CN107917869A - 体液样本中稀有肿瘤细胞的检测分型方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对体液样本中高代谢活性稀有肿瘤细胞的检测分型方法，包括如下步骤：将体液样本中的有核细胞与能够产生荧光信号的第一代谢标志物和第二代谢标志物共同孵育；通过高通量成像检测所有细胞所摄取代谢标志物的荧光信号，从而确定所述细胞的能量代谢方式与强度；根据代谢标志物组合的荧光信号鉴定体液样本中具有高代谢活性的肿瘤细胞并进行分型。本发明还提供了用于上述检测分型的试剂盒，包括微孔阵列芯片；能够产生荧光信号的第一代谢标志物和第二代谢标志物；针对白细胞表面共同抗原的荧光修饰抗体。本发明基于荧光信号特征来鉴定与分型体液样本中的稀有肿瘤细胞的能量代谢方式，操作简单快速，大大降低了损失稀有肿瘤细胞的可能。

Description

体液样本中稀有肿瘤细胞的检测分型方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及对癌症患者体液(如血液、胸水、腹水、脑脊液等)样本中高代谢活性的稀有肿瘤细胞进行基于能量代谢方式的功能分型的方法。本发明还涉及用于癌症患者体液样本中高代谢活性稀有肿瘤细胞检测分型的试剂盒。

背景技术

恶性肿瘤在播散、侵袭、转移的过程中常伴有肿瘤细胞进入体液，如血液、胸水、腹水、脑脊液等。因此，在这些体液样本中找到肿瘤细胞是判定肿瘤存在、甚至转移的可视化的、高级别的证据，具有明确的临床意义。但是，这些体液样本中的肿瘤细胞不但数量稀少，而且往往具有异质性，这种异质性不但表现在基因组、转录组层面，更明显的表现在功能层面。比如，癌症转移是一个低效的过程，只有极少数播散进入体液的肿瘤细胞能够最终成功形成转移灶，大部分肿瘤细胞在体液中由于失巢凋亡而不再具有活性及转移能力。因此，即使这些肿瘤细胞在基因组层面上没有明显区别，但显然在功能层面上并不相同，而这种功能上的不同直接影响转移是否成功以及患者的临床结局。癌症临床研究的一个重要课题就是发现能够引起远处转移的肿瘤细胞子群，这些肿瘤细胞能够在血液、胸水、脑脊液等体液中存活下来并能够有效的形成远处转移，因此对体液中的稀有肿瘤细胞进行功能评估并进一步分型至关重要，而分型的目的在于研究具有不同功能特征的肿瘤细胞子群的恶性程度与转移潜能，并进一步据此来对患者进行预后判断。

在复杂的生物液体样本中鉴定稀有肿瘤细胞并进行功能评估是非常具有挑战的工作。肿瘤细胞稀有意味着须采用具有单细胞精度的检测方法。目前在体液样本中鉴定脱落肿瘤细胞主要依赖于细胞学检查，基于肿瘤细胞的形态学特征进行鉴定，并进一步结合免疫组化明确其器官来源和病理分型，费时费力且有较高的专业要求。美国麻省理工学院的Robert A.Weinberg教授在2011年总结了肿瘤细胞的十大基本特征("Hallmarks ofCancer:The Next Generation",Cell,2011,144,646)，包括维持增殖信号，逃避生长抑制，抑制细胞死亡，无限自我复制，诱导血管生成，激活浸润转移，避免免疫损伤，促进肿瘤炎症，能量代谢异常以及基因组不稳定等。这些基本特征能够有效地鉴别恶性细胞，但大部分与功能相关，其中除了“能量代谢异常”这一特征以外，其他特征均难以方便地在单细胞尺度上进行高通量的检测。

