CN105807057B - 一种捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种循环肿瘤细胞的鉴定方法，包括：利用磁性纳米球偶联上特异性识别肿瘤细胞的抗体，两种不同颜色的荧光纳米球分别修饰特异性识别肿瘤细胞和白细胞的抗体，从而得到三种免疫功能纳米球。将上述三种免疫功能纳米球同时加入到待检测的全血体系中，实现了对循环肿瘤细胞的同时捕获和标记，通过简单的磁分选，富集后的细胞直接在荧光显微镜下观察，达到鉴定的目的。鉴定方法操作简单，循环肿瘤细胞损失少；免疫功能纳米球对目标细胞活性几乎没有影响，93%的肿瘤细胞在鉴定后仍保持很好的生物学活性，可以进行体外培养。本发明为临床癌症患者的预后，复发监测和个性化治疗提供了有效方法。

Description

一种捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法
技术领域
本发明属于化学生物学和医学检测领域，具体涉及利用纳米材料对循环肿瘤细胞同时进行捕获和鉴定的方法。
背景技术
近年来癌症逐渐成为主要的公共安全问题，全球每年有近千万人死于癌症。癌症死亡率极高主要原因是癌症容易发生转移，绝大多数的癌症患者最后都是死于癌症的转移。研究表明癌症转移过程中循环肿瘤细胞发挥着至关重要的作用。循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)是从肿瘤原灶位脱落进入外周血的肿瘤细胞，它会随着外周血循环到合适的位置突破血管内壁，转移到其他组织。大量研究表明，CTCs的检测对癌症的预后，复发监测以及化疗药物的快速评估等都有非常重要的临床意义。而且，进一步对捕获到的CTCs或者培养的CTCs细胞系进行分子生物学分析，对了解癌症的转移机制和癌症病人的个性化治疗有指导性的意义。
CTCs在全血中的浓度极低(1mL全血只有几个到几百个CTC)，而且全血组成十分复杂。目前发展了多种富集和捕获CTCs的方法，如密度梯度离心、膜过滤、亲和分离等。其中免疫磁富集的方法由于其操作简便、捕获效率高、方便与其他方法相结合等优势，逐渐成为应用最广泛的CTCs分离方法。尽管通过上述发展的方法，CTCs可以被高效地富集，但血细胞的残留都是不可避免，主要原因是血细胞数量庞大(1mL全血约有109的红细胞和107的白细胞)。因此，灵敏、可靠对富集的细胞进行鉴定，是CTCs检测十分关键的步骤。目前常用的CTCs的鉴定方法分别是分子水平的逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，PT-PCR)和细胞水平的免疫细胞化学(immunocytochemistry，ICC)。RT-PCR需要裂解细胞，破坏了细胞的完整性；而ICC需要将富集的细胞进行固定和通透处理后，再与核酸染料、染料标记的抗角蛋白(cytokeratin，CK，上皮细胞的标志物)的抗体以及染料标记的抗白细胞共同抗原(CD45，白细胞的标志物)的抗体孵育，通过荧光信号来判断获得细胞的来源，但固定和通透处理会完成破坏细胞的活性。因此，目前发展的CTCs的鉴定方法都严重地破坏了细胞活性，极大地限制了对CTCs的后续研究。另一方面，CTCs的鉴定几乎都是与捕获是分开进行，且鉴定的操作步骤繁多，导致整个CTCs的检测过程繁琐、费时。另外，多步操作会带来CTCs的大量损失，会影响方法的灵敏度和可靠性。因此，发展一种简单、温和的CTC鉴定方法是目前亟需解决的问题。
发明内容
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的之一是提供一种简单、温和的CTCs的鉴定方法；另一个目的是将该鉴定方法与目前应用最广泛的免疫磁富集CTCs的方法相结合，发展一种CTCs的同时捕获和鉴定的方法，减少CTCs在检测过程中的损失。
为达到此目的，本发明采用如下技术方案：
1、磁性纳米球表面修饰特异性识别肿瘤细胞的抗体，两种不同颜色的荧光纳米球分别修饰特异性识别肿瘤细胞和白细胞的抗体，得到免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球；
