CN115932248B

CN115932248B - 基于聚集诱导发光材料的单分子免疫检测方法

Info

Publication number: CN115932248B
Application number: CN202211585139.8A
Authority: CN
Inventors: 袁爱梦; 安源
Original assignee: Suzhou Yuce Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Yuce Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-10
Filing date: 2022-12-10
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2042-12-10
Also published as: CN115932248A

Abstract

本发明涉及一种基于聚集诱导发光材料的单分子免疫检测方法以及包含原位信号增强粒子和磁珠的试剂盒，可用于蛋白质等的单分子级别的定量检测。本申请的检测方法通过普通荧光显微镜即可实现，成本低，并且检测灵敏度高，检测效率高，检测动态范围宽。

Description

基于聚集诱导发光材料的单分子免疫检测方法

技术领域

本发明属于单分子免疫检测领域，具体涉及基于聚集诱导发光材料的单分子免疫检测方法及相关试剂盒、应用。

背景技术

单分子检测(SMD)是以单个分子的分析为基础构建的一种方法，到目前为止，它已经在生命科学的研究中备受关注。近几年来，该方法被应用于细胞成像、蛋白质相互作用的研究以及蛋白质的定量检测中。在上述提及的应用中，定量检测是以对目标物分子的一个接一个的计数来实现的，这种定量检测手段代表了检测的最终极限。传统的平均测定方法如免疫层析、化学发光、酶联免疫等是以信号强度和目标物浓度之间的关系来定量的。信号强度越高，被测定目标物的浓度越高。与平均测定方法所不同的是，在SMD定量方法中，对可以产生信号的分子进行计数，更具有可视性和数字性，保证了较高的重现性。由于SMD定量检测方法具有平均测定所无法比拟的优点，目前，已经有工作将SMD应用到定量分析之中(参见专利文献1～3)。

自2001年唐本忠院士发现聚集诱导发光材料以来，该类材料由于克服了聚集淬灭效应而获得了广泛关注。在生物检测领域，该材料正在被尝试用于免疫层析分析中(参见专利文献4～7)，但也基本仅局限于在该免疫层析分析中，其仍然关注的是检测该材料的荧光强度，这是由于聚集诱导发光材料最大的特点是避免聚集淬灭而提高了荧光强度。另外，还报道了包含聚集诱导发光材料和免疫磁珠的试剂盒(参见专利文献8)，但该试剂盒也是用于基于荧光强度的荧光免疫检测中。目前，尚未有聚集诱导发光材料用于基于计数的单分子免疫检测中的报道。

具体而言，专利文献1为本申请发明人的在先申请，涉及利用具有特定粒径的原位信号增强纳米粒子对待测分子进行标记，使得单分子信号能够被光学成像设备捕获和识别，实现待测分子的超高灵敏度定量检测。其说明书中，对于原位信号增强纳米粒子，提及了包含有发光材料和纳米粒子载体这两部分，对于发光材料，提及了荧光染料分子、稀土元素、稀土螯合物、荧光蛋白、量子点、上转换纳米粒子等，并教导优选为荧光素类(如异硫氰酸荧光素)、罗丹明类(如罗丹明绿、罗丹明B等)、香豆素类、量子点类(CdS、CdSe、CdTe、ZnSe)、稀土元素(如Eu、Ce)及其配合物等，未提及聚集诱导发光材料，另外，该文献关注的是原位信号增强纳米粒子的粒径。

专利文献2为深圳光与生物科技有限公司提出的申请，其涉及一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法，具体而言，将被检测样品稀释后滴加到玻璃片或硅片这样的检测基板上，被检测物与生物活性分子B结合，完成后冲洗检测基板，然后滴加用稀释的免疫荧光探针，使生物活性分子A与已经和生物活性分子B结合的被检测物结合，完成后冲洗检测基板；将处理后的检测基板置于荧光显微镜下，对免疫荧光探针数目进行计数。该文献通过用高浓度稀土掺杂在上转换纳米材料颗粒中，使上转换纳米材料颗粒具有较大的反斯托克斯位移，相比传统使用的有机染料而言，激发光源和发射波段无重叠，且可有效抑制自发荧光背景噪声，能够显著提高检测信号的信噪比。其使用玻璃片或硅片作为载体，且关注的是高浓度稀土掺杂上转换纳米发光材料，不涉及聚集诱导发光材料。

专利文献3为彩科(苏州)生物科技有限公司提出的申请，其涉及一种多重免疫分子检测方法，包括如下步骤：获得表面连接有捕获分子的编码微球；通过所述捕获分子捕获目标免疫分子并加入酶标试剂，在所述编码微球表面形成酶标记的免疫夹心复合物；将表面修饰有免疫夹心复合物的编码微球驱动到微孔板的微孔中并密封；预定时间后通过光激发所述微孔板进行检测所述微孔板。其原理与美国 Quanterix公司的数字PCR技术类似，基于精密微孔板的微孔来实现对单个分子的分离及检测，同样未提及聚集诱导发光材料。

专利文献4为上海市皮肤病医院提出的申请，涉及一种多模式聚集诱导荧光免疫层析试纸及其制备方法，所述免疫层析试纸的偶联垫上涂覆有聚集诱导荧光颗粒-抗体复合物，所述聚集诱导荧光颗粒包含兼具颜色和荧光特性的聚集诱导荧光材料和聚合物。如其说明书 0002段所记载的，免疫层析试纸因具有简便、快速、成本低等优势，为目前现场快速检测分析的主要技术手段，其基本原理是以硝酸纤维素膜作为层析反应膜，样本中的待测分析物与膜上检测区域固定的抗原或抗体发生特异性的免疫反应，分析检测区域免疫标记物的信号强度，实现对待测分析物的检测。也即，基于标记物的荧光强度来实现对待测分析物的检测。其未提及基于计数的单分子免疫检测。

专利文献5为南方科技大学提出的申请，涉及一种荧光纳米颗粒、蛋白复合物和免疫检测试纸条，具体涉及包含AIE配体和配位金属离子的荧光纳米颗粒以及包含该荧光纳米颗粒的免疫检测试纸条，要解决的是现有的荧光免疫检测试纸条中存在的抗体标记步骤繁琐、效率低、成本高的问题，提供一种基于新的蛋白复合物构建的免疫检测试纸条，其未提及基于计数的单分子免疫检测。

