CN112899231A - 一种可视化肿瘤细胞检测试剂、试剂盒及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可视化肿瘤细胞检测试剂、试剂盒及其制备方法与应用，肿瘤细胞捕获材料由纳米材料、聚集诱导发光分子、带有正电荷的高分子化合物和连接体制得。该CTC捕获材料，能够兼顾普适性(能够检测不同肿瘤来源的细胞)和特异性，不需要用磁珠多抗进行表面修饰，成本低廉，检测时间短，并采用“Turn‑on”式荧光模式，避免了“Always‑on”荧光染料导致的荧光背景强，以及在反复洗去未与细胞结合的染料分子过程中可能出现的由于细胞损失导致的假阴性。

Description

一种可视化肿瘤细胞检测试剂、试剂盒及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于材料领域，具体涉及一种可视化肿瘤细胞检测试剂、试剂盒及其制备方法与应用。

背景技术

恶性肿瘤一种危害人类生命健康的重要疾病，提高其早期发现率是降低肿瘤死亡率的主要方法之一。相关技术中，一些肿瘤的常规检测手段，如影像学方法，需在肿瘤生长到一定体积时才能检出，但据统计此时已约80％的肿瘤属中晚期。病理诊断作为恶性肿瘤诊治的前提和基础，穿刺或手术活检也是诊断肿瘤的常见方法，但这种有创性的操作不能频繁性的重复开展，且转移灶的取材难度也限制了活检的应用，对复发转移的恶性肿瘤患者无法进行多次动态监测。

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)指自发或因诊疗操作由实体瘤或转移灶释放进入血液循环的肿瘤细胞，在肿瘤发生的超早期及转移期普遍存在，是恶性肿瘤血行转移的重要始发事件。研究表明，CTCs可用于肿瘤的早期筛查、复发转移和预后判断以及疗效监测，是目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断和实时疗效监测手段。CTCs可作为分析患者肿瘤生物学特征的实时样本，发现患者的实时生物学变化，并根据结果及时调整治疗方案，实现实时的个体化治疗，具有重要的临床意义。CTCs的检测策略包括捕获、鉴定、分析3个部分，捕获是从血液中富集提取CTCs的过程，鉴定是对分离的细胞检测特异性的确证，而分析则是对捕获的CTCs进行更深入的分子生物学特征探究。从血液中捕获CTCs对于后续的鉴定和分析至关重要，捕获技术的发展是CTCs研究的前提条件。

相关技术中，CTCs捕获方法可分为免疫学方法和物理方法两大类。利用特异性抗体识别并结合CTCs表面生物标志物的免疫学富集方法较为常用，包括Cellsearch系统。Cellsearch系统利用CTCs表面高表达的上皮细胞黏附分子(Epithelial cell adhesionmolecule，EpCAM)与含EpCAM抗体的磁珠结合，在外加磁场的作用下捕获CTCs。但EpCAM并不是所有CTCs的通用肿瘤标记物，无法检测出非上皮来源的CTCs。还有利用CD45免疫包被磁珠吸附白细胞，在磁场作用下去除白细胞，从而富集沉淀循环CTCs的阴性富集法，但是这种方法的纯度较低，富集后剩余的白细胞仍可干扰后续分析。而基于物理特性的富集法，包括微孔过滤法，该方法依据CTCs体积大于血细胞的特性，对其进行捕获，但这种方法对于体积较小的CTCs并不适用。

综上所述，目前的CTCs的捕获方法都存在显著的局限性，例如，基于特定肿瘤标志物的检测技术只适用于该类肿瘤；微孔过滤法只适用于大细胞类的肿瘤等，因此，亟待开发出一种新型的肿瘤细胞靶向方法。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种CTC捕获材料，能够兼顾普适性(能够检测不同肿瘤来源的细胞)和特异性，不需要用磁珠多抗进行表面修饰，成本低廉，检测时间短，并采用“turn on”式荧光模式，避免了“Always-on”荧光染料导致的荧光背景强，需要反复洗去未与细胞结合的染料分子，在此过程中可能会造成细胞损失从而导致假阴性。

