CN107880872A - 一种基于共轭聚合物的表面增强拉曼‑荧光双模纳米探针及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于共轭聚合物的表面增强拉曼‑荧光双模纳米探针及其制备方法，所述探针为四层核壳结构，由内至外分别为连接有拉曼信号分子的贵金属纳米颗粒内核，包裹内核的第一修饰层，覆盖第一修饰层的共轭聚合物荧光分子层，以及包裹共轭聚合物荧光分子层的第二修饰层。本发明的纳米探针采用了共轭聚合物纳米颗粒作为荧光信号来源，既提高了光化学稳定性又降低了生物毒性。通过控制第一修饰层厚度调控荧光分子与金属核之间的距离，实现对探针光学性质的调控。本发明的SERS‑MEF双模探针同时还兼具表面增强拉曼光谱与金属增强荧光的双重优势，可实现多变量分析以及快速成像等，可广泛应用于生物医学检测中，具有较大的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物分析化学技术领域。更具体地，涉及一种基于共轭聚合物的表面增强拉曼-荧光双模纳米探针及其制备方法。
背景技术
近年来，各类癌症越来越成为威胁人类生命健康的一大杀手，对癌症的早期诊断与治疗尤为重要。
基于表面等离激元纳米结构的金属增强荧光（Metal-enhanced fluorescence,MEF）和表面增强拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering, SERS）在对化学及生物物质的快速而灵敏的鉴定与检测、分子成像、疾病监测等方面均表现出惊人的优势。SERS能够采集丰富的结构信息，从而可以确定分子或中间产物的含量，但要获得可信数据需要耗费大量的时间，在快速分析与高分辨成像中存在不足；MEF技术具有极高的灵敏度和快速显示分析物浓度变化的能力，却难以进行多成分分析。因此，同时融合了荧光与SERS两种技术的优势的SERS-MEF双模技术可大大提高生物检测的准确性和灵敏性，实现对癌细胞的靶向识别与追踪，揭示癌细胞起源、分化、粘附、转移等活动过程，对癌症的早期诊断与治疗有重要意义。应用SERS-MEF双模技术的关键在于双模探针的制备。目前国内外有关SERS-MEF双模探针的研究较少，而且仅有的关于SERS-荧光双模技术的研究也大多采用有机小分子或无机量子点作为荧光信号物质，存在光化学性质不稳定或者具有毒性等问题，这限制了它们在活体内的临床应用。在制备工艺上，目前已有的SERS-荧光双模探针将荧光分子直接掺杂在外层二氧化硅层中，既无法精准控制荧光分子与金属核的距离从而实现光学性质调控，又容易存在荧光分子逸出导致生物毒性的潜在问题。因此，制备出一种光化学性质稳定，具有高度生物相容性，具有双增强功能且光学性能可控的SERS-MEF双模探针具有极大的应用前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有SERS-荧光双模探针存在光化学性质不稳定或者具有毒性等问题，提供一种光化学性质稳定，具有高度生物相容性的SERS-MEF双模探针。所述探针采用共轭聚合物纳米颗粒作为荧光信号来源，既提高了光化学稳定性又降低了生物毒性。通过控制第一修饰层厚度调控荧光分子与金属核之间的距离，实现对探针光学性质的调控。所述双模探针同时还兼具表面增强拉曼光谱与增强荧光的双重优势，可实现多变量分析以及快速成像等，可广泛应用于生物医学检测中，具有较大的应用前景。
本发明的目的是提供一种基于共轭聚合物的表面增强拉曼-荧光双模纳米探针。
本发明的另一目的是提供所述表面增强拉曼-荧光双模纳米探针的制备方法。
本发明的再一目的是提供所述表面增强拉曼-荧光双模纳米探针的应用
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种基于共轭聚合物的表面增强拉曼-荧光双模纳米探针，所述探针为四层核壳结构，由内至外分别为连接有拉曼信号分子的贵金属纳米颗粒内核，包裹内核的第一修饰层，覆盖第一修饰层的共轭聚合物荧光分子层，以及包裹共轭聚合物荧光分子层的第二修饰层；所述第一修饰层的厚度为5～20 nm。