专利文献6为中国香港科技大学提出的申请，涉及一种链霉亲和素修饰的聚集诱导发光聚合物微球及其在免疫层析试纸条中的应用，具体而言，试纸条包括底板，样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫端部与吸水垫端部之间外露的硝酸纤维素膜上包被有与底板端面平行的检测线，检测线包被抗链霉亲和素抗体，在样品垫滴入自制的链霉亲和素修饰AIE荧光微球，使用干式荧光免疫仪检测发光强度值。该文献也未提及基于计数的单分子免疫检测。

专利文献7为南昌大学提出的申请，涉及一种基于N-羟乙基-1，8- 萘二甲酰亚胺四苯乙烯衍生物的聚集诱导发光微球及其应用，具体而言，聚集诱导发光微球以N-羟乙基-1，8-萘二甲酰亚胺四苯乙烯衍生物为AIE分子并通过溶胀法制备，随后用于制备定量检测氨基末端B 脑钠肽免疫层析试纸条。该文献也未提及基于计数的单分子免疫检测。

专利文献8为广州源起健康科技有限公司提出的申请，涉及一种使用聚集诱导发光联合免疫磁珠的检测方法及其试剂盒，总体技术路线是：采用聚集诱导发微球标记待测蛋白的一抗抗体，与预先包被好二抗的免疫磁珠及待测抗原发生免疫反应，形成连接有聚集诱导发光分子的双抗体夹心复合物，进行磁珠聚集，所述复合物经相应波长的激发光激发，发射出一定波长的发射光，通过酶标仪或其他检测分析仪识别，并根据发光信号强度与待测物浓度的比例关系，将待测物浓度与发光信号值拟合出剂量-反应曲线，即可按此发光信号值得到未知样本中待测物的浓度，达到定量分析(参见该文献的说明书0011 段)。也即，同样是测定荧光强度，与以往的免疫层析、化学发光等的原理类似，未提及基于计数的单分子免疫检测。

现有技术文献

专利文献1：CN111771126A；

专利文献2：CN111735964A；

专利文献3：CN111060683A；

专利文献4：CN114778819A；

专利文献5：CN114354915A；

专利文献6：CN113956490A；

专利文献7：CN114774106A；

专利文献8：CN112362867A

发明内容

发明所要解决的课题

专利文献1开创性地提出了基于粒径的单分子免疫检测策略，使用的发光材料为荧光素、量子点、荧光蛋白，获得了较高的检测灵敏度，但仍存在进一步提高的余地，另外，为了应对临床需要，在检测效率和检测动态范围方面也要求进一步的改善。

聚集诱导发光材料因其溶液态不发光而聚集后荧光增强的独特性质，近来年被尝试应用于多种领域，但仅就聚集态(固态)的荧光量子产率而言，其并不优于荧光素、量子点，基本是劣于已商业化的荧光素等，这一性质限制了其在商业上的利用。

鉴于上述现有技术的状况，本申请的目的在于提供一种兼具优异的检测灵敏度、较宽的检测动态范围和较高的检测效率的单分子免疫检测方法。

用于解决课题的手段

申请人最初将聚集诱导发光材料如四苯基乙烯应用于以计数为特征的单分子免疫检测时，考虑到聚集诱导发光材料越聚集越发光的性质，尝试以专利文献1那样将发光材料整体包覆在纳米粒子载体中的方式制造原位信号增强粒子(聚集发光材料聚集在一起)，发现检测下限高于使用常用的荧光素、量子点的情况，也即，检测灵敏度未达到足够理想的程度。申请人又尝试制备多孔结构的包含聚集诱导发光材料和多孔载体的原位信号增强粒子，并将其用于单分子免疫检测中，结果惊讶地发现检测灵敏度明显提高，检测动态范围也宽，而且能够以更短的孵育时间(检测效率)实现检测。也即，与一般认识不同地，本申请发明人意外地发现通过聚集诱导发光材料与多孔结构这两个手段的组合使用，在单分子免疫检测中获得了优异的效果。需要说明，虽然专利文献1在说明书部分泛泛提及了多孔载体，但完全没有意识到将聚集诱导发光材料和多孔载体制备成多孔原位信号增强材料，更未意识到由此带来的优异效果。

本申请的一个技术方案如下。

一种基于聚集诱导发光材料的单分子免疫检测方法，其包括以下步骤：

(1)将能够与靶标分子结合的捕获抗体固定到磁珠上，使捕获抗体与靶标分子的第一位点结合，将样品中的靶标分子捕获；

(2)加入能够与靶标分子的第二位点结合的检测抗体，使检测抗体与靶标分子的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先将检测抗体与原位信号增强粒子结合而形成复合物，再将该复合物加入；

其中，所述原位信号增强粒子为多孔结构，含有聚集诱导发光材料和多孔载体；

(3)用光学成像设备将所述原位信号增强粒子发出的发光信号成像；

(4)对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中靶标分子的浓度。

本申请的技术方案中，不使用微流控芯片，也不使用全内反射显微镜、近场显微镜和艾里斑聚焦检测设备，也不使用体积为纳升级别、皮升级别或飞升级别的微反应腔，检测成本较低。

另一个技术方案如下。

一种基于聚集诱导发光材料的单分子免疫检测方法，其包括如下步骤：

(1)使检测抗体与样品中的靶标分子的第二位点结合，然后加入原位信号增强粒子，所述原位信号增强粒子能够直接或间接与检测抗体结合；或者先使原位信号增强粒子与检测抗体结合而形成复合材料，再将该复合材料加入样品中，使该复合材料与样品中的靶标分子的第二位点结合；

(2)将能够与靶标分子结合的捕获抗体固定至磁珠上，然后，使所述捕获抗体与所述靶标分子的第一位点结合，从而将靶标分子捕获；

优选地，上述两个技术方案中，上述原位信号增强粒子的比表面积为50～600cm²/g，优选为100～400cm²/g，更优选为200～300cm²/g。本申请的发明人发现原位信号增强粒子的比表面积在上述范围内时能够获得较优异的检测灵敏度和动态范围。