肿瘤细胞具有不同于正常细胞的能量代谢途径，这一现象首先被OttoWarburg观察到。Waruburg发现，即使在氧气存在的情况下，肿瘤细胞仍主要以糖酵解的方式进行能量代谢，其摄取的葡萄糖大大高于正常细胞，这一效应被称为Warburg效应，Warburg也因此获得1931年的诺贝尔奖。Warburg效应在临床上已有广泛应用，通过将带有放射性标记的葡萄糖类似物(¹⁸F-FDG，即2-氟-2-脱氧-D-葡萄糖，简称FDG)作为示踪剂，应用正电子发射断层摄影术(PET/CT)可以非侵袭性、可视化灵敏检测体内高葡萄糖摄取的恶性组织，从而发现肿瘤原位及转移病灶。在体外检测中，同样可以用该放射性标记的葡萄糖类似物来鉴定恶性肿瘤细胞，同时也可以用荧光标记的葡萄糖类似物进行检测。进一步的研究发现，肿瘤细胞存在多种营养物质来源，除了葡萄糖以外，还对谷氨酰胺也特别上瘾，因此可以通过不同的代谢标志物来检测肿瘤细胞的不同代谢方式。

因此，如何实现对大量细胞的高通量检测，并通过检测体液样本中所有细胞的能量代谢情况来鉴定其中稀有的肿瘤细胞，尤其是进一步根据其代谢方式对这些肿瘤细胞进行分型，具有十分重要的理论和现实意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效、快速地检测癌症患者体液样本中稀有肿瘤细胞能量代谢方式与强度的方法，并根据高代谢活性肿瘤细胞的能量代谢特征对其进行功能分型，其中不同的功能子群具有不同的恶性程度与转移潜能，因此能够进一步根据不同功能子群细胞的数目对癌症患者进行预后判断与生存期预测。

本发明所针对的是癌症患者体液样本中稀有肿瘤细胞的一个子群，即高代谢活性的肿瘤细胞。众所周知，肿瘤组织中的细胞从原位脱落、播散进入体液，如血液、胸水、腹水、脑脊液等，可形成肿瘤的远处转移。但同时，转移是一个低效的过程，只有极少数播散进入体液的肿瘤细胞能够最终成功形成转移灶，大部分肿瘤细胞在体液中由于失巢凋亡而不再具有活性及转移能力。本发明所关注的对象正是体液样本中具有高度代谢活性的肿瘤细胞。在之前的专利申请中(申请号：201610285622.2)，我们提出可以使用一种荧光标记的葡萄糖类似物(如2-NBDG)来鉴定体液样本中高葡萄糖摄取的肿瘤细胞。由于恶性肿瘤存在多种能量来源，葡萄糖是其中最为常见的一种，高葡萄糖摄取的肿瘤细胞也是肿瘤细胞中最为常见的子群，但仍然存在采用其他能量来源、采取其他能量代谢方式的肿瘤细胞。本专利申请的目的并非通过代谢标志物鉴定肿瘤细胞，而是采用两种不同的代谢标志物分别计数具有不同能量代谢方式的高代谢活性肿瘤细胞的数目，这一数目代表了体液样本中具有不同能量代谢方式，或者说不同的恶性程度与转移潜能的肿瘤细胞子群的数量，可用于癌症患者的预后判断与生存期预测。下面所发明的内容作一具体的说明。

由于放射性标记的葡萄糖类似物FDG已被广泛用于临床检测体内高葡萄糖摄取的恶性组织，但由于放射性标记的葡萄糖类似物的空间分辨率较低且存在放射性，难以用于在体外对大量细胞进行高通量葡萄糖摄取能力的检测。本发明采用荧光标记的葡萄糖类似物(如2-NBDG)在体外对大量细胞的葡萄糖摄取能力进行高通量检测。另一方面，本发明还引入其他的代谢标志物对肿瘤细胞除葡萄糖以外的其他的能量代谢方式进行表征，如氧化还原标志物刃天青，用于检测肿瘤细胞糖酵解时积累的大量还原性物质。这样一来，我们就能够计数主要基于葡萄糖代谢和非葡萄糖代谢的两类高代谢活性肿瘤细胞的数目。同时，本发明还引入了白细胞共同抗原CD45作为排除标志物，其作用是一方面排除样本中大多数的白细胞，另一方面是通过CD45阳性的白细胞的2-NBDG与刃天青的荧光值来确定2-NBDG与刃天青的阳性截取值，从而鉴定高代谢活性的肿瘤细胞。