2、将上述免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球同时加入到待测的全血样品中，孵育使得免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球能和目标细胞充分结合，磁分选，并用含核酸染料的缓冲溶液洗涤三遍，再用缓冲液洗涤两遍后，用缓冲液重悬捕获的细胞；
3、利用倒置荧光显微镜观察免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球识别的细胞，被修饰了特异性识别肿瘤细胞的抗体的荧光纳米球标记成该色、核阳性同时未被修饰了特异性识别白细胞的抗体的另一种颜色荧光纳米球识别的细胞认为是肿瘤细胞；而被修饰了特异性识别白细胞的抗体的荧光纳米球标记成该色，核阳性同时未被修饰了特异性识别肿瘤细胞的抗体的荧光纳米球标记的细胞判定为白细胞，完成循环肿瘤细胞的鉴定。
步骤1中，磁性纳米球表面修饰特异性识别肿瘤细胞的抗体，两种不同颜色的荧光纳米球分别被修饰了特异性识别肿瘤细胞和白细胞的抗体，具体为：通过EDC/NHS活化法使纳米球表面的羧基(-COOH)活化后，与抗体的氨基共价结合，得到免疫磁性纳米球IMNs和免疫荧光纳米球IFNs。
所述的磁性纳米球，粒径均一，直径380nm左右。
步骤1所述的荧光纳米球，光稳定性好，是包裹量子点或染料的聚合物球或硅球，或负载量子点的聚合物球，而且荧光纳米球在复杂体系具有较好单分散性和荧光稳定性，粒径在250nm以下。
步骤1所述的特异性识别肿瘤细胞的抗体为抗细胞膜蛋白的抗体，是抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)抗体，表皮生长因子受体(HER 2)抗体或前列腺特异性膜抗原(PSMA)抗体中的一种；识别白细胞的抗体为抗白细胞共同抗原(CD45)抗体。
步骤1所述的每毫克磁性/荧光纳米球偶联抗体的量为5μg。
步骤2所述的偶联特异性识别肿瘤细胞的抗体的免疫磁性纳米球和免疫荧光纳米球用量比为3:2。
步骤2中所述的免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球与待测的全血样品孵育时间为2.5～30min，优选为20min。
步骤2中所述的磁分选洗涤时所用的核酸染料为标记活细胞的核酸染料，洗涤浓度为其工作浓度，优选1μg/mL Hoechst 33342的磷酸盐缓冲溶液。
本发明方法鉴定后的细胞可以保持较高的生物学活性，可以直接用于体外培养。培养过程如下：将鉴定后的细胞用DMEM培养基(含10％胎牛血清(FBS)，1％的青霉素，1％的链霉素)分散后于培养皿内，置于37℃5％CO2的细胞箱内培养。
基于上述方法，本发明实施例采用磁性纳米球和包埋不同发射波长量子点的荧光纳米球(分别是发射光为525nm的绿色荧光纳米球和发射波长为625的红色荧光纳米球)为材料，其中磁性纳米球和绿色荧光纳米球(GNs)修饰抗EpCAM的抗体，红色荧光纳米球(RNs)修饰抗CD45的抗体。将上述免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球与含有CTCs的全血孵育时，磁性纳米球和绿色荧光纳米球识别肿瘤细胞，红色荧光纳米球则结合到白细胞表面。通过磁分选，除去多余的荧光纳米球和血细胞，将得到的细胞置于荧光显微镜下观察，被绿色荧光纳米球标记成绿色，核阳性同时不被红色荧光纳米球识别的认为是肿瘤细胞；而被红色荧光纳米球标记成红色，核阳性EpCAM阴性的细胞判定为白细胞。
本发明还进一步提供了一种用于同时捕获和鉴定循环肿瘤细胞的试剂盒，其包括：
1、免疫磁性纳米球，所述纳米球表面修饰有特异性识别肿瘤细胞的抗体；
2、两种不同颜色的荧光纳米球，分别被修饰了特异性识别肿瘤细胞和白细胞的抗体；
3、核酸染料的溶液。