优选地，在上述原位信号增强粒子中，上述聚集诱导发光材料进入多孔载体的孔隙内，上述多孔载体为多孔二氧化硅、多孔聚苯乙烯、多孔聚丙烯酸酯或多孔聚丙烯酰胺。

优选地，上述聚集诱导发光材料选自可被取代的1，1，2，3，4，5-六苯基噻咯、可被取代的四苯基乙烯、可被取代的9，1-二苯基乙烯基蒽、可被取代的三苯胺、氰基取代的二芳基乙烯衍生物中的一种或多种。

优选地，上述取代四苯基乙烯为四个苯基的4号位均被C1～C6 烷氧基取代的四苯基乙烯，尤其优选被C2～C4烷氧基取代。

优选地，上述靶标分子为蛋白质、多糖或有生物活性的小分子。

优选地，所述靶标分子为p-Tau181蛋白、p-Tau217蛋白、Aβ40 蛋白、或Aβ42蛋白。

本申请还涉及包含原位信号增强粒子和磁珠的试剂盒，上述原位信号增强粒子为多孔结构，含有聚集诱导发光材料和多孔载体。其中，原位信号增强粒子的比表面积可以为50～600cm²/g，优选为 100～400cm²/g，更优选为200～300cm²/g。

比表面积是指单位质量物料所具有的总面积，单位是m²/g或 cm²/g。对于多孔材料而言，通常利用气体吸附的方法来确定材料的比表面积。根据采用的模型假设不同，可以用来计算材料的比表面积的方法主要有：Langmuir法、BET法、B点法、经验作图法、BJH法、 DR法和NLDFT法等。其中，Langmuir法和BET法是主要的方法，本申请中采用BET法来测定原位信号增强粒子的比表面积，故本申请中所述的比表面积也可以称为BET比表面积。

本申请的效果

根据本发明，能够提供一种兼具优异的检测灵敏度、较宽的检测动态范围和较高的检测效率的单分子免疫检测方法。

附图说明

图1示出包含4-C3O-TPE和多孔聚苯乙烯载体的多孔原位信号增强粒子的扫描电子显微镜(SEM)图像。

图2示出包含4-C3O-TPE和多孔二氧化硅载体的多孔原位信号增强粒子的扫描电子显微镜图像。

图3示出实施例1中得到的标准曲线(纵坐标即CPN(copy number)为单分子信号数)。

图4示出实施例17中得到的标准曲线。

具体实施方式

<第一实施方式>

本申请的第一实施方式为基于聚集诱导发光材料的单分子免疫检测方法，其包括以下步骤：

聚集诱导发光(aggregation-induced emission，AIE)是指在溶液中不发光或者发光微弱的分子聚集后发光逐渐增强的现象，聚集诱导发光材料即为能够产生这一现象的发光材料。近些年来，已被关注的 AIE材料主要有以下的化学结构式所示的几类。

其中，X选自由O、S、Se和Te组成的组中，优选为O或S。

其中，各R、R’、R”、R”’和R””独立地选自由H、F、Cl、Br、 C1～C6烷基、C2～C6烯基、C3～C6环烷基、C6～C12芳基、羟基、羧基、氨基、磺酸基、C1～C6烷硫基、和C1～C6烷氧基组成的组中。

其中，n为0～3的整数，优选为0或1。

具体而言，所述AIE材料可以为可被取代的1，1，2，3，4，5-六苯基噻咯、可被取代的四苯基乙烯、可被取代的9，10-二苯基乙烯基蒽、可被取代的三苯胺、氰基取代的二芳基乙烯衍生物中的一种或多种。更优选地，上述取代四苯基乙烯为四个苯基的4号位均被C1-C6烷氧基取代的四苯基乙烯，尤其优选被C2～C4烷氧基取代。

本申请中，磁珠用于检测样品与试剂的分离和清洗。所述捕获抗体通过物理吸附或化学修饰的方式固定在磁珠表面，并且能够与靶标分子(以下，有时也称为待测分子)的一个结合位点相结合，使其从样品中分离。

所述检测抗体能够与待测分子的另一个结合位点结合。所述的原位信号增强粒子直接与检测抗体结合，是指检测抗体通过物理吸附或化学修饰的方法，直接吸附或偶联在原位信号增强粒子上，实现原位信号增强粒子对待测分子识别和标记的功能化修饰。所述的″原位信号增强粒子间接与检测抗体结合″是指通过抗检测抗体(即二抗)或生物素-链霉亲和素体系进行结合，将原位信号增强粒子特异性标记在检测抗体上。

所述靶标分子包括蛋白质、多糖或有生物活性的小分子及小分子与蛋白质的复合物。具体而言，可举出cTnI抗原、IL-6抗原、PCT (降钙素原)抗原、Sema4D(信号素4D)抗原、Nt-proBNP(脑自然肽氨基端前体蛋白)抗原、肿瘤标志物、维生素D、维生素B、叶酸、维生素D-BSA复合物、叶酸-BSA复合物、p-Tau181蛋白、p-Tau217 蛋白、Aβ40蛋白、Aβ42蛋白、细菌及病毒等。

上述磁珠的表面修饰有能够与抗体进行共价偶联的活性官能团，例如羟基、羧基、氨基、琥珀酰亚胺酯基、磺酰基(如甲苯磺酰基) 及它们的衍生基团中的一种或多种。

上述捕获抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种。上述捕获抗体按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体、羊驼源抗体中的一种或多种。具体而言，可举出Hytest 19C7、Hytest 20C6、Hytest 16A11、Medix2703、Meridian M86101M、Biospacific A45160以及Biospacific G-131-C等。

所述检测抗体按照抗体特异性特性分类，可以为多克隆抗体和单克隆抗体中的一种或两种。所述检测抗体按照来源分类，可以为鼠源抗体、兔源抗体、羊源抗体以及羊驼源抗体中的一种或多种。具体而言，可举出Hytest 16A 11、Medix 2704、Meridian M8620 1M以及 Biospacific A45502等。