本发明的表面增强拉曼-荧光双模纳米探针由于采用了共轭聚合物纳米颗粒作为荧光信号来源，既提高了光化学稳定性又降低了生物毒性，更为重要的是严格控制金属纳米颗粒外的第一层二氧化硅层厚度，使其既能有效阻隔荧光分子与金属的直接接触而防止荧光猝灭，又使其保持在表面等离激元的增强作用区域内从而达到荧光增强效果。
优选地，所述双模纳米探针大小为60～120nm。
优选地，所述贵金属纳米颗粒内核为35 nm。
优选地，所述第一修饰层的厚度为8～16nm。
更优选地，所述第一修饰层的厚度为12nm。
优选地，所述贵金属纳米颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒。
优选地，所述修饰层为二氧化硅。
优选地，所述拉曼信号分子为4-巯基苯甲酸（4-MBA）
优选地，所述共轭聚合物为MEH-PPV或BDMO-PPV。
上述表面增强拉曼-荧光双模纳米探针的制备方法，包括如下步骤：
S1.柠檬酸钠还原法制备贵金属纳米颗粒水分散液；
S2.将拉曼信号分子溶液加入到S1的贵金属纳米颗粒水分散液中，超声或搅拌得到混合液；
S3.控制反应温度不高于20℃，将S2的混合液转移到无水乙醇中，搅拌混匀后再加入氨水，继续搅拌混匀，再滴加硅酸四乙脂/乙醇溶液，搅拌反应2～3h；再升温至28℃，继续反应18～20h，离心并清洗，获得SERS活性粒子；
S4.配制共轭聚合物四氢呋喃溶液，超声条件注入至蒸馏水中，制备共轭聚合物点（CPNs），真空静置使残余四氢呋喃挥发完全后备用；
S5.分别用硅烷偶联剂对S3的SERS活性粒子和S4的CPNs进行表面修饰，超声均匀使其表面带上活性官能团后将两者混合，继续超声均匀使CPNs吸附到SERS活性粒子表面；
S6.控制反应温度不高于20℃，往S5的混合溶液中依次加入NH4OH和TEOS/EtOH溶液，以Stöber方法包覆第二层二氧化硅，离心并清洗，获得SERS-MEF双模探针。
具体地，步骤S1所述柠檬酸钠还原法制备贵金属纳米颗粒水分散液具体为将HAuCl4水溶液加入到煮沸的蒸馏水中，继续煮沸后加入柠檬酸三钠水溶液，制得得到金纳米颗粒；
优选地，步骤S2所述拉曼信号分子为4-巯基苯甲酸（4-MBA）。
优选地，步骤S3所述混合液、无水乙醇、氨水以及硅酸四乙脂/乙醇溶液的体积比为5：200：7.5：1～4。
具体地，所述TEOS/EtOH溶液浓度为10 mM，当5mL拉曼信号分子-贵金属纳米颗粒水分散液加入的总体积为1.5 mL，2.0 mL，3.0 mL，4.0 mLTEOS/EtOH溶液时，对应所得的第一层SiO2厚度分别为8 nm，12 nm，16 nm，20nm。
优选地，步骤S3为分两次滴加硅酸四乙脂/乙醇溶液。
优选地，步骤S2所述超声或搅拌的时间为25～35min（优选30min）。
优选地，步骤S3所述搅拌混匀时间均为3～5min（优选5min）。
优选地，步骤S4所述共轭聚合物四氢呋喃溶液与蒸馏水的体积比为1：4。
优选地，步骤S4所述共轭聚合物为MEH-PPV或BDMO-PPV。
优选地，步骤S5所述SERS活性粒子、CPNs分散液和硅烷偶联剂的体积比为3mL：1mL：5uL。
优选地，步骤S5所述硅烷偶联剂为三氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）。
具体的，步骤S6为加入NH4OH，再分两次加入1.5 mL 10 mM的TEOS/EtOH溶液。
优选地，是通过冰水浴控制滴加硅酸四乙脂/乙醇溶液时反应温度不高于20℃。
本发明制备得到的纳米探针同时兼具增强拉曼光谱与增强荧光的双重优势，从而可实现多变量分析以及快速成像等，可广泛应用于生物医学检测中。因此，上述表面增强拉曼-荧光双模纳米探针在生物传感和/或细胞成像方面的应用亦在本发明保护范围内。
