CN115453117B - 纳米复合材料及其制备方法、免疫传感器及其检测方法 - Google Patents
纳米复合材料及其制备方法、免疫传感器及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115453117B CN115453117B CN202211156391.7A CN202211156391A CN115453117B CN 115453117 B CN115453117 B CN 115453117B CN 202211156391 A CN202211156391 A CN 202211156391A CN 115453117 B CN115453117 B CN 115453117B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pdcu
- cona
- hrp
- nanocomposite
- hydrogel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000002114 nanocomposite Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 29
- 239000000463 material Substances 0.000 title abstract description 26
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 claims abstract description 49
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 claims abstract description 37
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 30
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 claims description 18
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 101150003085 Pdcl gene Proteins 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 12
- 239000012621 metal-organic framework Substances 0.000 abstract description 12
- 238000011068 loading method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 abstract description 7
- 108010029541 Laccase Proteins 0.000 abstract description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 abstract description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 abstract 1
- 210000005266 circulating tumour cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 27
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 24
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 21
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 14
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 12
- NUKYPUAOHBNCPY-UHFFFAOYSA-N 4-aminopyridine Chemical compound NC1=CC=NC=C1 NUKYPUAOHBNCPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229960004979 fampridine Drugs 0.000 description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 10
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 9
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 9
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 9
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 9
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 6
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 6
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical group CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 4
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 description 4
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 4
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- KUCOHFSKRZZVRO-UHFFFAOYSA-N terephthalaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=C(C=O)C=C1 KUCOHFSKRZZVRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- QHQSCKLPDVSEBJ-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-tri(4-aminophenyl)benzene Chemical compound C1=CC(N)=CC=C1C1=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 QHQSCKLPDVSEBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 229940044631 ferric chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- NQXWGWZJXJUMQB-UHFFFAOYSA-K iron trichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Cl-].Cl[Fe+]Cl NQXWGWZJXJUMQB-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 2
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 2
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 2
- HFZWRUODUSTPEG-UHFFFAOYSA-N 2,4-dichlorophenol Chemical compound OC1=CC=C(Cl)C=C1Cl HFZWRUODUSTPEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]ethanone Chemical compound C1CN(CC2=NNN=C21)CC(=O)N3CCN(CC3)C4=CN=C(N=C4)NCC5=CC(=CC=C5)OC(F)(F)F LDXJRKWFNNFDSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 244000132059 Carica parviflora Species 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 229910001308 Zinc ferrite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002081 peroxide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54346—Nanoparticles