上述抗检测抗体按照检测抗体来源分类，可以为抗鼠抗体、抗兔抗体、抗羊抗体、抗羊驼抗体中的一种或多种。所述抗检测抗体按照来源分类，可以为鼠源二抗、兔源二抗、羊源二抗以及羊驼源二抗中的一种或多种。

所述原位信号增强粒子是指在原位(in-situ)将发光信号增强至能够被常规光学成像设备(如荧光显微镜)检测到的水平的材料，其必须含有聚集诱导发光材料和多孔载体这两部分，且需为多孔结构。

所述原位信号增强粒子中，多孔载体发挥非常重要的作用，例如，可以结合更多的发光材料，使得发光信号更强；为官能化修饰提供位点，能够结合大量抗体，提高反应活性。所述多孔载体按照材料分类，可以为二氧化硅、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚(甲基)丙烯酸甲酯、及无机金属化合物中的一种或多种。其中，从使发光材料均匀分布、提高检测灵敏度的观点考虑，多孔载体优选为多孔二氧化硅、多孔聚丙烯酰胺、多孔聚苯乙烯，尤其优选多孔二氧化硅和多孔聚苯乙烯。

多孔载体可以按照本领域已知的制备方法制造，例如，关于多孔聚苯乙烯，例如可以按照下述步骤制备：步骤1，将聚苯乙烯种子微球溶液超声分散于十二烷基硫酸钠溶液中得到第一混合液，将环己烷超声分散于十二烷基硫酸钠溶液中得到第二混合液，将第二混合液逐滴滴加到第一混合液中，并搅拌、溶胀而得到第一溶胀液；步骤2，将过氧化二苯甲酰、甲苯和苯乙烯混合得到第二溶胀液；步骤3，将第二溶胀液加入到第一溶胀液中，所得混合液分散于十二烷基硫酸钠水溶液中于室温条件下溶胀而得到混合反应体系，向所述混合反应体系中加入表面活性剂和阻聚剂，升温进行聚合反应即得。关于多孔二氧化硅，例如可以按照下述方法制备：将模板结构与经辐照后制得的全硫化硅橡胶乳液混合，喷雾干燥、烧灼后制备多孔二氧化硅微球。关于多孔聚丙烯酰胺，例如可按照以下步骤制备：步骤(1)，将丙烯酰胺放入反应釜中，然后用氢氧化钠调节pH值至7，再加入致孔剂、亚硫酸氢钠、过硫酸铵、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、去离子水，充分搅拌后得到混合溶液；将混合溶液置于去离子水中充氮后密封，得到混合反应物；步骤(2)，将上述步骤(1)得到的混合反应物置于恒温水浴中反应，得到透明凝胶状聚合物；透明凝胶状聚合物经过洗涤，过滤得到最终产物。

本申请中，原位信号增强粒子优选为聚集诱导发光材料进入多孔聚苯乙烯的孔隙而成的荧光粒子、聚集诱导发光材料进入多孔二氧化硅的孔隙而成的荧光粒子、聚集诱导发光材料进入多孔聚丙烯酰胺的孔隙而成的荧光粒子等。该原位信号增强粒子的制备方法可以是：将多孔载体如多孔聚苯乙烯微球分散于溶剂(如氯仿与异丙醇的混合溶液)中，并加入聚集诱导发光材料的溶液。

需要说明的是，上文所述的具体聚集诱导发光材料与多孔载体可以进行各种组合。

本申请中，所述原位信号增强粒子的表面修饰有能够与抗体共价偶联的活性官能团，包括羟基、羧基、氨基、巯基、烯基、炔基、琥珀酰亚胺酯基团及其衍生基团中的一种或多种。

本申请中，所述原位信号增强粒子的表面可以修饰有一定长度的连接臂，所述连接臂包括多碳直链、多碳支链、聚合物链、肽链、蛋白质。所述连接臂的长度优选为1～100nm，进一步优选为2～20nm，最优选为5～10nm。

本申请的步骤(1)中，样品与捕获抗体的孵育温度为10～50℃，优选为20～40℃，尤其优选为37℃，孵育时间为1min～60min，优选为3min～30min，尤其优选为10min～30min。本申请的步骤(2) 中，检测抗体(或结合有检测抗体的原位信号增强粒子)与样品的孵育温度为10～50℃，优选为20～40℃，尤其优选为37℃，孵育时间为1min～60min，优选为2min～30min，尤其优选为15min～25min。

本申请中，所述光学成像设备主要包括以下部件：激发光源、物镜、滤光片、感光元件、数据采集模块、数据处理模块以及二向色镜 (若为正置显微镜，则也可以没有二向色镜)。其中，所述激发光源是用于将反应后的样品激发出光学信号的光学发射装置。所述物镜用于待测样品的信号采集和放大。所述二向色镜用于激发光路的反射和样品光学信号的采集。所述滤光片用于激发光波段的过滤和样品发射光信号的过滤。所述感光元件用于样品光学信号的采集。所述数据采集模块配置为接收感光元件捕获的光学信号，并转换为数字信号。所述数据处理模块配置为数字信号的转换以及光学图像的形成和处理。

在该设备的一些实施方式中，所述激发光源包括气体激光器、固体激光器、半导体激光器、液体激光器以及自由电子激光器中的一种或几种。在该设备的一些实施方式中，所述物镜按照倍率分类，包括 1X、2X、4X、5X、10X、20X、40X、50X以及100X中的一种或几种；所述物镜按照场曲校正分类，包括平面物镜或曲面物镜。在该设备的一些实施方式中，所述感光元件包CCD(Charge Coupled Device，电荷耦合装置)或CMOS(Complementary Metal-Oxide Semiconductor，互补金属氧化物半导体)中的一种或两种。

本申请通过采用特定的检测体系，从而对光学成像设备的要求低，为常规的光学成像设备(即未突破光学衍射极限的光学成像设备) 即可，无需全内反射荧光显微镜、落射荧光显微镜、扫描近场光学显微镜、共聚焦荧光显微镜等昂贵的、突破了光学衍射极限的成像设备。