本发明采用了共轭聚合物纳米颗粒作为荧光信号来源，既提高了光化学稳定性又降低了生物毒性，通过严格控制金属纳米颗粒外的第一层二氧化硅层厚度，使其既能有效阻隔荧光分子与金属的直接接触而防止荧光猝灭，又使其保持在表面等离激元的增强作用区域内从而达到荧光增强效果。此外，本发明中充当荧光分子的CPNs首先通过表面修饰固定到SERS活性粒子表面，形成荧光分子层再生长第二层SiO2外壳，可有效防止在生物检测应用过程中CPNs的逸出造成干扰。此探针同时兼具增强拉曼光谱与增强荧光的双重优势，从而可实现多变量分析以及快速成像等，可广泛应用于生物医学检测中。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明的SERS-MEF双模探针同时融合了增强拉曼光谱与金属增强荧光技术的双重优势，即可实现多变量多通道分析，也可以实现快速成像，比以往的生物探针具有更好的灵敏性。
（2）本发明制备的SERS-MEF双模探针以共轭聚合物纳米粒子作为荧光信号来源，与以往的有机小分子相比具有更好的光化学稳定性，与无机量子点相比又具有更低的生物毒性，这非常有利于其在生物检测中的应用。
（3）本发明的SERS-MEF双模探针，制备初始过程中严格控制合成温度不高于20℃，控制TEOS/EtOH溶液的滴加速度与用量，从而控制第一层SiO2壳层生长速率与厚度，实现对荧光分子与贵金属核之间距离的调控，最终实现对光学性质的调控。
（4）本发明的SERS-MEF双模探针，制备过程中作为荧光分子的CPNs经过表面修饰固定在SERS活性粒子表面再包覆生长第二层SiO2外壳，可保证每个CPN与金属核的距离基本一致，有利于对其光学性质的调控，与以往的双模探针相比，还可有效防止在后续生物检测应用中荧光物质逸出导致的干扰问题。
附图说明
图1是本发明制备的SERS活性粒子和SERS-MEF双模探针的透射电镜图；a为SERS活性粒子；b为SERS-MEF双模探针的TEM照片。
图2为本发明实施例2制备的SERS-MEF双模探针的拉曼光谱图；主要特征峰为1078cm-1和1588 cm-1。
图3为本发明实施例2制备的SERS-MEF双模探针的荧光激发光谱（Ex）和发射光谱（Em）；激发峰位置为340 nm和488 nm，而主要发射峰位置为589 nm和637 nm。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
1、制备方法
（1）0.128 mL 浓度为0.97g/mL的HAuCl4水溶液加入到49 mL煮沸的蒸馏水中，继续煮沸3 min后加入0.250 mL浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，制得直径尺寸约35 nm的金纳米颗粒；
（2）取步骤（1）所制备的金纳米颗粒分散液3 mL以蒸馏水稀释到5 mL，加入20 µL 10mM的4-MBA/乙醇溶液，超声或搅拌30 min，使得4-MBA与金纳米颗粒充分反应；
（3）将步骤（2）处理的混合液转移入装有200 mL无水乙醇的圆底烧瓶中，搅拌，以冰水浴控温使T≤20 ℃，持续搅拌5 min；
（4）往步骤（3）中反应液加入7.5 mL氨水（28%），持续搅拌5 min；
（5）继续以冰水浴控温使T≤20 ℃，往步骤（4）的反应液中缓慢滴加1 mL 10 mM的TEOS/EtOH溶液，搅拌反应40min后再次滴加0.5 mL 10 mM的TEOS/EtOH溶液，继续冰水浴控温反应2 h，升温至28 ℃继续反应18 h，离心并清洗获得壳层厚度为~8 nm的SERS活性粒子，重新分散于6 mL无水乙醇中备用；
（6）0.01 mg/mL的BDMO-PPV/THF溶液，超声条件下按体积比1：4注射入蒸馏水中，制备BDMO-PPV CPNs，真空容器中静置让残余四氢呋喃挥发完全后备用；
（7）分别往3 mL步骤（5）所得SERS活性粒子和1 mL步骤（6）的CPNs分散液中加入5µL10-4 M的APTES/乙醇溶液，超声20分钟后将两者混合转移到装有100 mL无水乙醇的圆底烧瓶中，继续超声30 min，使得CPNs吸附固定在SERS活性粒子表面；
（8）以冰水浴控温使T≤20 ℃，往步骤（7）所得混合液中加入NH4OH，再分两次加入1.5mL 10 mM阿的TEOS/EtOH溶液，以Stöber方法包覆第二层二氧化硅，离心并清洗，获得总尺寸大小约为75 nm的SERS-MEF双模探针。
2、性能测试