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- Zoology (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Virology (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种纳米复合材料及其制备方法,涉及生物检测技术领域,其将HRP与CuO2结合,装载入金属有机框架材料中,利用金属有机框架材料提高其负载能力、酶活性和稳定性,再利用ConA与循环肿瘤细胞的特异性结合,使其具备分离、捕获循环肿瘤细胞的能力。此外,本发明实施例还提供了利用上述纳米复合材料制备而成的免疫传感器及其检测方法,其利用抗体偶联的磁性纳米材料与循环肿瘤细胞的特异性结合,对循环肿瘤细胞进行磁选分离,再与上述纳米复合材料形成夹心结构,该夹心结构具有良好的过氧化物酶和漆酶活性,能够发生明显的蓝色和红色的颜色反应,从而实现对目标物(CTCs)进行快速、明显的可视化检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域,具体而言,涉及纳米复合材料及其制备方法、免疫传感器及其检测方法。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs)是从原发肿瘤组织脱落并转移到循环系统的肿瘤细胞。少量的CTCs贯穿于整个癌变过程,通常能够在适当的微环境条件下发展成转移性肿瘤。到目前为止,对CTCs的检测和定量被认为是肿瘤早期诊断、转移和术后监测以及侵入性活检的潜在替代方法之一。然而,在CTCs检测中,考虑到血液中大量的红细胞和白细胞可能造成的干扰,对CTCs的分离和富集是必不可少的。为了克服这一障碍,基于物理或生物分离方法的微流控芯片、生物膜过滤、离心、多功能纳米生物探针等多种策略被开发出来,并取得了较好的富集CTCs效果。但是,现有技术中,针对循环肿瘤细胞尚缺乏一种快速、灵敏、廉价、直观的检测方法。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种纳米复合材料及其制备方法,其具有良好的催化稳定性,吸附性、分散性好,可以结合抗体、适配体、多肽等具有识别作用的生物分子,从而实现对循环肿瘤细胞的快速、可视化检测。
本发明的第二目的在于提供一种免疫传感器,其利用上述纳米复合材料和抗体偶联的磁性纳米颗粒形成夹心结构,可以快速特异性地识别循环肿瘤细胞。
本发明的第三目的在于提供一种非治疗为目的循环肿瘤细胞的检测方法,其操作简单方便,可实现循环肿瘤细胞的快速检查,具有灵敏度高、检测范围宽、检测速度快、检出限低的特点。。
本发明的实施例是这样实现的:
一种具有酶活性的纳米复合材料,纳米复合材料为PdCu@HRP-ConA@CuO2,其包括PdCu水凝胶,以及负载于PdCu水凝胶上的HRP、ConA和CuO2。
一种上述纳米复合材料的制备方法,其包括:
S1. 将PdCu水凝胶、HRP和ConA混合,得到PdCu@HRP-ConA;
S2. 再将PdCu@HRP-ConA和CuCl2、PVP混合,并在碱性条件下进行氧化,得到PdCu@HRP-ConA@CuO2。
一种免疫传感器,其包括与抗体偶联的磁性纳米材料,以及上述纳米复合材料;磁性纳米材料为AuNPs@ZnFe2O4@COF,抗体和ConA可特异性结合循环肿瘤细胞的不同表位。
一种非治疗为目的循环肿瘤细胞的检测方法,其采用上述免疫传感器,其包括:
将抗体偶联的磁性纳米材料与循环肿瘤细胞混合,进行第一孵育;
在第一次孵育完成后,通过磁场收集、洗涤,随后加入所述纳米复合材料,进行第二次孵育;
在第二次孵育完成后,加入显色试剂;
其中,显色试剂为TMB/H2O2或2,4-DP/4-AP。
本发明实施例的有益效果是:
本发明实施例提供了一种纳米复合材料及其制备方法,其将HRP与CuO2结合,装载入金属有机框架材料中,利用金属有机框架材料提高其负载能力、酶活性和稳定性,再利用ConA与循环肿瘤细胞的特异性结合,使其具备分离、捕获循环肿瘤细胞的能力。此外,本发明实施例还提供了利用上述纳米复合材料制备而成的免疫传感器及其检测方法,其利用抗体偶联的磁性纳米材料与循环肿瘤细胞的特异性结合,对循环肿瘤细胞进行磁选分离,再与上述纳米复合材料形成夹心结构,该夹心结构具有良好的过氧化物酶和漆酶活性,能够发生明显的蓝色和红色的颜色反应,从而实现对目标物(CTCs)进行快速、明显的可视化检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,应当理解,以下附图仅示出了本发明的某些实施例,因此不应被看作是对范围的限定,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例所提供的PdCu(A)、PdCu@HRP-ConA(B)和PdCu@HRP-ConA@CuO2(C、D)的TEM图;
图2为本发明实施例所提供的PdCu@HRP-ConA@CuO2的XRD(A)和XPS(B)图谱;
图3为本发明实施例所提供的免疫传感器在检测不同浓度MCF-7细胞时的吸收光谱以及标准曲线;