本申请中，靶标分子浓度的计算方式有单分子计数模式和荧光强度积分模式这两种。其中，就所述单分子计数模式而言，直接对生成的图像中的由原位信号增强粒子形成的亮斑个数进行分析和统计，通过亮斑个数直接或间接换算为靶标分子在样品中的浓度信息。所谓″直接换算为靶标分子在样品中的浓度信息″，是指绝对定量，也即，无需标准曲线校正即可换算为浓度信息。所谓″间接换算为靶标分子在样品中的浓度信息″，是指通过亮斑个数和标准曲线(或校正参数) 换算为浓度信息。就所述荧光强度积分模式而言，对生成的图像中的由原位信号增强粒子形成的亮斑面积进行统计和积分，通过将积分结果除以特定参数，例如平均每个原位信号粒子所形成的平均亮斑面积或亮斑面积相关变量(例如幂方、开方以及多项式等)，从而换算得到原位信号增强粒子的近似个数，再将该数值换算为靶标分子在样品中的浓度信息。其中，平均亮斑面积是通过在较低浓度下对单个分子的亮斑面积进行统计并取平均值而得到的。从获得更大的检测动态范围的方面考虑，重要的是，在低浓度区间使用单分子计数模式、并在高浓度区间使用荧光强度积分模式，然后将这两种模式下绘制的标准曲线合并，从而绘制完整的标准曲线。需要说明，上述低浓度与高浓度的分界线一般为一个磁珠表面上结合有超过一个的待测分子时的浓度，也可以根据标准曲线拟合结果优选为一个磁珠表面上平均结合有0.5个待测分子时的浓度或2个待测分子时的浓度。

<第二实施方式>

本申请的第二实施方式如下。

第二实施方式与第一实施方式相比，仅在步骤的实施顺序上存在区别，其他条件如原位信号增强粒子、多孔载体、聚集诱导发光材料等均相同。

本申请还涉及包含上述原位信号增强粒子和磁珠的试剂盒，上述原位信号增强粒子为多孔结构，含有上述聚集诱导发光材料和多孔载体。原位信号增强粒子的比表面积可以为50～600cm²/g。优选的聚集诱导发光材料和多孔载体如前文所述。

本申请中具体采用氮气吸附BET法来测定BET比表面积，其中，氮气作为被吸附分子吸附在吸附剂(本申请的情况下为原位信号增强粒子)上并从所述吸附剂上解吸附，从而测量吸附等温线，并且测量的数据按照由式(1)表示的BET式来分析。因此，根据该氮气吸附BET法可以计算比表面积。

具体地，当根据上述氮气吸附BET法计算比表面积的值时，首先氮气作为被吸附分子吸附在吸附剂(原位信号增强粒子)上，并从所述吸附剂上解吸附，从而测量吸附等温线。并且，从所得的吸附等温线，根据式(1)或由式(1)变换成的式(1’)来计算[p/{V_a(p₀-p)}]，并相对于平衡相对压力(p/p₀)作图。此外，由此作出的[p/{V_a(p₀-p)}] 以直线表示，斜率s(＝[(C-1/(C·V_m)])、截距i(＝[1/(C·V_m)]) 按照最小二乘法来计算。并且，V_m和C二者根据式(2-1)和(2-2)、由所得的斜率s和截距i来计算。比表面积a_sBET根据式(3)、由V_m计算。

V_a(V_m·C·p)/[(p₀-p){1+(C-1)(p/p₀)}]...(1)

其中，V_a是吸附量，V_m是单分子层中的吸附量，p是氮气的平衡相中的压力，而p₀是氮气的饱和蒸汽压。

[p/{V_a(p₀-p)}]＝[(C-1)/(C·V_m)](p/p₀)+[1/(C·V_m)].... (1’)

V_m＝1/(s+i)....(2-1)

C＝(s/i)+1....(2-2)

a_sBET＝(V_m·L·σ)/22414....(3)

其中，L是阿伏伽德罗数，而σ是氮气的吸附横截面积。

实施例

以下，举出实施例和比较例进一步详细地说明本申请，但本申请并不限定于此。

1、比表面积测定

用全自动化比表面积分析仪(Micrometritics ASAP 2020M+C)、按照上述氮气吸附BET测定法对原位信号增强粒子进行比表面积测定。

2、单分子成像

使用常规荧光显微镜例如尼康Eclipse Ti-U荧光显微镜进行单分子成像，此外，也可采用尼康Eclipse Ti系列的其他荧光显微镜、莱卡DMi8荧光显微镜等。

3、标准曲线绘制方法

本申请中，联合使用单分子计数模式与荧光强度积分模式，具体实施方法如下：

在待测分子的浓度较低时，磁珠数量多于与磁珠结合的待测分子数量，因此使用单分子计数模式对不同浓度的待测分子样本进行标准曲线绘制；

当待测分子的浓度超过一定阈值时，一个磁珠表面可能结合有1 个以上的待测分子，单分子信号容易叠加，导致检测结果出现偏差，因此更适合使用荧光强度积分模式。

具体而言，当一张成像图片中的单分子数量不超过设定的阈值时，使用单分子计数模式进行标准曲线的绘制；当一张成像图片中的单分子数量超过设定的阈值时，使用荧光强度积分模式，并将总荧光强度面积除以每个分子的平均荧光强度面积，换算为″近似单分子数量″，从而进行标准曲线绘制。

最后，将利用单分子计数模式得到的标准曲线与利用荧光强度积分模式得到的标准曲线合并，并利用拟合公式进行曲线拟合，绘制完整的标准曲线。

4、多孔结构的原位信号增强粒子的制备

(1)以多孔聚苯乙烯为载体的原位信号增强粒子的制备为例，步骤如下。

(A)多孔聚苯乙烯的制备

步骤1：取质量百分比为4.6％的聚苯乙烯种子微球溶液2.4mL超声分散于18mL质量百分比为0.23％的十二烷基硫酸钠水溶液中，得到第一混合液；取100μL丙酮超声乳化分散于23mL质量百分比为 0.21％的十二烷基硫酸钠水溶液中，得到第二混合液，将第二混合液逐滴加入到第一混合液中，并于25℃进行搅拌、溶胀6h得到第一溶胀液；