本发明实施例制备得到的双模纳米探针具有非常明显的拉曼信号与荧光信号。拉曼光谱中主要特征峰为1077 cm-1和1588 cm-1，分别归属为4-MBA中υ12和υ8a芳香环振动。同时该双模纳米探针主要激发谱峰为340 nm、489 nm，而荧光发射峰位置在588 nm和639 nm，与纯BDMO-PPV CPNs的荧光性质基本一致。
实施例 2
1、制备方法
（1）0.128 mL 浓度为0.97g/mL的HAuCl4水溶液加入到49 mL煮沸的蒸馏水中，继续煮沸3 min后加入0.250 mL浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，制得直径尺寸约35 nm的金纳米颗粒；
（2）取步骤（1）所制备的金纳米颗粒分散液 3 mL以蒸馏水稀释到5 mL，加入20 µL 10mM的4-MBA/乙醇溶液，超声或搅拌30 min，使得4-MBA与金纳米颗粒充分反应；
（3）将步骤（2）处理的混合液转移入装有200 mL无水乙醇的圆底烧瓶中，搅拌，以冰水浴控温使T≤20 ℃，持续搅拌5 min；
（4）往步骤（3）中反应液加入7.5 mL氨水（28%），持续搅拌5 min；
（5）继续以冰水浴控温使T≤20 ℃，往步骤（4）的反应液中缓慢滴加1 mL 10 mM的TEOS/EtOH溶液，搅拌反应40min后再次滴加1 mL 10 mM的TEOS/EtOH溶液，继续冰水浴控温反应2 h，升温至28 ℃继续反应18 h，离心并清洗获得壳层厚度为~12 nm的SERS活性粒子（如图1a所示），重新分散于6 mL无水乙醇中备用；
（6）0.01 mg/mL的BDMO-PPV/THF溶液，超声条件下按体积比1：4注射入蒸馏水中，制备BDMO-PPV CPNs，真空容器中静置让残余四氢呋喃挥发完全后备用；
（7）分别往3 mL步骤（5）所得SERS活性粒子和1 mL步骤（6）的CPNs分散液中加入5µL10-4 M的APTES/乙醇溶液，超声20分钟后将两者混合转移到装有100 mL无水乙醇的圆底烧瓶中，继续超声30 min，使得CPNs吸附固定在SERS活性粒子表面；
（8）以冰水浴控温使T≤20 ℃，往步骤（7）所得混合液中加入NH4OH，再分两次加入1.5mL 10 mM的TEOS/EtOH溶液，以Stöber方法包覆第二层二氧化硅，离心并清洗，获得总尺寸大小约为100 nm的SERS-MEF双模探针（如图1b所示）。
2、性能测试
本发明实施例制备得到的双模纳米探针具有非常明显的拉曼信号与荧光信号。拉曼光谱中主要特征峰为1078 cm-1和1588 cm-1，分别归属为4-MBA中υ12和υ8a芳香环振动，如图2所示。同时该双模纳米探针主要激发谱峰为340 nm、488 nm，而荧光发射峰位置在589 nm和637 nm，与纯BDMO-PPV CPNs的荧光性质基本一致，如图3所示。
实施例3
1、制备方法
（1）0.128 mL 浓度为0.97g/mL的HAuCl4水溶液加入到49 mL煮沸的蒸馏水中，继续煮沸3 min后加入0.250 mL浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，制得直径尺寸约35 nm的金纳米颗粒；
（2）取步骤（1）所制备的金纳米颗粒分散液 3 mL以蒸馏水稀释到5 mL，加入20 µL 10mM的4-MBA/乙醇溶液，超声或搅拌30 min，使得4-MBA与金纳米颗粒充分反应；
（3）将步骤（2）处理的混合液转移入装有200 mL无水乙醇的圆底烧瓶中，搅拌，以冰水浴控温使T≤20 ℃，持续搅拌5 min；
（4）往步骤（3）中反应液加入7.5 mL氨水（28%），持续搅拌5 min；
（5）继续以冰水浴控温使T≤20 ℃，往步骤（4）的反应液中缓慢滴加1 mL 10 mM的TEOS/EtOH溶液，随后搅拌反应40 min后再次滴加1 mL 10 mM的TEOS/EtOH溶液，共计加入TEOS/EtOH溶液总体积为3 mL，继续冰水浴控温反应2 h，升温至28 ℃继续反应18 h，离心并清洗获得壳层厚度为~16 nm 的SERS活性粒子，重新分散于6 mL无水乙醇中备用；