图4为本发明实施例所提供的免疫传感器在检测不同浓度Hela细胞时的吸收光谱以及标准曲线;
图5为本发明实施例所提供的免疫传感器在检测不同浓度A549细胞时的吸收光谱以及标准曲线;
图6为本发明实施例所提供的免疫传感器在测试MCF-7和MCF-10A时的显微镜荧光染色对比图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种纳米复合材料及其制备方法、纳米复合酶检测抗体、免疫传感器及其检测方法进行具体说明。
本发明实施例提供了一种具有酶活性的纳米复合材料,纳米复合材料为PdCu@HRP-ConA@CuO2,其包括PdCu水凝胶,以及负载于PdCu水凝胶上的HRP、ConA和CuO2。
其将纳米酶CuO2和天然酶HRP(辣根过氧化物酶)结合使用,共同负载于PdCu的金属有机框架结构之上,PdCu可以提高其负载能力、酶活性和稳定性。再利用ConA(刀豆蛋白)与循环肿瘤细胞的特异性结合,使其具备分离、捕获循环肿瘤细胞的能力。该复合材料具有良好的过氧化物酶和漆酶活性,能够发生明显的蓝色和红色的颜色反应,从而实现对循环肿瘤细胞进行快速、明显的可视化检测。
本发明实施例还提供了一种上述纳米复合材料的制备方法,其包括:
S1. 将PdCu水凝胶、HRP和ConA混合,得到PdCu@HRP-ConA;
S2. 再将PdCu@HRP-ConA和CuCl2、PVP混合,并在碱性条件下进行氧化,得到PdCu@HRP-ConA@CuO2。
其中,以PdCu水凝胶中Pd的摩尔量计,HRP的用量为10~150 g/mol,ConA的用量为10~150 g/mol。也即是说,PdCu水凝胶中每含有1mol的Pd,需要使用10~150 g 的HRP和10~150 g的ConA,从而达到较佳的负载效果以及酶活性。
在将PdCu水凝胶、HRP和ConA混合后,在室温下搅拌2~4 h,反应完成后离心去除未结合的游离蛋白即可得到PdCu@HRP-ConA,得到的PdCu@HRP-ConA在水中重新悬浮制成悬浮液,并于4℃以下保存待用。进行离心时,离心转速为5000~10000 rpm,离心时间5~20 min。
进一步地,以PdCu水凝胶中Pd的摩尔量计,CuCl2的用量为3~20 g/mmol,PVP(聚维酮)的用量为5~30 g/mmol。也即是说,PdCu水凝胶中每含有1 mmol的Pd,需要使用3~20 g的CuCl2,以及5~30 g PVP。其中,CuCl2可用CuCl2·2H2O,换算成对应质量即可。在上述比例下,可以更好地得到纳米级CuO2,并均匀地负载在PdCu水凝胶上。
S2步骤中在碱性条件下进行氧化,是将碱和氧化剂加入到PdCu@HRP-ConA和CuCl2、PVP的混合体系中。碱为无机碱,可以是氢氧化钠、氢氧化钾等;氧化剂为过氧化物,优选双氧水。
进一步地,PdCu凝胶是将H2PdCl4和CuCl2与还原剂混合反应得到的,H2PdCl4和CuCl2的摩尔比为1:0.8~1.2。可选地,还原剂为NaBH4,H2PdCl4和还原剂的摩尔比为1:10~50。反应过程中,将H2PdCl4、CuCl2和还原剂在50~80℃下搅拌反应10~30 min,再静置4~6 h,即会在溶液底部生成黑色的PdCu水凝胶,用水冲洗PdCu水凝胶并通过超声在去离子水中分散,于4℃以下保存待用。
本发明实施例还提供了一种免疫传感器,其包括与抗体偶联的磁性纳米材料,以及上述纳米复合材料。磁性纳米材料为AuNPs@ZnFe2O4@COF,抗体和ConA可特异性结合循环肿瘤细胞的不同表位。
抗体偶联的磁性纳米材料可以与循环肿瘤细胞进行特异性结合,并通过磁场收集,实现对循环肿瘤细胞的分离富集。而ConA可与循环肿瘤细胞表面高表达的甘露糖特异性结合,从而形成夹心结构。该夹心结构具有良好的过氧化物酶和漆酶活性,能够发生明显的蓝色和红色的颜色反应,从而实现对循环肿瘤细胞进行快速、明显的可视化检测。该免疫传感器的线性检测范围是5-100cells/mL,最低检测下限为2cells/mL,具有灵敏度较高、检出限较低,检测速度较快以及操作简单等优点。
进一步地,磁性纳米材料和纳米复合材料的质量比为1:0.05~2。在上述比例范围内,对循环肿瘤细胞的检测效果较佳,同时对材料的损耗较低。
可选地,抗体为Anti-CD44,该抗体为商业化抗体,来源广泛并且与循环肿瘤细胞的结合效果较好。磁性纳米材料为AuNPs@ZnFe2O4@COF,磁性纳米材料的制备方法包括:
1) 将六水合氯化铁和无水氯化锌溶解于乙二醇,形成透明溶液。加入醋酸钠和聚乙二醇,剧烈搅拌混合0.5 h,转移到不锈钢高压釜中,在200℃条件下反应8 h,反应终止后自然冷却至室温。将产物用乙醇和水清洗数次,黑色产物在60℃真空环境下干燥6 h,得到ZnFe2O4备用;