本发明的第一个方面，提供一种CTC捕获材料，该CTC捕获材料由纳米材料、聚集诱导发光分子、带有正电荷的高分子化合物和连接体制得；

上述聚集诱导发光分子修饰有-CHO基团；

上述连接体修饰有-CHO基团和-SH基团；

其中，上述带有正电荷的高分子化合物的一氨基连接于所述聚集诱导发光分子的-CHO端；

上述带有正电荷的高分子化合物的另一氨基连接于所述连接体的-CHO端；

上述连接体的-SH基团连接在所述纳米材料表面。

根据本发明的一种具体的实施方式，至少具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的循环肿瘤细胞靶向和检测的纳米材料，相对于相关技术中的方法，本发明可以实现对多种肿瘤细胞的快速响应，检测时间短，还可以实现检测过程中荧光turn-on可视化，不必对样品进行漂洗，同时可进行拉曼信号检测，具有很好的应用前景。

根据本发明的第一个方面，在一些具体实施方式中，上述纳米材料表面连接若干连接体。

根据本发明的第一个方面，在一些具体实施方式中，上述纳米材料包括纳米金。

在一些优选实施方式中，上述纳米材料为金纳米棒(GNRs)。

金纳米棒是一种尺度从几纳米到上百纳米的棒状金纳米颗粒，具有非常丰富的化学物理性质。基于金纳米棒的表面增强拉曼散射效应(SERS)可以增强拉曼信号。金纳米棒的表面增强拉曼效应依赖于金属表面局域电场的增强，吸附在SERS活性基底表面的第一层分子可获得最大的增强。因此，将聚集诱导发光分子-正电荷高分子复合物(TPEI)连接在GNRs表面能有效地拉近两者之间距离。

在一些具体实施方式中，GNRs是通过种子诱导生长法合成，在反应溶液中加入一定量的金纳米颗粒晶种，通过生长液中的离子和还原剂的作用下，晶种颗粒定向生长为一定轴比的金纳米棒。当然，本领域技术人员也可以根据实际需求，采用商用或其他合成方式获得。

采用种子诱导法制备的GNRs表面带有阳离子表面活性剂CTAB，若不对其进行修饰会产生极强的细胞毒性，无法用于体外捕获细胞。基于以上两点考虑，本发明将TPEI进行化学修饰使其带上巯基(-SH)，-SH可与GNRs形成稳定的金-硫键(Au-S)。

根据本发明的第一个方面，在一些具体实施方式中，上述带有正电荷的高分子化合物包括聚乙烯亚胺(PEI)。

与正常细胞相比，肿瘤细胞的一个普遍特征是在氧气充足的条件下也会偏向于采用无氧糖酵解的方式获取能量，被称为瓦伯格效应(Warburg effect)。肿瘤细胞有氧糖酵解的能量代谢途径会使细胞表面形成负电荷网，这是不同来源肿瘤细胞的共性，但正常细胞却不会出现这一现象。因此，肿瘤细胞的表面负电荷网可以作为一个广谱高效的靶点，正电荷纳米颗粒可特异性地吸附肿瘤细胞。基于癌细胞电荷特性对CTCs进行捕获是不依赖细胞表面生物标志物的新型捕获方法，兼具特异性和普适性，相较于传统捕获方法存在很大优势。

PEI亲水性强，通过与聚集诱导发光分子或其他可与氨基反应的活性基团结合，可以极大的提高其水溶性。当然，本领域技术人员可以根据实际需求合理的选择其他具有相似效果的化合物进行替换。

根据本发明的第一个方面，在一些具体实施方式中，上述聚集诱导发光分子(AIEgens)包括四苯基乙烯(TPE)。

在一些具体实施方式中，上述聚集诱导发光分子还包括四苯基乙烯衍生物；其中，所述四苯基乙烯衍生物具有聚集诱导发光功能。

为实现CTCs捕获的可视化，需要将聚集诱导发光分子连接在纳米粒表面。AIEgens能克服传统有机发光材料在溶液浓度提高时发生聚集而荧光淬灭的缺陷，其聚集发光的特性可用于设计“Turn on”探针。当CTC捕获材料通过静电作用靶向至肿瘤细胞后(正电荷高分子化合物PEI驱使纳米粒子与细胞结合)，处于纳米粒表面的TPE分子转动空间被压缩，发生分子内运动受阻，荧光被“Turn on”。通过这种方法可以降低背景荧光，同时由于1个纳米粒表面可以连接大量AIEgens，从而可以实现信号放大。