上述试剂盒中的特异性识别肿瘤细胞的抗体可以是上皮细胞粘附分子(EpCAM)，识别白细胞的抗体为白细胞共同抗原(CD45)，核酸染料是Hoechst33342的磷酸盐缓冲溶液。
本发明方法利用性能稳定的免疫磁性纳米球和免疫荧光纳米球实现了对CTCs的同时捕获和鉴定，操作简便省时，避免了传统CTCs检测方法多步操作带来的CTCs的损失；荧光纳米球的光稳定性优异，整个操作过程不需要进行避光处理；更重要的是，采用荧光纳米球的鉴定方法操作温和，不需要对细胞裂解或通透处理，而且纳米尺度的免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球与细胞的结合对细胞活性的影响是极小，93％的细胞在鉴定后仍保持生物学活性，可以进行体外培养。
附图说明
图1为荧光纳米球在复杂体系稳定性考察结果
(A)荧光纳米球在纯的胎牛血清中孵育30min内的荧光强度的变化；荧光纳米球在纯的胎牛血清中孵育前(B)和孵育30min后(C)的动态光散射表征；荧光纳米球在纯的胎牛血清中孵育前(D)和孵育30min(E)后的荧光显微镜图片。
图2为免疫荧光纳米球高效、特异性地标记目标细胞的荧光显微镜图片结果
A-C依次为偶联了抗EpCAM抗体的绿色荧光纳米球标记肿瘤细胞MCF-7和淋巴白血病癌细胞Jurkat T细胞，以及没有偶联抗体裸的绿色荧光纳米球标记MCF-7细胞；D-E依次为偶联了抗CD45抗体的红色荧光纳米球标记Jurkat T细胞和MCF-7细胞，以及没有偶联抗体裸的红色荧光纳米球标记Jurkat T细胞。
图3为免疫荧光纳米球标记目标细胞的效果与有机染料的对比
(A)偶联抗CD45抗体的红色荧光纳米球标记Jurkat T细胞的荧光显微镜图；(B)Jurkat T细胞先与抗CD45的单抗孵育再与Cy3标记的二抗孵育后的显微镜图片；以及这两种方法标记的Jurkat T细胞的流式细胞术分析结果(C)；通过流式细胞术分析和荧光共定位分析免疫荧光纳米球和染料标记目标细胞的效率(D)；荧光纳米球(E)和染料(F)标记目标细胞后光稳定性分析(置于显微镜100倍镜头下，100W汞灯连续照射8min)。
图4基于磁性纳米球和荧光纳米球发展的同时捕获和鉴定的CTCs的示意图。
图5为从混合体系中同时捕获和鉴定肿瘤细胞的显微镜图
(A)为染核的105个MCF-7细胞与107个Jurkat T细胞混合后，与免疫磁性纳米球、偶联了抗EpCAM抗体的绿色荧光纳米球以及偶联了抗CD45抗体的红色荧光纳米球孵育20min的显微镜图；(B)磁分选后，磁性纳米球捕获的细胞的显微镜图；(C)磁分选后，丢弃的细胞的显微镜图。明场；Hochest 33342：激发405nm，发射445±25nm；绿色荧光纳米球：激发450-490nm，发射525±18nm；红色荧光纳米球：激发510-560nm，发射590nm长通。
图6为模拟CTCs样品中检测结果
(A)采用Fluor647标记的CK19抗体标记免疫荧光纳米球鉴定后CTCs的共聚焦显微镜图片，核(Hoechst 33342):激发330-380nm,发射447±30nm；EpCAM(绿色荧光纳米球)：激发488nm，发射525±25nm；CD45(红色荧光纳米球)：激发605nm，发射685±20nm；CK(Fluor649):激发605nm,发射685±20nm；共定位:四个通道的共定位图片；(B)分别采用本发明的同时捕获和鉴定的方法，以及传统的磁捕获后采用ICC鉴定的方法对相同的模拟全血CTCs样品进行检测。
图7为对鉴定后肿瘤细胞活性考察的显微镜图片
(A)为鉴定后肿瘤细胞碘化丙啶染色的显微镜图片(白圈内的细胞是唯一失去细胞活性的细胞)；B-E为鉴定后的细胞的传代培养显微镜图，(B)为刚贴壁，(C)细胞长满，(D)第一次传代长满，(E)第三次传代长满。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】免疫磁性纳米球和免疫荧光纳米球的制备