在本发明中，通过2-NBDG与刃天青将高代谢活性的肿瘤细胞分成两个功能子群。它们分别采取了不同的能量代谢方式，其中一群是CD45阴性、2-NBDG阳性的、主要以葡萄糖为能量来源的肿瘤细胞，另一群则是CD45阴性、刃天青阳性、2-NBDG阴性的，主要以葡萄糖以外能量物质为来源的肿瘤细胞，这两群细胞的数目反映了原位肿瘤的恶性程度与转移能力，可用于癌症患者的预后与生存期预测。

具体实验方法是将少量体液样本(1-10mL，如血液、胸水或脑脊液)在除去红细胞后与荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG、刃天青以及荧光标记的CD45抗体孵育，然后将所有细胞铺在包含数十万微孔的芯片上，通过高内涵设备进行多通道快速成像，并进一步通过程序分析确定2-NBDG与刃天青的阳性截取值，从而鉴定所有CD45阴性、2-NBDG或刃天青阳性的细胞为高代谢活性肿瘤细胞，最后根据2-NBDG或刃天青的荧光特征对这些高代谢活性肿瘤细胞进行分型，简单的说就是分成两群细胞，一群是CD45阴性、2-NBDG阳性(高摄取)的子群，另一群则是CD45阴性、刃天青阳性(高摄取)、2-NBDG阴性(低摄取)的子群。

我们通过单细胞测序首先证明了这些CD45阴性、2-NBDG或刃天青阳性的高代谢活性的肿瘤细胞的确是肿瘤细胞。我们通过显微操作设备将这些高代谢活性的细胞一一取出进行单细胞DNA测序，主要包括驱动基因突变的检测以及拷贝数变异(copy numbervariation,CNV)的检测。实验结果表明，对于肺腺癌患者的血液、胸水及脑脊液样本中，超过70％的疑似肿瘤细胞均检测到了与原位肿瘤细胞一致的驱动基因突变(EGFR、KRAS等)，剩余没有驱动基因突变的细胞也可以通过拷贝数变异确定为肿瘤细胞。在部分传统细胞学检查阴性或无法确诊的样本中，该方法能够有效找到肿瘤细胞并通过测序加以确认。基于代谢标志物筛选到的高代谢活性肿瘤细胞具有高度活性，是具有转移潜能的肿瘤细胞，而具有不同能量代谢特征的肿瘤细胞在驱动基因突变方面并无不同，但进一步的拷贝数变异分析显示这两个能量代谢方式不同的肿瘤细胞子群在基因的扩增和缺失方面具有不同之处，代表了它们在转移潜能、耐药等方面的不同。

本发明所采用的基于能量代谢方式的肿瘤细胞鉴定与分型方法，即高葡萄糖或刃天青摄取且细胞表面不表达白细胞共同抗原CD45是肿瘤细胞所具有的普遍特征，不依赖于肿瘤细胞的尺寸、表面抗原表达情况等，因此是一种简单快速的肿瘤细胞鉴定方法，并可进一步根据葡萄糖或刃天青的摄取特征来分类具有不同能量代谢特征的稀有肿瘤细胞。本发明所采用的方法使用高速荧光成像系统能够对大量细胞进行快速检测，因此使得不对体液样本中的稀有肿瘤细胞进行富集成为可能，即能够对体液样本中的所有有核细胞进行检测，从而避免富集步骤导致的稀有肿瘤细胞的损失。同时葡萄糖和刃天青摄取以及对细胞表面膜蛋白CD45的检测不影响细胞活性，能够用于后续的单细胞基因组、转录组测序及体外培养等用途。细胞采用可寻址的方式排列能够方便的找到肿瘤细胞并取出。