根据本发明的第一个方面，在一些具体实施方式中，上述连接体包括聚乙二醇。

选择CHO-聚乙二醇(PEG)-SH(Mw＝2000)作为-SH供体，使TPEI中来自聚乙烯亚胺的氨基能氨基继续与CHO-PEG-SH分子的-CHO反应发生醛胺缩合。当然，也可选择其他能与PEI反应且带有-SH的分子。

根据本发明的第一个方面，在一些具体实施方式中，上述CTC捕获材料带正电荷，呈棒状，长径比为2～4。

在一些具体实施方式中，上述CTC捕获材料的长径比为3.44±0.14。

本发明的第二个方面，提供一种CTC捕获材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将聚集诱导发光分子和带有正电荷的高分子化合物混合，加入二甲基亚砜，反应22～26h，透析，得到聚集诱导发光分子-正电荷高分子复合物；

(2)将步骤(1)制得的聚集诱导发光分子-正电荷高分子复合物与连接体混合物，反应10～14h，加入纳米材料，反应14～18h，透析，即得；

其中，上述聚集诱导发光分子修饰有-CHO基团；

上述连接体修饰有-CHO基团和-SH基团。

根据本发明的一种具体的实施方式，至少具有以下有益效果：

本发明提供了一种新的循环肿瘤细胞靶向和检测的纳米材料的制备方法，该方法制备得到的CTC捕获材料靶向CTC机理如图1所示，其主要基于瓦伯格效应(Warburgeffect)。肿瘤细胞有氧糖酵解会使细胞表面形成负电荷网，可以作为一个广谱高效的靶点，带有正电荷的纳米粒可特异性地吸附肿瘤细胞，可以实现对多种肿瘤细胞的快速响应，检测时间短，还可以实现检测过程中荧光turn-on可视化，不必对样品进行漂洗，同时可进行拉曼信号检测，具有很好的应用前景。

根据本发明的第二个方面，在一些具体实施方式中，步骤(1)所述透析的截留分子量为2000～2200；步骤(2)所述透析的截留分子量为14000～15000。

根据本发明的第二个方面，在一些具体实施方式中，上述纳米材料包括纳米金。

在一些优选实施方式中，上述纳米材料为金纳米棒(GNRs)。

根据本发明的第二个方面，在一些具体实施方式中，上述带有正电荷的高分子化合物包括聚乙烯亚胺(PEI)。

根据本发明的第二个方面，在一些具体实施方式中，上述连接体包括聚乙二醇。

本发明的第三个方面，提供本发明第一个方面所述的CTC捕获材料或本发明第二个方面制备得到的CTC捕获材料在制备肿瘤检测试剂中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种诊断制剂，该诊断制剂中含有本发明第一个方面所述的CTC捕获材料或本发明第二个方面制备得到的CTC捕获材料。

本发明的第五个方面，提供一种诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒中含有本发明第四个方面所述的诊断制剂。

附图说明

图1为本发明实施例中的CTC捕获材料反应原理图；

图2为本发明实施例中GNRs的制备步骤示意图；

图3为本发明实施例中的PEI(A)和TPE(C)的氢谱图，其中，B为A的部分放大的图像；

图4为本发明实施例中的TPEI(A)的氢谱图，其中，B为A的部分放大的图像；

图5为本发明实施例中的TPE、PEI、TPEI、CHO-PEG-SH、TPEI-PEG-SH和GNRs-PEG-TPEI的傅里叶红外(FT-IR)表征图片，其中，a峰为TPE特征峰，b峰为CHO-PEG-SH的特征峰；