2)取1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB),对苯二甲醛(TPA)和ZnFe2O4,用二甲基亚砜溶解。超声分散5 min,超声下加入无水乙酸,室温反应15 min。磁铁收集ZnFe2O4@COF,分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次,60℃真空干燥,得到ZnFe2O4@COF备用;
3)取 HAuCl4溶解于去离子水中,加热到110°C持续5min。取柠檬酸钠溶解于去离子水中,加入上述水HAuCl4水溶液中,搅拌加热30min,等待反应完全颜色变为酒红色后,室温搅拌15min,得到AuNPs备用;
4)取ZnFe2O4@COF分散于去离子水中,然后加入AuNPs搅拌过夜,用去离子水洗涤三次,随后用去离子水分散,得到AuNPs@ZnFe2O4@COF的悬浊液备用。
可选地,抗体与磁性纳米材料的偶联方法包括:
将磁性纳米材料与抗体混合,在摇床中孵育8~20 h,再清洗掉未结合的抗体;磁性纳米材料和抗体的质量比1:0.01~0.5。优选地,孵育在常温下进行,孵育结束后,洗涤去除未结合的抗体。
进一步地,本发明实施例还提供了一种非治疗为目的循环肿瘤细胞的检测方法,其采用上述免疫传感器,其包括:
将抗体偶联的磁性纳米材料与循环肿瘤细胞混合,进行第一孵育;
在第一次孵育完成后,通过磁场收集洗涤,随后加入所述纳米复合材料,进行第二次孵育;
在第二次孵育完成后,加入显色试剂。
其中,第一次孵育在室温下进行,孵育时间为20~120 min,孵育完成后通过磁场收集,洗涤并分散到缓冲溶液中,与4℃以下保存待用。可选地,缓冲溶液为pH=7.4的PBST(磷酸缓冲液)。
第二次孵育在36~38℃,浓度5%的CO2培养箱中进行,孵育时间1~5 h,孵育完成后,通过磁场收集,用PBST洗涤未被捕获的细胞。
其中,显色试剂为TMB/H2O2或2,4-DP/4-AP。在检测到循环肿瘤细胞时,TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)和H2O2的显色组合会在紫外吸收光谱的652 nm处出现特征吸收峰;而2,4-DP(2,4-二氯苯酚)和4-AP(4-氨基吡啶)则会在紫外吸收光谱的510 nm处出现特征吸收峰。使用两种酶促比色信号读数,使输出信号具有更高灵敏度。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种PdCu@HRP-ConA,其制备方法包括:
S1. 将10mL 100mM的NaBH4水溶液加入含有H2PdCl4(1.5mM)和CuCl2(1.5mM)的50mL水溶液中在60oC下搅拌10分钟。所得溶液在60oC下静置4h,底部生成黑色PdCu水凝胶,用水冲洗PdCu水凝胶并通过超声在去离子水中分散,于4oC保存待用。
S2. 向上述溶液中加入5mg HRP和5mg ConA。在室温下搅拌2小时并在6000rpm离心10min去除未结合的游离蛋白。得到PdCu@HRP-ConA重新悬浮在5ml超纯水中,于4oC保存待用。
图1-A展示了PdCu水凝胶的TEM图,由图中可以看出PdCu水凝胶呈现出规则的珊瑚状结构;图1-B展示了PdCu@HRP-ConA的TEM图,由图中可以看出,在PdCu水凝胶上负载HRP和ConA并不会改变PdCu水凝胶的整体形状,仍呈现出珊瑚状结构。
实施例2
本实施例提供了一种纳米复合材料(PdCu@HRP-ConA@CuO2),其制备方法包括:
向实施例1所得的PdCu@HRP-ConA分散液中加入0.5g CuCl2﹒2H2O和0.5g PVP,分散在50mL水中。缓慢加入10mL 0.05M的NaOH溶液和0.5mLH2O2(30%),室温下搅拌30min,底部生成黑褐色沉淀。在12000rpm离心10min,水洗3次。在-60oC下冷冻干燥10h得到PdCu@HRP-ConA@CuO2黑色粉末于4oC保存待用。
图1-C和图1-D展示了该纳米复合材料的TEM图,由图中可以看出,在PdCu@HRP-ConA的基础上负载CuO2同样不会破坏原本的珊瑚状结构,且外围的白色带和黑点小点表明纳米复合材料的成功制备。
此外图2为该纳米复合材料的XRD(图2-A)和XPS(图2-B)图谱。可以看出HRP、ConA和CuO2的负载没有破坏PdCu的结构,且Cu、Pd、O、N和C在材料表面均匀分布,同样表明了纳米复合材料的成功制备。
实施例3
本实施例提供了一种ZnFe2O4@COF,其制备方法包括:
S1. 用乙二醇(40 mL)溶解六水合氯化铁(1.35 g)和无水氯化锌(0.34 g),形成透明溶液,随后加醋酸钠(3.6 g)和聚乙二醇20000(1.0 g)。混合液剧烈搅拌0.5 h后,转移到不锈钢高压釜(容量50 mL)中,在200 °C条件下反应8 h,反应终止后自然冷却至室温。将产物用乙醇和水清洗数次,黑色产物在60°C真空环境下干燥6 h,得到ZnFe2O4备用。