发明人根据上述发现，完成本发明。

本发明的第一方面，提供了一种对体液样本中稀有肿瘤细胞的检测分型方法，包括如下步骤：

步骤A，将体液样本中的有核细胞与能够产生荧光信号的第一代谢标志物和能够产生荧光信号的第二代谢标志物孵育；

步骤B，通过高通量成像检测所有细胞所摄取代谢标志物的荧光信号，从而确定所述细胞的能量代谢方式与强度；

步骤C，根据代谢标志物组合的荧光信号鉴定体液样本中的肿瘤细胞并进行分型；

所述能够产生荧光信号的第一代谢标志物为荧光标记的葡萄糖类似物，优选2-NBDG，所述能够产生荧光信号的第二代谢标志物为刃天青。

所述能够产生荧光信号的代谢标志物是指该标志物被荧光基团标记并可大量被肿瘤细胞摄取或该标志物本身不产生荧光信号但可在肿瘤细胞中大量与代谢相关分子反应而转变为能够产生荧光信号的状态。本发明采用荧光标记的葡萄糖类似物和刃天青两种代谢标志物复合使用。对所述荧光标记的葡萄糖类似物的摄取量高，就表示该肿瘤细胞的恶性程度与转移潜能高。对所述刃天青的摄取量高，就表示该肿瘤细胞的恶性程度与转移潜能高。

优选的，所述体液样本选自血液、胸水、腹水或脑脊液的一种。

优选的，在步骤A中，所述体液样本中的有核细胞与能够产生荧光信号的代谢标志物孵育的时间为2分钟至2小时，更佳地为5分钟至30分钟。

在另一优选例中，在步骤A中，还包括加入针对白细胞表面共同抗原的荧光修饰抗体，以识别白细胞，从而将肿瘤细胞与白细胞区分开。

优选的，所述针对白细胞表面共同抗原的荧光修饰抗体是Allophycocyanin，anti-CD45-APC，即APC标记的CD45抗体。所述针对白细胞表面共同抗原的荧光修饰抗体所带荧光与所述能够产生荧光信号的代谢标志物所带荧光互不干扰。

在另一优选例中，在步骤A中，还包括加入牛血清白蛋白，对细胞、微孔芯片进行封闭，从而进一步消除对荧光标记的葡萄糖类似物(如2-NBDG)的非特异性吸附。

在另一优选例中，在步骤A中，可对肿瘤患者体液样本中的稀有肿瘤细胞进行富集，以提高肿瘤细胞的浓度，所述的富集方法包括但不限于抗体标记的免疫磁珠、滤膜等。例如可以使用免疫磁珠法对体液样本中的稀有肿瘤细胞进行富集，其中免疫磁珠上负载有与肿瘤表面抗原特异性结合的抗体或与白细胞表面抗原特异性结合的抗体。

在另一优选例中，在步骤A中，将体液样本中的所述有核细胞加到微孔阵列芯片，使所述有核细胞进入微孔，从而保证在所述高通量成像检测时细胞不丢失。

在另一优选例中，在步骤B中，还包括与参考值或标准曲线进行比较，从而定性或定量地确定所述肿瘤细胞代谢活动水平。

在另一优选例中，在步骤C中，还包括根据两种或多种代谢标志物所显示肿瘤细胞能量代谢特征的不同来对所述肿瘤细胞进行分型。

本发明的第二方面，提供了一种用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测分型的试剂盒，所述试剂盒包括：

a、微孔阵列芯片，所述芯片包括多个用于容纳细胞且可以被寻址的微孔；

b、能够产生荧光信号的第一代谢标志物；

c、能够产生荧光信号的第二代谢标志物；

d、针对白细胞表面共同抗原的荧光修饰抗体，用于标记样本中的白细胞。

优选的，所述能够产生荧光信号的第一代谢标志物为荧光标记的葡萄糖类似物，优选2-NBDG，所述能够产生荧光信号的第二代谢标志物为刃天青，所述针对白细胞表面共同抗原的荧光修饰抗体为APC标记的CD45抗体。上述针对白细胞表面共同抗原的抗体所带荧光与所述能够产生荧光信号的第一代谢标志物和第二代谢标志物所带荧光互不干扰。