图6为本发明实施例中的GNRs、GNRs-PEG以及GNRs-PEG-TPEI的紫外-可见光谱图；

图7为本发明实施例中的GNRs-PEG-TPEI的热重曲线图；

图8为本发明实施例中的GNRs-PEG-TPEI的透射电镜图；

图9为本发明实施例中的GNRs、GNRs-PEG以及GNRs-PEG-TPEI的粒径尺寸比对(A)和Zeta电位(B)比对图；

图10为GNRs-PEG-TPEI分散于不同浓度的PBS缓冲液24h后的示意图；

图11为人乳腺癌细胞MCF-7(a)、人结肠癌细胞Caco2(b)、人肝癌细胞HepG2(c)在不同浓度的GNRs-PEG-TPEI中的细胞活性；

图12为GNRs-PEG-TPEI与活细胞结合的荧光成像示意图，其中，a为针对不同染料的染色情况，b为室温下不同操作时长下的染色情况；

图13为人乳腺癌细胞MCF-7、人结肠癌细胞Caco2、人肝癌细胞HepG2针对不同染料的染色情况；

图14为人结肠癌细胞Caco2和正常细胞NCM460针对不同染料的染色情况；

图15为人结肠癌细胞Caco2(A)和正常细胞NCM460(B)的拉曼信号强度对比图；

图16为GNRs-PEG-TPEI/4-ATP对肿瘤细胞和正常细胞的拉曼强度对比图。

具体实施方式

以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实验材料

(1)金纳米棒(GNRs)的制备：

本实施例中的GNRs是通过种子诱导生长法合成，其基本原理是在反应溶液中加入一定量的金纳米颗粒晶种，通过生长液中的离子和还原剂的作用下，晶种颗粒定向生长为一定轴比的金纳米棒。

具体步骤为：

①金种溶液配制：将0.1mL HAuCl₄(20mM)溶液和480μL冰水配制的硼氢化钠(10mM)溶液依次加入到8mL CTAB(0.1mM)溶液中，溶液由无色变为浅黄色再变为茶色。搅拌2min后停止，将种子液室温静置2h。

②GNRs生长液配制：在40ml CTAB(0.1mM)溶液中依次加入1.0mL HAuCl₄(20mM)溶液、400μL AgNO₃(10mM)溶液、220μL抗坏血酸(0.1M)溶液及160μL盐酸溶液(1M)搅拌混合，溶液由橙色变为无色。将48μL金种溶液加入到生长液中，搅拌2min摇匀，室温静置10-12h，得到酒红色GNRs原液。

③纯化：将得到的GNRs原液离心，除去大量未反应的CTAB。将GNRs原液在12000rpm离心15min，弃去上清，沉淀等量双蒸水重悬，重复两次，得到GNRs溶液，用于后续修饰反应。

制备步骤示意图如图2所示。

(2)聚集诱导发光分子-正电荷高分子复合物(TPEI)的制备：

本实施例选择四苯基乙烯(TPE)作为聚集诱导发光分子，选择聚乙烯亚胺(PEI)(Mw＝10000)作为正电荷高分子。通过将水溶性差的TPE与亲水性强的PEI进行化学连接，从而极大地改善了复合物的水溶性，当然，无论聚集诱导发光分子的水溶性如何，只要带有可与氨基反应的活性基团即可实现聚集诱导发光分子和正电荷高分子的结合。

单官能团-CHO修饰的TPE分子(TPE-CHO)与PEI的氨基之间的醛胺缩合制备得到TPEI，具体步骤为：取20mg TPE-CHO与240mg PEI，溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)，室温下搅拌反应24h。得到的产物进行透析，透析袋截留分子量2000，外相为双蒸水，每6h换水一次至透析结束。得到TPEI水溶液，冻干备用。

产物通过核磁共振氢谱(¹H NMR)确认其结构，检测步骤为：以氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)为溶剂，取少量产物溶解在0.5mL DMSO-d6中，常温下通过核磁共振波谱仪(400MHz)进行氢谱测试。

结果如图3和4所示。在图4的TPEI谱图中出现了TPE-CHO的苯环氢的信号峰，同时失去醛基信号峰，表明TPE-CHO通过自身的-CHO与PEI发生反应，成功在PEI大分子链上修饰上TPE小分子，得到了正确的产物TPEI。