S2. 取1,3,5-三(4-氨基苯基)苯(TAPB,0.106 g),对苯二甲醛(TPA,0.06 g)和ZnFe2O4(0.15 g),用50 mL二甲基亚砜溶解。超声分散5 min,超声下加入1.5 ml无水乙酸,室温反应15 min。磁铁收集ZnFe2O4@COF,分别用四氢呋喃和甲醇清洗三次,60 oC真空干燥,得到ZnFe2O4@COF备用。
实施例4
本实施例提供了一种磁性纳米材料(AuNPs@ZnFe2O4@COF),其制备方法包括:
S1. 取 HAuCl4(8.529mg)溶解于100mL去离子水中,加热到110°C持续5min。取柠檬酸钠(36.24mg)溶解于10mL去离子水中,加入上述水HAuCl4水溶液中,搅拌加热30min,等待反应完全颜色变为酒红色后,室温搅拌15min,得到AuNPs备用。
S2. 取实施例3制备得到的ZnFe2O4@COF(8mg)分散于8mL 水中,然后加入AuNPs(40mL)搅拌过夜,用DW洗涤三次,随后用水定容到8mL,得到AuNPs@ZnFe2O4@COF的悬浊液备用。
实施例5
本实施例提供了一种抗体偶联的磁性纳米材料,其制备方法包括:
配制10mL的1mg/mL的ZnFe2O4@COF@Au分散液,加入1mL的0.2μg/mL的anti-CD44溶液在摇床过夜孵育;然后用PBS溶液洗去未结合的anti-CD44。
实施例6
本实施例提供一种免疫传感器,其包括实施例5所提供的抗体偶联的磁性纳米材料,以及实施例2所提供的纳米复合材料。
利用该免疫传感器对循环肿瘤细胞进行检测,包括:
S1. 将1mL 1.0%的牛血清蛋白添加到抗体偶联的磁性纳米材料中,常温下孵育60min。孵育结束后,通过磁场收集洗涤并重新分散到10mL pH=7.4的PBST缓冲溶液中4oC保存待用。
S2. 取100μL上述经过处理的anti-CD44偶联的ZnFe2O4@COF@Au分散液于离心管中,加入1mL不同浓度的MCF-7细胞分散液,在37oC、5%的CO2培养箱中孵育2h,然后通过磁场收集用PBST洗涤未被磁珠捕获的细胞。
S3. 在离心管中加入100μL浓度为0.1mg·mL−1的PdCu@HRP-ConA@CuO2,并在相同条件下孵育2h,并将未结合的物质用PBST去除。
S4. 将50μL浓度为5mΜ的TMB和相同体积浓度为20mΜ的H2O2快速添加到离心管中,用磁场收集去除纳米材料,取上层清液用微量酶标仪测量其在652nm处的吸光度值,绘制工作曲线。
图3-A展示了不用浓度的MCF-7细胞分散液的吸收度变化,可以看出,在TMB/H2O2的显色组合下,随着MCF-7细胞分散液浓度增加,在在652 nm处检测到的吸光度信号增加,可以看出在5-100cells/mL的浓度范围具有良好的线性关系。根据紫外分光光度计652 nm处的吸收峰值变化,取每个浓度的吸收峰值,进行数据分析,以细胞浓度为 X 轴,吸光度值为Y 轴,构建标准曲线(图3-B),曲线决定系数R2为0.9921,显示出了良好的线性和较低的LOD值。
实施例7
本实施例采用实施例6的免疫传感器对循环肿瘤细胞进行检测出,包括:
S1. 将1mL 1.0%的牛血清蛋白添加到抗体偶联的磁性纳米材料中,常温下孵育60min。孵育结束后,通过磁场收集洗涤并重新分散到10mL pH=7.4的PBST缓冲溶液中4oC保存待用。
S2. 取100μL上述经过处理的anti-CD44偶联的ZnFe2O4@COF@Au分散液于离心管中,加入不同浓度的MCF-7细胞分散液,在37oC、5%的CO2培养箱中孵育2h,然后通过磁场收集用PBST洗涤未被磁珠捕获的细胞。
S3. 在离心管中加入100μL浓度为0.1mg·mL−1的PdCu@HRP-ConA@CuO2,并在相同条件下孵育2h,并将未结合的物质用PBST去除。
S4. 将50μL浓度为5mΜ的2,4-DP和相同体积浓度为20mΜ的4-AP快速添加到离心管中,用磁场收集去除纳米材料,取上层清液用微量酶标仪测量其在510nm处的吸光度值,绘制工作曲线。
图3-C展示了不用浓度的MCF-7细胞分散液的吸收度变化,可以看出,在2,4-DP/4-AP的显色组合下,随着MCF-7细胞分散液浓度增加,在在510 nm处检测到的吸光度信号增加,可以看出在10-100cells/mL的浓度范围具有良好的线性关系。根据紫外分光光度计510nm处的吸收峰值变化,取每个浓度的吸收峰值,进行数据分析,以细胞浓度为 X 轴,吸光度值为 Y 轴,构建标准曲线(图3-D),曲线决定系数R2为0.9919,显示出了良好的线性和较低的LOD值。
实施例8
本实施例采用实施例6的免疫传感器对循环肿瘤细胞进行检测出,包括:
S1. 将1mL 1.0%的牛血清蛋白添加到抗体偶联的磁性纳米材料中,常温下孵育30min。孵育结束后,通过磁场收集洗涤并重新分散到10mL pH=7.4的PBST缓冲溶液中4oC保存待用。