磁性纳米球(MNs)的制备是采用本实验室发展的层层组装法，首先利用EDC/NHS活化苯乙烯丙烯酰胺聚合球(Pst-AAm-COOH)表面的羧基，与聚乙烯亚胺(PEI)的氨基共反应；随后利用γ-Fe2O3的Fe与聚乙烯亚胺的伯胺的配位作用，将γ-Fe2O3组装到聚合物球的表面；随后重复组装聚乙烯亚胺和γ-Fe2O3直至组装5层γ-Fe2O3后，将所得的磁性纳米球通过四乙氧基硅氧烷和(3-氨基丙基)三乙氧基硅氧烷处理在其表面包覆一层硅壳并引入氨基；最后将上一步得到的磁性纳米球通过丁二酸酐处理在其表面引入羧基。所得的磁性纳米球的粒径约为380nm，粒径均一，磁响应快。
荧光纳米球(FNs)采用实验室发展的包埋法制备；即利用疏水相互作用将不同发射波长的油溶性量子点超声包埋到Pst-AAm-COOH的的疏水空腔内倍从而制备得到发射绿色荧光的荧光纳米球(GNs)和红色荧光的荧光纳米球(RNs)。所得的荧光纳米球(FNs)粒径为250nm左右。
制备得到纳米球(MNs和FNs)表面富含羧基，采用EDC/NHS活化的方法，将其表面羧基活化，与抗体的氨基共价结合，得到免疫磁性纳米球(IMNs)和免疫荧光纳米球(IFNs)。其中MNs和GNs都偶联特异性识别肿瘤细胞的抗EpCAM抗体，而RNs偶联特异性识别白细胞的抗CD45抗体，每毫克磁性/荧光纳米球偶联抗体的量都为5μg。
【实施例2】荧光纳米球在复杂体系中的稳定性考察
采用荧光仪监测FNs与1mL纯胎牛血清(FBS)连续孵育30min的荧光强度的变化；利用动态光散射测定FNs在孵育前后的粒径和单分散性变化；将孵育前后的FNs制样置于倒置荧光显微镜下观察。
如图1A所示，FNs在纯FBS中孵育30min内，其荧光强度没有明显变化；孵育后的水合粒径以及多分散系数(PDI)都是与孵育前相比(图1B，C)，几乎没有明显变大，说明FNs在复杂体系仍可以保持优异的单分散性；而且荧光显微镜的结果再次说明，FNs在纯FBS孵育30min后(图1D)的荧光强度和单分散性都是与孵育前的结果(图1E)相当的。上述结果表明：FNs在复杂体系有良好的胶体稳定性和荧光稳定性，为其实现全血中直接标记目标细胞奠定了基础。
【实施例3】免疫荧光纳米球高效、特异性地标记目标细胞
偶联了抗EpCAM抗体的绿色荧光纳米球(即免疫绿色荧光纳米球，IGNs)与目标肿瘤细胞MCF-7孵育30min，1500rpm离心5min除去多余的荧光纳米球，置于倒置荧光显微镜下观察；同时，IGNs与白血病癌细胞Jurkat T细胞孵育，没有偶联抗体的裸的GNs与MCF-7细胞孵育作为对照实验。类似地，偶联了抗CD45抗体的红色荧光纳米球(即免疫红色荧光纳米球，IRNs)与目标细胞Jurkat T细胞反应，而IRNs与MCF-7细胞孵育和RNs与Jurkat T细胞作孵育对照实验。为了将IFNs的标记效果与有机染料进行对比，Jurkat T细胞与抗CD45单抗孵育30min后，再与Cy3标记二抗反应。最后将IRNs标记的Jurkat T细胞和Cy3标记Jurkat T细胞采用倒置荧光显微镜观察和流式细胞术分析。
如图2A所示，IGNs与目标肿瘤细胞MCF-7孵育后，几乎每个MCF-7细胞表面都有明显的绿色荧光信号；然而，IGNs不能标记Jurkat T细胞(图2B)，且GNs没有偶联抗EpCAM抗体时，也不能标记MCF-7细胞(图2C)。说明IGNs标记MCF-7是高效的和特异性的。同理，如图2D-F所示，IRNs也能够高效、特异地标记目标白细胞Jurkat T细胞。
如图3A-B所示，无论是IRNs标记的Jurkat T细胞的红色荧光与Hoechst 33342染核的蓝色荧光的共定位效果，还是IRNs标记Jurkat T细胞的荧光强度都与Cy3的标记效果是相当的。流式细胞术分析也说明IRNs标记的Jurkat T细胞的荧光强度与Cy3标记的Jurkat T细胞的强度接近(图3C)。无论是荧光共定位分析或是流式细胞术分析都表明IRNs标记Jurkat T细胞的效率和Cy3的效率没有明显差别(图3D)。
