光粒子。
- 前記マトリックス材料が、シリカである、先行請求項のいずれか一項に記載の発光粒子。
- 前記粒子が、1000nm未満の直径を有するナノ粒子である、先行請求項のいずれか一項に記載の発光粒子。
- 表面基が、前記シェル層に結合している、先行請求項のいずれか一項に記載の発光粒子。
- 前記表面基が、カルボン酸基、またはその塩もしくはエステルを含む、請求項9に記載の発光粒子。
- 前記表面基が、ポリエーテル鎖を含む、請求項9または10に記載の発光粒子。
- 先行請求項のいずれか一項に記載の発光粒子を含む、粉末。
- 液体中に分散した請求項1~11のいずれか一項に記載の発光粒子を含む、分散液。
- 前記液体が、緩衝溶液である、請求項13に記載の分散液。
- 前記コアの形成が、前記ポリマーの存在下で前記マトリックスを形成するためのモノマーの重合を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の発光粒子を形成する方法。
- 前記ポリマーが、溶解した形態である、請求項15に記載の方法。
- 前記シェルが、シリカを含み、前記シェルの形成が、前記コアの存在下でシリカを形成するためのモノマーの重合を含む、請求項15または16に記載の方法。
- 生体分子にマーキングする方法であって、前記方法が、請求項1~11のいずれか一項に記載の発光粒子に前記生体分子を結合させるステップを含む、方法。
- 標的分析物のアッセイ方法であって、試料を、請求項1~11のいずれか一項に記載の発光粒子と接触させることと、前記標的分析物の、発光マーカーへの任意の結合を決定することと、を含む、アッセイ方法。
- 前記発光粒子と接触した前記試料が、フローサイトメトリーによって分析される、請求項19に記載のアッセイ方法。
- 前記発光粒子に結合した標的分析物の量が、決定される、請求項20に記載のアッセイ方法。
- 前記試料が、細胞の混合物を含み、前記発光粒子に結合した1つ以上の異なるタイプの標的細胞が、同定および/または定量化される、請求項20または21に記載のアッセイ方法。
- 前記発光粒子に結合した前記標的分析物が、前記発光粒子に結合していない前記標的分析物から分離される、請求項19に記載の方法。
- 核酸を配列決定する方法であって、
プライミング鋳型核酸分子を、ポリメラーゼおよび試験ヌクレオチドと接触させることと、
前記試験ヌクレオチドをプライミング鋳型のプライミング鎖に、前記試験ヌクレオチドが前記鋳型鎖の次の塩基に相補的な塩基を含む場合にのみ、組み込むことと、
前記プライミング鎖を照らすことと、
前記プライミング鎖の輝度から、前記試験ヌクレオチドが前記プライミング鎖に組み込まれているかどうかを判定することと、を含み、
前記照らされたプライミング鎖の前記試験ヌクレオチドが、請求項1~11のいずれか一項に記載の発光粒子に結合する、方法。
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