（6）0.01 mg/mL的BDMO-PPV/THF溶液，超声条件下按体积比1：4注射入蒸馏水中，制备BDMO-PPV CPNs，真空容器中静置让残余四氢呋喃挥发完全后备用；
（7）分别往3 mL步骤（5）所得SERS活性粒子和1 mL步骤（6）的CPNs分散液中加入5µL10-4 M的APTES/乙醇溶液，超声20分钟后将两者混合转移到装有100 mL无水乙醇的圆底烧瓶中，继续超声30 min，使得CPNs吸附固定在SERS活性粒子表面；
（8）以冰水浴控温使T≤20 ℃，往步骤（7）所得混合液中加入NH4OH，再分两次加入1.5mL 10 mM的TEOS/EtOH溶液，以Stöber方法包覆第二层二氧化硅，离心并清洗，获得总尺寸大小约为105 nm的SERS-MEF双模探针。
2、性能测试
本发明实施例制备得到的双模纳米探针具有非常明显的拉曼信号与荧光信号。拉曼光谱中主要特征峰位于1078 cm-1和1590 cm-1，分别归属为4-MBA中υ12和υ8a芳香环振动。同时该双模纳米探针主要激发谱峰为340 nm、484 nm，而荧光发射峰位置在589 nm和637 nm，与纯BDMO-PPV CPNs的荧光性质基本一致。
以上所述为本发明的较佳实施例，但并不以此限定本发明的保护范围，对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于共轭聚合物的表面增强拉曼-荧光双模纳米探针，其特征在于，所述探针为四层核壳结构，由内至外分别为连接有拉曼信号分子的贵金属纳米颗粒内核，包裹内核的第一修饰层，覆盖第一修饰层的共轭聚合物荧光分子层，以及包裹共轭聚合物荧光分子层的第二修饰层；所述第一修饰层的厚度为5～20 nm。
2.根据权利要求1所述的双模纳米探针，其特征在于，所述贵金属纳米颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒。
3.根据权利要求1所述的双模纳米探针，其特征在于，所述修饰层为二氧化硅。
4.根据权利要求1所述的双模纳米探针，其特征在于，所述共轭聚合物为MEH-PPV或BDMO-PPV。
5.权利要求1～4任一项所述的双模纳米探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.柠檬酸钠还原法制备贵金属纳米颗粒水分散液；
S2.将拉曼信号分子溶液加入到S1的贵金属纳米颗粒水分散液中，超声或搅拌得到混合液；
S3.控制反应温度不高于20℃，将S2的混合液转移到无水乙醇中，搅拌混匀后再加入氨水，继续搅拌混匀，再滴加硅酸四乙脂/乙醇溶液，搅拌反应2～3h；再升温至28℃，继续反应18～20h，离心并清洗，获得SERS活性粒子；
S4.配制共轭聚合物四氢呋喃溶液，超声条件注射入蒸馏水中，制备共轭聚合物纳米颗粒（CPNs）；
S5.分别用硅烷偶联剂对S3的SERS活性粒子和S4的CPNs进行表面修饰，超声均匀使其表面带上活性官能团后将两者混合，继续超声均匀使CPNs吸附到SERS活性粒子表面；
S6.控制反应温度不高于20℃，往S5的混合溶液中依次加入NH4OH和TEOS/EtOH溶液，以Stöber方法包覆第二层二氧化硅，离心并清洗，获得SERS-MEF双模探针。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述混合液、无水乙醇、氨水以及硅酸四乙脂/乙醇溶液的体积比为5：200：7.5：1～3。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述超声或搅拌的时间为25～35min。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S3所述搅拌混匀时间均为3～5min。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤S5所述硅烷偶联剂为三氨丙基三乙氧基硅烷。
10.权利要求1～4任一项所述的表面增强拉曼-荧光双模纳米探针在生物传感和/或细胞成像方面的应用。
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