光稳定性对荧光鉴定来说至关重要，因此我们对比了IRNs和Cy3标记的Jurkat T细胞的光稳定性。将这两种方法标记的Jurkat T细胞置于倒置荧光显微镜100倍物镜下，采用100W汞灯连续照射8min，如图3E所示，IRNs标记的Jurkat T细胞的荧光信号很稳定，没有明显变化；而Cy3标记细胞的荧光迅速变弱，在4min后几乎检测不到荧光，如图3F所示。
因此，IFNs可以高效、特异地标记目标细胞，其标记效果可以与传统有机染料的标记效果相媲美，而且其光稳定性显著优于有机染料，因此，可以将IFNs用于CTCs的ICC鉴定。
【实施例4】混合体系中MCF-7细胞的检测
将105个Hoechst 33342染核的MCF-7细胞与107个Jurkat T细胞混匀后，如图4所示，将IMNs，IGNs和IRNs加入到混合细胞体系中孵育20min，磁分选，除去多余的荧光纳米球和干扰的Jurkat T细胞。将磁捕获的细胞置于荧光显微镜下观察；作为对照，孵育磁分选前的细胞样品以及磁分选后洗涤丢弃的细胞，也进行显微镜拍照分析。
MCF-7细胞都被IGNs标记成绿色，而其周围存在着大量干扰的IRNs标记发出红色荧光的Jurkat T细胞(图5A)；通过简单的磁分离，可以发现磁捕获的细胞绝大多数都是IGNs标绿的MCF-7细胞，少量残留的Jurkat T细胞由于发出红色荧光很容易被排除(图5B)；磁分选后丢弃的细胞几乎都是IRNs标记的Jurkat T细胞，几乎没有MCF-7细胞的损失(图5C)，说明本方法目标细胞的损失率很低。以上结果表明，免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球可以实现对混合样品中肿瘤细胞的同时捕获和标记，借助于荧光球的荧光信号能够方便地区别肿瘤细胞和白细胞，极大地简化了鉴定过程。
【实施例5】模拟样本中极少量MCF-7细胞的检测
将极少量的MCF-7细胞投入到1mL全血中构成模拟CTCs样品。将IMNs，IGNs和IRNs加入到模拟样本中孵育20min，磁分选，除去多余的荧光纳米球和血细胞，并用1μg/mL的Hoechst 33342的磷酸盐缓冲液洗涤3次使细胞核染色，再用缓冲液洗涤2次后分散，置于荧光显微镜下观察。细胞呈现核阳性，被IGNs标记成绿色同时有没有被IRNs识别的就判定为肿瘤细胞；而那些被IRNs标记成红色，核阳性又没有被IGNs被判定为白细胞。为了验证我们发展的这种基于IFNs鉴定CTC方法的可靠性和准确性，我们将上述鉴定后的细胞用4％多聚甲醛溶液固定10min和0.1％曲通X-100(Triton-X 100)通透10min后，加入5μg/mL的Fluor674标记的抗角蛋白19(CK19)的抗体于37℃避光孵育30min后洗涤，最后利用荧光显微镜观察。
如图6A所示，被IGNs标记的细胞也表现为CK阳性，而IRNs标记的细胞则不表达CK。说明基于免疫荧光纳米球发展的CTCs的鉴定方法与目前通用的基于染料的ICC鉴定方法有非常好的一致性。
采用我们发展的同时捕获和鉴定的方法对5组模拟CTC全血样品进行检测，每组样本平行做三次，结果如表1所示，标准偏差计算得8.3％，表明该法重现性较好，方法可靠。
平均的相对标准偏差：(8.7±3.6)％
另一方面，6组模拟CTC样品分别采用我们发展的基于免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球同时捕获和鉴定的方法，以及采用传统的磁富集后，将磁捕获的细胞固定、通透处理后，利用DAPI，FITC标记的抗CK19抗体和藻红蛋白(PE)标记的抗CD45抗体进行ICC鉴定。统计上述两种方法检测出来的细胞数目。
如图6B所示，本方法检测出的肿瘤细胞的数量明显多于传统法，说明本方法简化了CTCs检测的操作，避免了多步操作带来的CTCs的损失。
【实施例6】鉴定后肿瘤细胞的活性考察
将IMNs和IGNs投入到MCF-7细胞悬液中，孵育20min,磁分选并洗涤，用4.5μM碘化丙啶(PI)染色30min，将处理好的细胞在荧光显微镜下用蓝光激发观察，统计500个细胞，计算为未被PI染红细胞的数目占总细胞数的百分比即为捕获细胞的活性率。另外，将采用免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球同时捕获和鉴定后的MCF-7细胞用DMEM培养基(含有10％胎牛血清、1％青霉素、1％链霉素)分散，于37℃5％CO2的细胞培养箱中培养，观察其贴壁、生长、增值及传代过程。