可视化CTC捕获材料(GNRs-PEG-TPEI)的制备

由于金纳米棒的表面增强拉曼效应(SERS)依赖于金属表面局域电场的增强，而吸附在SERS活性基底表面的第一层分子可获得最大的增强，因此，将TPEI连接在GNRs表面能有效地拉近TPEI和GNRs之间的距离。此外，采用种子诱导法制备的GNRs表面带有阳离子表面活性剂CTAB，进行修饰后会去除GNRs自身的极强的细胞毒性，从而可以用于体外捕获细胞。

基于以上原理，本实施例中将TPEI进行化学修饰使其带上巯基(-SH)，而-SH可与GNRs形成稳定的金-硫键(Au-S)。而-SH供体为CHO-PEG-SH(Mw＝2000，购于西安瑞禧生物)，而TPEI中来自PEI的氨基则继续与CHO-PEG-SH分子的-CHO反应发生醛胺缩合，当然，也可选择其他能与PEI反应且带有-SH的分子。

具体试验步骤为：取32mg上述实施例制备得到的TPEI和32mg CHO-PEG-SH，加5ml双蒸水溶解，室温搅拌反应12h，得到TPEI-PEG-SH水溶液。取40mL离心纯化后的上述实施例制备得到的GNRs(0.1mg/mL)，加入得到的TPEI-PEG-SH水溶液，室温下搅拌16h。得到的产物进行透析，透析袋截留分子量14000Da，外相为双蒸水，每6h换水一次至透析结束，得到GNRs-PEG-TPEI水溶液，旋蒸浓缩至浓度为1mg/mL备用。

特征检测

(1)傅里叶红外(FT-IR)表征：

对TPE、PEI、上述实施例制备得到的TPEI、上述实施例制备得到的CHO-PEG-SH、上述实施例制备得到的TPEI-PEG-SH和上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI进行傅里叶红外(FT-IR)表征。

具体步骤为：采用溴化钾(KBr)压片法对待测样品(3mg)进行红外表征，傅里叶红外光谱仪需扣除大气背景后进行4000-600cm^-1波数内扫描波谱。

结果如图5所示。从TPEI的红外谱图中可以看到PEI的各主要峰形，对比TPE指纹区的a峰可以表明TPE已成功结合于PEI上。TPEI-PEG-SH的谱图中可以看到来自CHO-PEG-SH的b峰，同样证明了其成功合成。

(2)紫外-可见光谱：

由于金纳米棒有特殊的表面等离子体共振性质，能够在特殊波长对光进行吸收和散射，其紫外特征吸收峰会有横向和纵向两个峰，其中，横向峰在520nm左右有可见区，纵向峰(LSPR峰)则由金纳米棒的长径比决定，分布在600nm-950nm之间。

对GNRs、将PEG-SH与GNRs结合得到的GNRs-PEG、以及上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI进行紫外-可见光谱检测。

具体步骤为：在室温下，先用超纯水校准紫外吸收基线，再将待测样品装入石英吸收池中，进行紫外光谱测定。

结果如图6所示。修饰前后的产物(GNRs、将PEG-SH与GNRs结合得到的GNRs-PEG、以及上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI)均表现为GNRs的特征峰形，形态没有发生变化。与未修饰的GNRs相比，修饰后的GNRs-PEG和GNRs-PEG-TPEI的LSPR峰位置发生红移，其红移值分别为14nm和16nm，这是由于金纳米棒具有各向异性的性质，表面的偶联基团的变化会引起表面等离子共振的变化，表现为吸收峰位置的变化。

(3)热重(TGA)检测：

利用热分析的方法对上述实施例制备得到的TPEI-PEG-SH在GNRs载体上的实际负载量以及热稳定性进行测试。

热重曲线如图7所示。从热重曲线可知，GNRs-PEG-TPEI在250℃后有1个明显的失重过程，这是因为TPEI-PEG-SH为有机材料，在高温时会发生分解。根据失重的量可以估算出TPEI-PEG-SH的实际负载量约为40％。

(4)透射电镜图：

使用透射电子显微镜(TEM)对上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI的形貌和粒径大小进行表征。

透射电镜图如图8所示。由TEM图可知，上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI呈棒状且分散性好，长径比约为3.44±0.14。

(5)粒径及电位检测：

将GNRs、将PEG-SH与GNRs结合得到的GNRs-PEG、以及上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI超声处理，使其均匀分散在超纯水中配制成一定浓度的纳米粒溶液，利用激光纳米粒度仪在25℃下测试DLS粒径大小与Zeta电位分布。