步骤2：取0.12g过氧化苯甲酰和9g苯乙烯，依次加入4g甲基丙烯酸、11g甲苯，混合均匀后得到第二溶胀液；

步骤3：将第二溶胀液添加到第一溶胀液中，混合后再分散于 75mL质量百分比为0.24％的十二烷基硫酸钠水溶液中，并于25℃条件下继续溶胀；将2.2g聚乙烯吡咯烷酮、400μL质量百分比为1％的次甲基蓝水溶液和80mL超纯水混合后，加入到混合反应体系中，升温至80℃，聚合反应一整夜。

将反应所得产物采用600mL乙醇在超声频率为65w条件下超声 12min进行分散；然后，采用体积百分比为95％的乙醇溶液对上述产物进行离心洗涤；之后，采用体积百分比为15％的乙醇溶液对上述产物重力筛选5次，得到杂质少、尺寸均一的多孔聚苯乙烯微球，且表面修饰有羧基。

(B)原位信号增强粒子的制备

将制备得到的多孔聚苯乙烯微球分散于氯仿与异丙醇的混合溶液中，并加入聚集诱导发光材料的溶液，于适合的温度干燥一整夜后即得。此处的聚集诱导发光材料具体使用了：四个苯基的4号位(相对于与乙烯连接的位点而言，以下相同)均被丙氧基取代的四苯基乙烯(以下简记为4-C3O-TPE)、四个苯基的3号位(即间位)均被丙氧基取代的四苯基乙烯(以下简记为3-C3O-TPE)、四个苯基的4号位均被羧基取代的四苯基乙烯(以下简记为4-COOH-TPE)、四个苯基的4号位均被羟基取代的四苯基乙烯(以下简记为4-OH-TPE)、四个苯基的4号位均被氯取代的四苯基乙烯(以下简记为4-Cl-TPE)、 1，1，2，3，4，5-六苯基噻咯(HPS)、各苯基的4号位被丙氧基取代的1， 1，2，3，4，5-六苯基噻咯(以下简记为4-C3O-HPS)、二苯基乙烯基蒽(以下简记为DSA)、三苯胺(以下简记为TPA)、三个苯基的4号位均被丙氧基取代的三苯胺(以下简记为4-C3O-TPA)、三个苯基的3 号位(即间位)均被丙氧基取代的三苯胺(以下简记为3-C3O-TPA)、三个苯基的4号位均被羧基取代的三苯胺(4-COOH-TPA)。由此也分别得到包含各聚集诱导发光材料和多孔聚苯乙烯载体的多孔原位信号增强粒子，图1示出包含4-C3O-TPE和多孔聚苯乙烯载体的多孔原位信号增强粒子的扫描电子显微镜(SEM)图像，利用BET法测定其表面积，为230cm²/g。另外，通过调节各原料的质量比，还分别制备了表面积在100～600cm²/g范围内的基于多孔聚苯乙烯载体的数种多孔原位信号增强粒子，在此省略详细说明。

(2)以多孔二氧化硅为载体的原位信号增强粒子的制备为例，步骤如下。

将380克超细全硫化硅橡胶乳液与200克全硫化丁腈橡胶乳液 (北京化工研究院，固含量43％)经机械搅拌共混，制得稳定的共混乳液。然后利用喷雾干燥方法，制备100克超细全硫化硅橡胶与全硫化丁腈橡胶微米级复合微球。

称取上文制备的微米级复合微球18克于坩埚中，放于马弗炉内，在空气条件下，于400℃，烧蚀300分钟。得到3.0克多孔二氧化硅微球。

将上述得到的多孔二氧化硅微球与乙酸铵在乙醇中混合进行回流反应，得到氨基修饰的多孔二氧化硅微粒。称取聚集诱导发光材料与氨基修饰的多孔二氧化硅微粒，充分溶解并分散于溶解有三光气的无水甲苯溶液中；惰性气氛吹若干次后，加热至115～125℃，通过分水器除水，随后保持回流10～14小时；最后过滤，收集滤渣，洗涤数次后，真空干燥，即得到一种包含多孔二氧化硅和聚集诱导发光材料的原位信号增强粒子。此处的聚集诱导发光材料具体使用了： 4-C3O-TPE、3-C3O-TPE、4-COOH-TPE、4-OH-TPE、4-Cl-TPE、HPS、 4-C3O-HPS、DSA、TPA、4-C3O-TPA、3-C3O-TPA、4-COOH-TPA。图2示出包含4-C3O-TPE和多孔二氧化硅载体的多孔原位信号增强粒子的扫描电子显微镜图像，利用BET法测定其表面积，为260cm²/g。另外，通过调节各原料的质量比，还分别制备了表面积在80～560cm²/g 范围内的基于多孔二氧化硅载体的数种多孔原位信号增强粒子，在此省略详细说明。

实施例1：用于人血清中cTnI抗原分子的检测(包含多孔二氧化硅和4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子：比表面积为260cm²/g)。

1、实验组分

甲苯磺酰基活化M280磁珠(Thermo)、捕获抗体(Hytest 19C7)、检测抗体(Hytest16A11)、硅烷偶联剂(APTES)、氨水、正硅酸乙酯(TEOS)、前文制备的包含多孔二氧化硅和4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子(比表面积260cm²/g)、丁二酸酐、待测血清样本、 PBS缓冲液、Buffer C(3mM(NH₄)₂SO₄溶于10mM PBS缓冲液， pH＝7.4)、Buffer D(0.01％NaCl，0.5％BSA溶于10mM PBS，pH＝7.4)、 Buffer E(0.0088％NaCl，0.1％BSA溶于10mM PBS，pH＝7.4)、N- 羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、增强粒子保存液、样品稀释液以及PBS洗液。

2.1、磁珠与捕获抗体的共价偶联

(1)取166.6μL的30mg/mL经甲苯磺酰基活化的M280磁珠，使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，移除缓冲液。

(2)取100μg的捕获抗体(Hytest 19C7)，用150μL的10mM PBS 缓冲液稀释后加入到(1)的磁珠中，混合均匀，加入100μL的Buffer C，于37℃旋转混匀，反应45min。

(3)使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，加入1mL的Buffer D 进行封闭反应。于37℃旋转混匀，反应45min。