PI为一种不能穿过活细胞的细胞膜的核染料，可以透过死细胞的胞膜与核内的DNA作用产生红色荧光。因此对IMNs和IGNs检测后肿瘤细胞进行PI染色时，发红色荧光的细胞为死细胞。如图7A所示，只有图上白色圈标出的肿瘤细胞为死细胞，统计得到93.8％的肿瘤细胞仍保持生物学活性。
图7B-E依次为鉴定后的MCF-7细胞贴壁、长满、第一次传代长满、第三次传代长满的显微镜图片，可以发现采用该方法鉴定后的细胞基本能正常贴壁、增值并可以进行传代培养。而且，IGNs的荧光信号稳定，不受培养环境和传代操作的影响。总之，纳米尺度的免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球对细胞的活性影响较小，鉴定后的细胞很好的保持生物学活性，不需要释放纳米球就可以进行体外培养。

Claims (3)

1.一种捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法，是非疾病诊断目的，其特征在于：由如下步骤组成：
1)免疫磁性纳米球和免疫荧光纳米球的制备：
磁性纳米球的制备：首先利用EDC/NHS活化苯乙烯丙烯酰胺聚合球表面的羧基，使其与聚乙烯亚胺的氨基共价反应；随后利用γ-Fe2O3的Fe与聚乙烯亚胺的伯胺的配位作用，将γ-Fe2O3组装到聚合球表面；再重复组装聚乙烯亚胺和γ-Fe2O3直至组装5层γ-Fe2O3；最后，将制得的磁性纳米球通过四乙氧基硅氧烷和(3-氨基丙基)三乙氧基硅氧烷处理在其表面包覆一层硅壳并引入氨基，再与丁二酸酐反应在磁性纳米球表面引入羧基；所得的磁性纳米球的粒径为380nm；
荧光纳米球制备：利用疏水相互作用将不同发射波长的油溶性量子点超声包埋到表面具有羧基的苯乙烯丙烯酰胺聚合球的疏水空腔内部从而制得发射不同颜色荧光的两种荧光纳米球；所得的荧光纳米球粒径为250nm以下；
制得的磁性纳米球和荧光纳米球表面富含羧基，采用EDC/NHS活化的方法，将其表面羧基活化，与抗体的氨基共价结合，得到免疫磁性纳米球和免疫荧光纳米球；磁性纳米球和其中一种荧光纳米球都偶联特异性识别肿瘤细胞的抗体，另一种荧光纳米球偶联特异性识别白细胞的抗体；每毫克磁性/荧光纳米球偶联抗体的量都为5μg；
2)将上述免疫磁性纳米球和两种免疫荧光纳米球同时加入到待测的全血样品中，其中偶联了特异性识别肿瘤细胞的抗体的免疫磁性纳米球和免疫荧光纳米球用量比为3:2；孵育时间为2.5～30min；磁分选，用含有核酸染料的缓冲溶液洗涤三遍，再用缓冲溶液洗涤两遍后，用缓冲液重悬捕获的细胞，核酸染料为标记活细胞的核酸染料，洗涤浓度为其工作浓度；
3)利用倒置荧光显微镜鉴定磁捕获的细胞，被修饰了特异性识别肿瘤细胞的抗体的荧光纳米球标记成该色、核阳性同时未被修饰了特异性识别白细胞的抗体另一种颜色荧光纳米球识别的细胞认为是肿瘤细胞；而被修饰了特异性识别白细胞的抗体的荧光纳米球标记成该色，核阳性同时未被修饰了特异性识别肿瘤细胞的抗体的荧光纳米球标记的细胞判定为白细胞，完成循环肿瘤细胞的鉴定。
2.根据权利要求1所述的捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法，其特征在于：步骤1所述的特异性识别肿瘤细胞的抗体为抗细胞膜蛋白的抗体，是抗上皮细胞粘附分子抗体，抗表皮生长因子受体抗体或抗前列腺特异性膜抗原抗体中的一种；特异性识别白细胞的抗体为白细胞共同抗原抗体。
3.根据权利要求1或2所述的捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法，其特征在于：步骤2)中所述的免疫磁性纳米球和免疫荧光纳米球与待测的全血样品孵育时间为20min。
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