优选的，所述微孔阵列芯片上微孔的数目为0.5万至50万个，更佳的是15-25万个。

在另一优选例中，所述微孔阵列芯片上微孔的底部是封闭的或有一个尺寸不超级5微米的孔。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

(a)本发明方法可以低成本的、快速、准确地检测体液样本中极少数目的肿瘤细胞的能量代谢方式并对其进行功能分型。本发明方法不仅能够对具有代谢活性的肿瘤细胞进行计数，而且能够识别具有高度活性与恶性的肿瘤细胞，为进一步的针对这些肿瘤细胞进行分子检测提供基础。

(b)本发明通过微孔阵列芯片确保了极少数目的肿瘤细胞在整个代谢活性检测过程中不被丢失，这是稀有细胞检测的瓶颈所在。由于鉴定方法简单且可与高速荧光成像系统相结合，因而能够快速筛查大量细胞，使得在复杂样本中不富集直接鉴定稀有肿瘤细胞成为可能。传统的稀有肿瘤细胞富集方法操作复杂且损失较多肿瘤细胞，而本发明方法中摒弃了传统的对血液或胸水中稀有肿瘤细胞先富集后检测的方法，通过大量可寻址的微孔容纳所有细胞，并通过快速简单的荧光标记方法和高速荧光成像从而从非常大数目的细胞中快速鉴定稀有肿瘤细胞，整个操作简单快速，且由于不富集因此极少损失肿瘤细胞。此外，本发明方法直接鉴定具有高度活性与恶性的肿瘤细胞，为后续进一步的分子检测如测序提供了良好的基础。

(c)本发明提供了一种针对稀有肿瘤细胞功能的表征手段。这些从原位肿瘤组织脱落进入体液的肿瘤细胞不但代表了原位肿瘤病灶的分子特征，同时也是肿瘤远处转移的直接来源。即使这些稀有肿瘤细胞具有相似的基因组特征，它们本身却存在着巨大的功能异质性，表现在活性、恶性程度、转移潜能上，比如其中相当部分肿瘤细胞处于凋亡状态，很小一部分具有高度活性与转移潜能的肿瘤细胞最终能够形成转移灶。直接对体液样本中的稀有肿瘤细胞进行功能表征有助于了解原发肿瘤的状态以及评估它们的恶性程度和转移潜能。本发明提供了针对稀有肿瘤细胞能量代谢方式的检测简单、廉价、可靠，并可进一步对它们进行能量代谢方式的分型，以便于计数具有特征性能量代谢方式与强度的肿瘤细胞并对其进行进一步的分子检测，如基因组、转录组的检测。

附图说明

图1是一个微孔阵列芯片中某一编号区域的显微镜照片，编号的目的在于方便的定位细胞在芯片上的位置。该微孔阵列芯片有400～2500组这样的编号区域，共计100000～500000个微孔。

图2是对本发明实施例的一个芯片上所有CD45阴性细胞的2-NBDG以及刃天青摄取荧光值的散点图，图中的两条直线分别代表了2-NBDG和刃天青高摄取的截取值，其中确定2-NBDG截取值的方法是CD45阳性细胞2-NBDG摄取值的平均值加5倍标准差，确定刃天青截取值的方法是CD45阳性细胞刃天青摄取值的平均值加3倍标准差。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种基于能量代谢方式检测肿瘤患者体液样本中稀有肿瘤细胞并对其进行功能分型的方法，而具有不同能量代谢方式的肿瘤细胞具有不同的恶性程度与转移潜能。