(4)使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，使用250μL的Buffer E保存，待用。

2.3、检测抗体与原位信号增强粒子的共价偶联

(1)取10μL的保存于增强粒子保存液中的原位信号增强粒子，加入40μL的PBS缓冲液超声1min。

(2)取0.005g的EDC，溶于50μL的PBS缓冲液，另取0.0135g 的NHS溶于150μL的PBS缓冲液。

(3)以12000rpm的速度将原位信号增强粒子离心，去除上清液，加入50μL的PBS缓冲液重悬，超声1min后加入2.5μL的EDC溶液，超声1min后再加入7.5μL的NHS溶液，混匀后于37℃旋转混匀反应 15min，以12000rpm的转速离心15min，去除上清液，使用50μL的 PBS缓冲液将增强粒子重悬。

(4)加入20μg的检测抗体(Hytest 16A11)，于37℃旋转混匀反应2h。

(5)加入25μL的Buffer D，于37℃封闭反应45min后，以 12000rpm离心15min，使用100μL的Buffer E重悬保存。

3、实验方法

标准曲线的制作

(1)使用胎牛血清将cTnI抗原的浓度分别稀释为0、0.01、0.1、 0.5、1、5、10以及100pg/mL。

(2)将标记有捕获抗体的磁珠稀释为1mg/mL，取50μL，分别加入50μL(1)中得到的各浓度的样品，于37℃孵育45min。使用100μL 清洗缓冲液洗三次，洗去残余样品，吸干上清液。

(3)加入10μL结合有检测抗体的原位信号增强粒子，于37℃孵育45min，使用清洗缓冲液洗4次，洗去残余的原位信号增强粒子，去除上清液。

(4)加入5μL检测液将磁珠重悬，转移至检测孔，使用磁铁将磁珠吸引至检测孔的底部，使用荧光显微镜(尼康Eclipse Ti-U)进行单分子成像，联合使用单分子计数模式和荧光强度积分模式来完成后续单分子计数统计和分析。

(5)完成一系列浓度检测，每个浓度点重复6次，根据检测结果绘制标准曲线，计算每个点的CV％值。

4、实验结果

标准曲线的结果如图3所示，可知该实施例中，cTnI的检测范围为2fg/mL～100ng/mL，在该区间内单分子信号数(即CPN)与样品浓度呈良好的线性关系，其检测下限可达2fg/mL，检测灵敏度非常高，检测动态范围也宽，另外，孵育时间也短(可缩短25％)。

参考例1

将原位信号增强粒子替换为专利文献1的实施例1记载的非多孔二氧化硅负载异硫氰酸荧光素粒子而成的微球(异硫氰酸荧光素整体被二氧化硅包裹，非多孔结构)，各孵育时间延长为1h(以便尽可能与专利文献1的实施例1的条件相同)，除此以外，与本申请的上述实施例1同样地操作，cTnI的检测范围为30fg/mL～10ng/mL，在检测灵敏度和检测动态范围方面虽然也优异，但劣于本申请的实施例1。

比较例1

除了将原位信号增强粒子替换为多孔二氧化硅负载异硫氰酸荧光素粒子而成的微球(异硫氰酸荧光素进入孔隙内，多孔结构)外，与本申请的上述实施例1同样地操作，cTnI的检测下限为50pg/mL， cTnI的检测范围为50pg/mL～10ng/mL，明显劣于本申请的实施例1。

比较例2

除了原位信号增强粒子替换为无孔二氧化硅负载4-C3O-TPE而成的微球(4-C3O-TPE整体被二氧化硅包裹，非多孔结构)外，与本申请的上述实施例1同样地操作，cTnI的检测下限为40pg/mL，cTnI 的检测范围为40pg/mL～10ng/mL，均明显劣于本申请的实施例1。

实施例2～5(不同比表面积的实验)

除了将原位信号增强粒子分别替换为比表面积为90cm²/g、200 cm²/g、350cm²/g、560cm²/g的包含多孔二氧化硅和4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子以外，与上述实施例1同样地操作，得到各实施例的检测下限和检测动态范围，示于下述表1中。

表1

实施例6～10(不同比表面积的以多孔聚苯乙烯为载体的实验)

除了将原位信号增强粒子分别替换为比表面积为80cm²/g、230 cm²/g、340cm²/g、400cm²/g、520cm²/g的包含多孔聚苯乙烯和 4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子以外，与实施例1同样地操作，得到各实施例的检测下限和检测动态范围，示于下述表2中。

表2

实施例11～16(不同AIE荧光分子的实验)

除了将原位信号增强粒子替换为分别包含4-COOH-TPE、 4-OH-TPE、4-Cl-TPE、4-C3O-HPS、DSA、4-C3O-TPA的多孔原位信号增强粒子(比表面积均为230cm²/g，载体均为多孔聚苯乙烯)以外，与实施例7同样地操作，得到各实施例的检测下限和检测动态范围，示于下述表3中。

表3

实施例17用于IL-6抗原分子的检测(包含多孔聚苯乙烯和 4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子：比表面积为230cm²/g)

1、实验组分

甲苯磺酰基活化的M280磁珠(Thermo)、IL-6捕获抗体(Medix 2703)、IL-6检测抗体(Medix 2704)、琥珀辛酯磺酸钠、乙醇、待测血清样本、PBS缓冲液、Buffer C(3mM(NH₄)₂SO₄溶于10mM 的PBS缓冲液，pH＝7.4)、Buffer D(0.01％NaCl，0.5％BSA溶于10mM 的PBS，pH＝7.4)、Buffer E(0.0088％NaCl，0.1％BSA溶于10mM PBS， pH＝7.4)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、增强粒子保存液以及样品稀释液以及PBS 洗液

2、制备方法

(1)取10μL的上文中制得的包含多孔聚苯乙烯和4-C3O-TPE 的多孔原位信号增强粒子的悬浮液，用10mM的PBS缓冲液将其稀释至100μL，加入10μL含有0.5％EDC的水溶液和5μL含有0.5％NHS 的水溶液，于37℃活化1小时，使用100kD超滤管去除残余的活化剂，加入100μL的10mM的PBS缓冲液使其重悬，然后加入20μg 的IL-6检测抗体(Medix 2704)，于37℃反应1.5小时。使用150KD 超滤管去除残余的抗体，并使用100μL的10mM PBS缓冲液使其重悬，将超滤和重悬步骤重复一次，将得到的、多孔原位信号增强粒子与检测抗体的复合物于4℃保存备用。