结果如图9所示。由图9可知，随着GNRs表面修饰物分子量的增加，纳米粒子的粒径逐渐增大。同时，从纳米粒子电荷的变化情况也能得出TPEI已成功修饰在GNRs表面这一结论。由于GNRs制备完成后表面仍有用于稳定的阳离子表面活性剂CTAB，故GNRs显示出很强的正电荷。而在GNRs上对其进行PEG修饰，PEG的-SH能更稳定地结合GNRs表面位点，将CTAB置换下来，故此时纳米粒子GNRs-PEG的正电荷显著削弱。而聚乙烯亚胺(PEI)作为正电荷高分子，使得修饰有PEI的GNRs-PEG-TPEI的正电荷重新增强。

(6)稳定性测试：

由于GNRs-PEG-TPEI的荧光成像及拉曼检测是在含有肿瘤细胞的液体环境中完成的，为了维持细胞的完整性，液体环境需要具有一定的细胞渗透压条件。本实施例中采用浓度10mM的PBS缓冲液模拟该液体环境，通过将GNRs-PEG-TPEI分散于PBS缓冲液中24h来检测其在体内或体外检测中的稳定性。

检测结果如图10所示。上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI在10mM PBS溶液中可保持稳定，随着PBS浓度增大，GNRs-PEG-TPEI的稳定性逐渐降低，EP管底部出现少量沉淀。其原因是高浓度PBS缓冲液中的盐离子破坏了胶体粒子表面的水化层，使GNRs-PEG-TPEI发生聚沉。而10mM浓度PBS对GNRs-PEG-TPEI的影响不显著，说明该纳米粒子足可满足检测需求。

效果检测

(1)GNRs-PEG-TPEI与肿瘤细胞结合的荧光实验：

①细胞毒性测试：

为了将上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI用于细胞捕获及检测，首先应探索GNRs-PEG-TPEI对细胞没有毒性的浓度范围。在本实施例中，选择3种肿瘤细胞作为模型，分别为人乳腺癌细胞MCF-7、人结肠癌细胞Caco2、人肝癌细胞HepG2。

具体测试步骤为：

将细胞在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基中培养，培育温度为37℃，空气湿度95％，空气中CO₂含量为5％。取对数生长期的细胞分散在培养基中，细胞计数之后，以每孔约10000个细胞的密度将其接种于96孔板中，培养12h使其贴壁。将不同浓度的GNRs-PEG-TPEI加入96孔板，使GNRs-PEG-TPEI在体系中的最终浓度分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12mg/ml，分别孵育3、6、12h，MTT法测定细胞活性。

结果如图11所示。当GNRs-PEG-TPEI浓度为0.08mg/mL、细胞孵育时间为3h时，上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI对三种肿瘤细胞均没有显著的细胞毒性。考虑到GNRs-PEG-TPEI可以对肿瘤细胞进行快速成像和拉曼检测，不需要抗原抗体方法的长时间孵育，故选择0.08mg/ml浓度作为GNRs-PEG-TPEI检测肿瘤细胞的工作浓度。

②GNRs-PEG-TPEI与活细胞结合的荧光成像观察：

将MCF-7细胞以每孔10万的密度种植于共聚焦专用皿中，在培养12h后，加入细胞核染料Nuclear Red^TM LCS1(激发光622nm，发射光645nm)及细胞膜染料DiO(激发光484nm，发射光501nm)，37℃孵育20min，PBS洗涤三次后加入高糖DMEM无血清培养基继续培养12h。之后加入上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI(终浓度0.08mg/mL)，不洗去未结合纳米粒子，直接使用蔡司LSM880激光共聚焦显微镜拍摄。