研究表明肿瘤细胞代谢的特点是用高水平的有氧糖酵解替代正常组织细胞的氧化磷酸化。由于糖酵解的效率较低，因此肿瘤细胞需要摄取大量葡萄糖。进一步研究发现，除了葡萄糖以外，肿瘤细胞还可能有其他的能量物质来源，如谷氨酰胺，在细胞积聚大量还原性酶。在本发明中，根据肿瘤细胞摄取葡萄糖的能力或还原刃天青的能力大大高于正常细胞的生物学原理来鉴定体液样本中的稀有肿瘤细胞。为了提高鉴定的特异性，本发明中进一步使用了白细胞表面标志物CD45来排除白细胞。由于2-NBDG和刃天青都能产生荧光信号，因此在高速荧光成像设备的帮助下可以在短时间内鉴定非常大数目的细胞，因此本发明不需要像已经报道的方法那样先对体液样本中的稀有肿瘤细胞进行复杂的富集过程。对于如胸水、脑脊液之类的体液样本，由于其总的细胞数目较少，可以无需富集肿瘤细胞直接进行检测。而对于血液样本，可以在裂解除去红细胞后通过简单的标记CD45抗体的磁球负选以减少细胞的数目，然后再进行检测。如果血液样本较少或CTC数目较多，可以无需负选直接检测。

本发明所描述的方法与临床上已经使用的通过一种放射性葡萄糖类似物(¹⁸F-FDG，2-Fluorine-18-Fluoro-2-deeoxy-D-glucose，2-氟-18-氟-2-脱氧-D-葡萄糖)探测组织对葡萄糖摄取的肿瘤影像学检测方法有类似之处。¹⁸F-FDG通过葡萄糖转运蛋白输运进入细胞，在己糖激酶(hexokinase)作用下磷酸化，生成6-PO₄-¹⁸F-FDG并积累在细胞中可被正电子发射成像(PET，Positron Emissioncomputed Tomography)所检测。因此，基于放射性葡萄糖类似物¹⁸F-FDG的PET成像可用于显示肿瘤的部位、形态、大小、数量及肿瘤内的放射性分布，临床上主要用于恶性肿瘤的诊断及良、恶性的鉴别诊断、临床分期、评价疗效及监测复发等。绝大多数良性病灶不摄取或轻度摄取¹⁸F-FDG。临床上使用SUV(standard uptakevalue，标准摄取值)这一半定量治疗来衡量病灶摄取¹⁸F-FDG的量并鉴定组织的良恶性，一般SUV>2.5考虑为恶性肿瘤，SUV<2.0可以考虑为良性病变。

就肿瘤细胞而言，其具有各种不同的表型、基因特征和代谢方式。在本发明中，所采用两种或更多种代谢标志物来共同检测肿瘤细胞的特征代谢方式，这些代谢方式与恶性程度和转移潜能密切相关，相比其他分子特征，可以更简单、合理地反映肿瘤细胞的恶性程度和转移潜能。

术语：

本文中，“2-NBDG”指(2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose)即(2-(N-(7-硝基苯并-2-噁-1,3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)，它是一种带有荧光标记的葡萄糖类似物，可用于检测细胞对于葡萄糖的摄取。

“刃天青”指7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one 10-oxide，即7-羟基-3-羰基-10-氧化-三氢吩恶嗪，英文名为Resazurin，它是一种只有微弱荧光的蓝色染料，但可被不可逆的还原成具有强烈红色荧光的试卤灵(英文名为resorufin)，可用于检测细胞内的还原性酶。

“2-NBDG高摄取”指该细胞所摄取的2-NBDG的量高于样本中白细胞摄取2-NBDG量的平均值加五倍的标准差。

“刃天青高摄取”指该细胞将其摄取的刃天青还原为荧光形式的量高于样本中白细胞摄取并还原刃天青量的平均值加三倍的标准差。

下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。在实施例中，所有培养基、细胞系、抗体等均为市售购得。