2.2、磁珠与捕获抗体的共价偶联

(1)取166.6μL的30mg/mL的经甲苯磺酰基活化的M280磁珠，使用10mM的PBS缓冲液清洗5次，移除缓冲液。

(2)取100μg捕获抗体(Medix 2703)，使用150μL的10mM PBS缓冲液稀释后加入到(1)的磁珠中，混合均匀，加入100μL的 Buffer C，于37℃旋转混匀，反应45min。

3、实验方法

IL-6抗原检测

(1)使用胎牛血清将IL-6抗原的浓度分别稀释为0、0.01、0.1、 0.5、1、5、10、50以及100pg/mL。

(2)将标记有捕获抗体的磁珠稀释为0.1mg/mL，取50μL，然后分别加入50μL的(1)中得到的各浓度的样品，于37℃孵育30min。使用100μL的清洗缓冲液洗三次，洗去残余样品，吸干上清液。

(3)加入10μL结合有检测抗体的多孔原位信号增强粒子，于 37℃孵育15min，使用清洗缓冲液洗4次，洗去残余的多孔原位信号增强粒子，去除上清液。

(4)加入5μL检测液将磁珠重悬，转移至检测孔，使用磁铁将磁珠吸引至检测孔的底部，使用荧光显微镜(尼康Eclipse Ti-U)进行单分子成像，利用荧光强度积分模式来完成后续单分子计数统计与分析。

(5)完成一系列浓度检测，每个浓度点重复3次，根据检测结果绘制标准曲线，计算每个点的CV％值。

4、实验结果

IL-6抗原的检测结果如图4所示，可知浓度为0.01pg/mL的稀释样本能够有效地与背景区分开，经计算，该实施例的检测下限为 0.004pg/mL(即4fg/mL)。可见本申请的检测方法的灵敏度极为优异。

实施例18～19(针对不同标志物的检测实验)

申请人还使用包含多孔聚苯乙烯和4-C3O-TPE的多孔原位信号增强粒子分别对p-Tau181蛋白、和Aβ40蛋白进行了检测，具体而言，在实施例17中，将捕获抗体和检测抗体分别替换为针对p-Tau181蛋白、和Aβ40蛋白的捕获抗体和检测抗体，利用双抗免疫夹心法，与实施例17类似地进行了实验，将各自的实验结果示于表4中。需要说明，对于这些生物标志物，本领域中的现有市售抗体对的活性有限，无法达到像cTnI或IL-6这样的1fg/mL级别的检测灵敏度，但与现有文献报道的结果相比，由本申请检测方法所带来的接近0.05pg/mL(50fg/mL)级别的检测灵敏度已非常优异，这也证明本申请的检测体系在各项生物标志物上的广泛适用性。另外，还使用多孔二氧化硅负载异硫氰酸荧光素粒子而成的微球作为原位信号增强粒子、无孔二氧化硅负载4-C3O-TPE而成的微球作为原位信号增强粒子，对p-Tau181 蛋白、和Aβ40蛋白进行了检测，发现检测灵敏度只有约100pg/mL，动态范围为100pg/mL～10ng/mL。

表4

	p-Tau181蛋白	Aβ40蛋白
			灵敏度	0.05pg/mL	0.08pg/mL
动态范围	0.05pg/mL～100ng/mL	0.08pg/mL～100ng/mL

Claims

1.一种基于聚集诱导发光材料的单分子免疫检测方法，其包括以下步骤：

（1）将能够与靶标分子结合的捕获抗体固定到磁珠上，使捕获抗体与靶标分子的第一位点结合，将样品中的靶标分子捕获；

（2）加入能够与靶标分子的第二位点结合的检测抗体，使检测抗体与靶标分子的第二位点结合，然后加入能够直接或间接与检测抗体结合的原位信号增强粒子；或者先将检测抗体与原位信号增强粒子结合而形成复合物，再将该复合物加入；

（3）用光学成像设备将所述原位信号增强粒子发出的发光信号成像；

（4）对原位信号增强粒子的个数进行统计，进一步计算得到样品中靶标分子的浓度，

其中，所述聚集诱导发光材料为四个苯基的4号位均被C2~C4烷氧基取代的四苯基乙烯。

2.一种基于聚集诱导发光材料的单分子免疫检测方法，其包括如下步骤：

（1）使检测抗体与样品中的靶标分子的第二位点结合，然后加入原位信号增强粒子，所述原位信号增强粒子能够直接或间接与检测抗体结合；或者先使原位信号增强粒子与检测抗体结合而形成复合材料，再将该复合材料加入样品中，使该复合材料与样品中的靶标分子的第二位点结合；

（2）将能够与靶标分子结合的捕获抗体固定至磁珠上，然后，使所述捕获抗体与所述靶标分子的第一位点结合，从而将靶标分子捕获；

3.如权利要求1或2所述的单分子免疫检测方法，其中，所述原位信号增强粒子的比表面积为50~600cm²/g。

4.如权利要求1或2所述的单分子免疫检测方法，其中，在所述原位信号增强粒子中，所述聚集诱导发光材料进入多孔载体的孔隙内，所述多孔载体为多孔二氧化硅、多孔聚苯乙烯、多孔聚丙烯酸酯或多孔聚丙烯酰胺。

5.如权利要求1或2所述的单分子免疫检测方法，其中，所述靶标分子为蛋白质、多糖或有生物活性的小分子。

6.如权利要求5所述的单分子免疫检测方法，其中，所述靶标分子为p-Tau181蛋白、p-Tau217蛋白、Aβ40蛋白、或Aβ42蛋白。

7.试剂盒，其包含原位信号增强粒子和磁珠，其特征在于，所述原位信号增强粒子为多孔结构，含有聚集诱导发光材料和多孔载体，所述聚集诱导发光材料为四个苯基的4号位均被C2~C4烷氧基取代的四苯基乙烯。

8.权利要求7所述的试剂盒在单分子免疫检测中的应用。