结果如图12所示。在不洗去未结合纳米粒子的情况下，观察到GNRs-PEG-TPEI与MCF-7细胞膜结合，发出强烈的蓝色荧光，而背景中未结合的GNRs-PEG-TPEI荧光信号很弱。表明此方法用于细胞荧光成像时不需要用PBS反复洗去未与细胞结合的GNRs-PEG-TPEI，这种荧光“Turn-on”的探针相比常规的“Always-on”的探针在使用时更加方便，且不会造成由细胞损失而导致的结果假阴性。通过快速成像，可以清楚的看出GNRs-PEG-TPEI在5min后便大量地包裹在细胞膜外或者细胞膜上。相比需要长时间孵育的抗原抗体方法，该负电荷靶向的方法可以实现即时成像，能节约大量的时间成本。在模拟室温操作20min内，GNRs-PEG-TPEI不会发生细胞内吞情况。由于GNRs-PEG-TPEI是针对于肿瘤细胞进行捕获和初步检测，为保证可以对接后续的细胞再培养、基因检测，需要要求GNRs-PEG-TPEI仅与细胞膜结合，而不会被细胞迅速内吞而扰乱待检测细胞的正常生理活动。而上述结果完全满足该要求，使用共聚焦显微镜连续观察细胞至20min时，依然没有发生GNRs-PEG-TPEI内吞，说明GNRs-PEG-TPEI可完全适用于肿瘤细胞进行捕获和初步检测。

③GNRs-PEG-TPEI与肿瘤细胞的结合普适性测试：

将MCF-7细胞、Caco2细胞、HepG2细胞以每孔10万的密度分别种植于共聚焦专用皿中，Nuclear Red^TM LCS1染核，DiO染膜，加入GNRs-PEG-TPEI(终浓度0.08mg/ml)，5min后使用共聚焦显微镜观察。

结果如图13所示，GNRs-PEG-TPEI对3种肿瘤细胞均能实现细胞膜荧光成像，表明该方法对多种肿瘤细胞的识别具有普适性。

④GNRs-PEG-TPEI对肿瘤细胞和正常细胞的结合行为观察：

为了评价GNRs-PEG-TPEI对细胞的识别能力，将人正常结肠上皮细胞NCM460作为人结肠癌细胞Caco2的对照。

结果如图14所示。可以观察在同样的操作过程和拍摄参数下，GNRs-PEG-TPEI在NCM460细胞表面的聚集显著少于Caco2细胞，NCM460细胞膜上仅有微弱的荧光，这是因为正常细胞主要采用三羧酸循环的呼吸方式，不会产生大量乳酸，其细胞膜表面的负电荷较弱，GNRs-PEG-TPEI不易于受电荷影响聚集在正常细胞表面，表明该方法可以区分肿瘤细胞和正常细胞。

(2)GNRs-PEG-TPEI/4-ATP与肿瘤细胞结合的拉曼实验：

①GNRs-PEG-TPEI修饰：

在进行表面增强拉曼光谱分析时，发现GNRs-PEG-TPEI与细胞结合后其拉曼信号依然很弱，推测是由于PEI与PEG分子较大，不能使TPE与GNRs的距离缩短到可以产生SERS的程度。因此需要用拉曼信标分子将GNRs-PEG-TPEI进行标记，在本实施例中，选用的拉曼信标分子为对氨基苯硫酚(4-ATP)，当然，也可选用其他信标分子。

GNRs-PEG-TPEI/4-ATP的制备方法为：

将10μL的10μmol/L 4-ATP加入1mL的1mg/mL上述实施例制备得到的GNRs-PEG-TPEI溶液中，均匀混合后搅拌反应30min。为去除溶液中未吸附的4-ATP分子，防止其对接下来的SERS分析结果造成干扰，将得到的产物进行透析，透析袋截留分子量为8000Da，外相为双蒸水，每6h换水一次至透析结束，得到GNRs-PEG-TPEI/4-ATP水溶液，旋蒸浓缩至浓度为1mg/mL待用。

②激发光波长选择：

由于GNRs-PEG-TPEI/4-ATP结合细胞后会产生蓝色荧光，干扰拉曼信号，因此，选择的拉曼激发光波长以不能激发TPE荧光为宜。同时，还需要考虑当拉曼激发光波长接近GNRs-PEG-TPEI紫外扫描图谱中的LSPR峰时，GNRs会与激发光发生耦合，增强拉曼信号，因此，选择785nm作为拉曼激发光光源。