实施例

肺癌患者胸水样本中稀有肿瘤细胞的2-NBDG与刃天青摄取检测

提供一微孔阵列PDMS芯片，其结构如图1所示，包含400个编号区域，每个区域约包含350个直径为25微米的微孔，共计14万个微孔，能够容纳约60万个有核细胞。

本实施例中，方法包括以下步骤：

(1)将5毫升肺癌患者胸水离心(500g，5分钟)分离出细胞，使用BD公司的红细胞裂解液去除红细胞，用Hank平衡盐溶液(HBSS)重悬并洗涤细胞，最终重悬于500微升HBSS中；

(2)在500微升细胞悬液(约100万个细胞)中加入2微升APC标记的CD45抗体在翻转仪上翻转孵育1小时；

(3)离心，弃去上清液后用HBSS稀释细胞，并将细胞悬液滴加在2块微孔阵列芯片上，静置10分钟，芯片的显微镜明场图片如图1所示，细胞基本均在微孔内，但由于部分白细胞尺寸较小，部分微孔内有多于一个的细胞；

(4)吸去芯片表面溶液，每块芯片上加入荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG(400μM)以及刃天青(1μM)，37度培养箱静置15min；

(5)孵育结束后，用冰PBS清洗芯片8遍，并用高速荧光成像设备成像并记录每个细胞2-NBDG、刃天青和CD45的荧光值。

根据CD45阳性的白细胞的2-NBDG以及刃天青的荧光值可以计算得到2-NBDG和刃天青的截取值，高于此截取值的即为高代谢活性细胞。图2为所有CD45阴性细胞2-NBDG和刃天青摄取值的散点图，根据截取值可将CD45阴性细胞划分为4个子群，即CD45阴性/刃天青高的细胞子群，CD45阴性/2-NBDG高的细胞子群，CD45阴性/刃天青、2-NBDG均高的细胞子群，CD45阴性/刃天青、2-NBDG均低的细胞子群。其中，刃天青与2-NBDG高摄取的定义已在“术语”中说明。将前三种子群(CD45阴性/刃天青高的细胞子群，CD45阴性/2-NBDG高的细胞子群，CD45阴性/刃天青、2-NBDG均高的细胞子群)中的细胞一一取出进行单细胞测序并于原位组织对照，发现这些细胞大部分具有与原位组织一致的EGFR 19del突变，其中10个CD45阴性/刃天青高的细胞中有7个具有EGFR19del突变，20个CD45阴性/2-NBDG高的细胞中有16个具有EGFR 19del突变，4个CD45阴性/刃天青、2-NBDG均高的细胞中有3个具有EGFR19del突变。这些具有EGFR 19del突变的细胞均为肿瘤细胞，而8个未检测到EGFR 19del突变的细胞通过基因组拷贝数变异检测发现存在大片段的基因扩增与缺失，符合肿瘤细胞的特征。而CD45阴性/刃天青、2-NBDG均低的细胞中有较大比例并非肿瘤细胞，且有大量细胞无法成功进行单细胞基因组测序，可能与细胞处于凋亡状态有关。

在多个肺癌患者样本中均发现了两种不同的代谢方式的细胞，其数目及相对比例各不相同，而对两种代谢方式肿瘤细胞的进一步基因组拷贝数变异分析发现，这两类肿瘤细胞在拷贝数变异方面存在差异，具体表现为葡萄糖高摄取细胞一般都具有PIK3CA基因的扩增、PTEN基因的缺失，而刃天青高摄取细胞往往具有MYC基因的扩增。这种基因组层面上的差异反映了两类细胞在信号通路激活方式上的不同以及在转移潜能、耐药等方面的差异。

目前，在临床上通过使用可被肿瘤细胞吞噬或吞食的放射性物质，通过放射性物质的PET成像可用于显示肿瘤的部位、形态、大小、数量及肿瘤内的放射性分布，临床上主要用于恶性肿瘤的诊断及良、恶性的鉴别诊断、临床分期、评价疗效及监测复发等。