③GNRs-PEG-TPEI拉曼增强性质检测：

将Caco2细胞用胰蛋白酶消化处理，重悬分散在PBS中。将分散好的细胞分别与GNRs-PEG-TPEI/4-ATP溶液和游离4-ATP溶液混匀，孵育5min。分别取孵育后的溶液，滴于石英玻片上，静置待细胞铺平，在显微镜视野下找到单个细胞。使用显微共聚焦激光拉曼光谱仪进行SERS光谱检测，以785nm激光作为激发光源。以MCF-7细胞作为对照。

结果如图15所示，在两种肿瘤细胞模型(Caco2、MCF-7)下，GNRs-PEG-TPEI/4-ATP与细胞孵育产生的拉曼信号均强于游离4-ATP直接与肿瘤细胞孵育，即GNRs-PEG-TPEI可作为拉曼增强基底。原因在于GNRs-PEG-TPEI能与表面带有负电荷网络的肿瘤细胞结合，大量的GNRs-PEG-TPEI聚集在细胞表面，产生SERS活性位点，导致电磁场增强效应，从而使4-ATP的拉曼信号得到显著增强，实现对肿瘤细胞的拉曼检测。

④GNRs-PEG-TPEI/4-ATP对肿瘤细胞和正常细胞的拉曼光谱检测

为了考查GNRs-PEG-TPEI/4-ATP对肿瘤细胞和正常细胞的拉曼光谱，采用上述实施例中同样的操作过程和拍摄参数，分析肿瘤细胞Caco2、MCF-7、HepG2和正常细胞NCM460的拉曼信号。

结果如图16所示，正常细胞NCM460与GNRs-PEG-TPEI/4-ATP孵育后不能表现出明显的4-ATP拉曼特征峰，而3种肿瘤细胞的拉曼信号均显著强于正常细胞，表明GNRs-PEG-TPEI/4-ATP可与表面负电荷更强的肿瘤细胞大量结合，产生拉曼活性位点，增强4-ATP拉曼信号，这一方法对多种肿瘤细胞具有普适性。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种CTC捕获材料，其特征在于，所述CTC捕获材料由纳米材料、聚集诱导发光分子、带有正电荷的高分子化合物和连接体制得；

所述聚集诱导发光分子修饰有-CHO基团；

所述连接体修饰有-CHO基团和-SH基团；

其中，所述带有正电荷的高分子化合物的一氨基连接于所述聚集诱导发光分子的-CHO端；

所述带有正电荷的高分子化合物的另一氨基连接于所述连接体的-CHO端；

所述连接体的-SH基团连接在所述纳米材料表面。

2.根据权利要求1所述的CTC捕获材料，其特征在于，所述纳米材料包括纳米金，所述纳米材料优选为金纳米棒。

3.根据权利要求1所述的CTC捕获材料，其特征在于，所述聚集诱导发光分子包括四苯基乙烯或其衍生物。

4.根据权利要求1所述的CTC捕获材料，其特征在于，所述连接体包括聚乙二醇。

5.根据权利要求1～4一项所述的CTC捕获材料，其特征在于，所述CTC捕获材料带正电荷，呈棒状，长径比为2～4。

6.一种CTC捕获材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将聚集诱导发光分子和带有正电荷的高分子化合物混合，加入二甲基亚砜，反应22～26h，透析，得到聚集诱导发光分子-正电荷高分子复合物；

(2)将步骤(1)制得的聚集诱导发光分子-正电荷高分子复合物与连接体混合物，反应10～14h，加入纳米材料，反应14～18h，透析，即得；

其中，所述聚集诱导发光分子修饰有-CHO基团；

所述连接体修饰有-CHO基团和-SH基团。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述纳米材料包括纳米金，所述纳米材料优选为金纳米棒；所述聚集诱导发光分子包括四苯基乙烯；所述连接体包括聚乙二醇。

8.权利要求1～5任一项所述CTC捕获材料或权利要求6或7所述制备方法制备得到的CTC捕获材料在制备肿瘤检测试剂中的应用。

9.一种诊断制剂，其特征在于，所述诊断制剂中含有权利要求1～5任一项所述CTC捕获材料或权利要求6或7所述制备方法制备得到的CTC捕获材料。

10.一种诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒中含有权利要求9所述的诊断制剂。

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