本发明通过经标记的葡萄糖类似物来定量检测稀有肿瘤细胞的葡萄糖摄取能力，如荧光基团标记的D型葡萄糖类似物2-NBDG，它具有与D型葡萄糖相似的代谢途径，通过葡萄糖转运蛋白(GLUT)进入细胞内，然后其C-6位置被己糖激酶磷酸化。研究已显示，相比于良性细胞，2-NBDG可被恶性肿瘤细胞快速摄取，因此是一种检测恶性肿瘤细胞的光学标志物。

部分肿瘤细胞还存在其他能量物质的来源，但高强度的糖酵解过程使肿瘤细胞内部积聚了大量还原性酶，这些酶能够快速还原无荧光信号的刃天青至有荧光信号的氧化形式，从而定量表征细胞内部还原性酶的量，从而检测糖酵解的强度。

本发明基于具有荧光信号的葡萄糖类似物与糖酵解相关还原酶检测方法与试剂盒来检测肿瘤患者体液样本中极为稀有的肿瘤细胞的能量代谢方式与强度，从而可对这些肿瘤细胞进行能量代谢功能的分型，从而有效选出恶性程度高、转移潜能大的肿瘤细胞。

应理解，上述实施例仅用于说明本发明而不应限制本发明的范围，本领域技术人员可以基于本发明揭示的原理和公开的内容，对本发明作各种变动或修改，这些等价形式同样落入本申请权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种对体液样本中高代谢活性稀有肿瘤细胞的非诊断性的检测分型方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤A，将体液样本中的有核细胞与能够产生荧光信号的第一代谢标志物和能够产生荧光信号的第二代谢标志物共同孵育；

步骤B，通过高通量成像检测所有细胞所摄取代谢标志物的荧光信号，从而确定所述细胞的能量代谢方式与强度；

步骤C，根据代谢标志物组合的荧光信号鉴定体液样本中高代谢活性的肿瘤细胞并进行基于代谢方式的分型；

所述能够产生荧光信号的第一代谢标志物为荧光标记的葡萄糖类似物，所述能够产生荧光信号的第二代谢标志物为氧化还原标志物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体液样本选自血液、胸水、腹水或脑脊液的一种，所述体液样本中的有核细胞与能够产生荧光信号的代谢标志物孵育的时间为2分钟至2小时。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光标记的葡萄糖类似物是2-NBDG，所述能产生荧光信号的氧化还原标志物为刃天青。

4.如权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在步骤A中，还包括加入针对白细胞表面共同抗原的荧光修饰抗体。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤A中，还包括加入APC标记的CD45抗体。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤A中，将体液样本中的所述有核细胞加到微孔阵列芯片，所述芯片包括多个用于容纳细胞且可以被寻址的微孔。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，鉴别高代谢肿瘤细胞的2-NBDG的阳性截取值为所有CD45阳性细胞2-NBDG荧光值平均值加5倍标准差，刃天青的阳性截取值为所有CD45阳性细胞刃天青荧光值平均值加3倍标准差。

8.一种用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

a、微孔阵列芯片，所述芯片包括多个用于容纳细胞且可以被寻址的微孔；

b、能够产生荧光信号的第一代谢标志物；

c、能够产生荧光信号的第二代谢标志物；

d、针对白细胞表面共同抗原的荧光修饰抗体，用于标记样本中的白细胞；

所述能够产生荧光信号的第一代谢标志物为荧光标记的葡萄糖类似物，所述能够产生荧光信号的第二代谢标志物为氧化还原标志物，所述针对白细胞表面共同抗原的荧光修饰抗体为APC标记的CD45抗体。

9.如权利要求8所述的用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测分型的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记的葡萄糖类似物是2-NBDG，所述氧化还原标志物为刃天青。

10.如权利要求8所述的用于体液样本中稀有肿瘤细胞检测分型的试剂盒，其特征在于，所述微孔阵列芯片上微孔的数目为0.5万至50万个，所述微孔阵列芯片上微孔的底部是封闭的或有一个或多个尺寸为5微米至10微米的微孔。