S2. 取100μL上述经过处理的anti-CD44偶联的ZnFe2O4@COF@Au分散液于离心管中,加入不同浓度的Hela细胞分散液,在37oC、5%的CO2培养箱中孵育3h,然后通过磁场收集用PBST洗涤未被磁珠捕获的细胞。
S3. 在离心管中加入100μL浓度为0.1mg·mL−1的PdCu@HRP-ConA@CuO2,并在相同条件下孵育3h,并将未结合的物质用PBST去除。
S4. 将50μL浓度为10mΜ的TMB和相同体积浓度为10mΜ的H2O2快速添加到离心管中,用磁场收集去除纳米材料,取上层清液用微量酶标仪测量其在652nm处的吸光度值,绘制工作曲线。
图4-A展示了不用浓度的Hela细胞分散液的吸收度变化,可以看出,在TMB/H2O2的显色组合下,随着Hela细胞分散液浓度增加,在在652 nm处检测到的吸光度信号增加,可以看出在10-2000cells/mL的浓度范围具有良好的线性关系。根据紫外分光光度计652 nm处的吸收峰值变化,取每个浓度的吸收峰值,进行数据分析,以细胞浓度为 X 轴,吸光度值为Y 轴,构建标准曲线(图4-B),曲线决定系数R2为0.9968,显示出了良好的线性和较低的LOD值。
实施例9
本实施例采用实施例6的免疫传感器对循环肿瘤细胞进行检测出,包括:
S1. 将1mL 1.0%的牛血清蛋白添加到抗体偶联的磁性纳米材料中,常温下孵育30min。孵育结束后,通过磁场收集洗涤并重新分散到10mL pH=7.4的PBST缓冲溶液中4oC保存待用。
S2. 取100μL上述经过处理的anti-CD44偶联的ZnFe2O4@COF@Au分散液于离心管中,加入不同浓度的Hela细胞分散液,在37oC、5%的CO2培养箱中孵育3h,然后通过磁场收集用PBST洗涤未被磁珠捕获的细胞。
S3. 在离心管中加入100μL浓度为1.0mg·mL−1的PdCu@HRP-ConA@CuO2,并在相同条件下孵育2h,并将未结合的物质用PBST去除。
S4. 将50μL浓度为10mΜ的2,4-DP和相同体积浓度为10mΜ的4-AP快速添加到离心管中,用磁场收集去除纳米材料,取上层清液用微量酶标仪测量其在510nm处的吸光度值,绘制工作曲线。
图4-C展示了不用浓度的Hela细胞分散液的吸收度变化,可以看出,在2,4-DP/4-AP的显色组合下,随着Hela细胞分散液浓度增加,在在510 nm处检测到的吸光度信号增加,可以看出在10-1000cells/mL的浓度范围具有良好的线性关系。根据紫外分光光度计510nm处的吸收峰值变化,取每个浓度的吸收峰值,进行数据分析,以细胞浓度为 X 轴,吸光度值为 Y 轴,构建标准曲线(图4-D),曲线决定系数R2为0.9957,显示出了良好的线性和较低的LOD值。
实施例10
本实施例采用实施例6的免疫传感器对循环肿瘤细胞进行检测出,包括:
S1. 将1mL 3.0%的牛血清蛋白添加到抗体偶联的磁性纳米材料中,常温下孵育40min。孵育结束后,通过磁场收集洗涤并重新分散到10mL pH=7.4的PBST缓冲溶液中4oC保存待用。
S2. 取100μL上述经过处理的anti-CD44偶联的ZnFe2O4@COF@Au分散液于离心管中,加入不同浓度的A549细胞分散液,在37oC、5%的CO2培养箱中孵育5h,然后通过磁场收集用PBST洗涤未被磁珠捕获的细胞。
S3. 在离心管中加入100μL浓度为0.1mg·mL−1的PdCu@HRP-ConA@CuO2,并在相同条件下孵育3h,并将未结合的物质用PBST去除。
S4. 将50μL浓度为10mΜ的TMB和相同体积浓度为10mΜ的H2O2快速添加到离心管中,用磁场收集去除纳米材料,取上层清液用微量酶标仪测量其在652nm处的吸光度值,绘制工作曲线。
图5-A展示了不用浓度的A549细胞分散液的吸收度变化,可以看出,在TMB/H2O2的显色组合下,随着A549细胞分散液浓度增加,在在652 nm处检测到的吸光度信号增加,可以看出在50-1000cells/mL的浓度范围具有良好的线性关系。根据紫外分光光度计652 nm处的吸收峰值变化,取每个浓度的吸收峰值,进行数据分析,以细胞浓度为 X 轴,吸光度值为Y 轴,构建标准曲线(图5-B),曲线决定系数R2为0.9964,显示出了良好的线性和较低的LOD值。
实施例11
本实施例采用实施例6的免疫传感器对循环肿瘤细胞进行检测出,包括:
S1. 将1mL 1.0%的牛血清蛋白添加到抗体偶联的磁性纳米材料中,常温下孵育40min。孵育结束后,通过磁场收集洗涤并重新分散到10mL pH=7.4的PBST缓冲溶液中4oC保存待用。
S2. 取100μL上述经过处理的anti-CD44偶联的ZnFe2O4@COF@Au分散液于离心管中,加入不同浓度的A549细胞分散液,在37oC、5%的CO2培养箱中孵育3h,然后通过磁场收集用PBST洗涤未被磁珠捕获的细胞。
S3. 在离心管中加入100μL浓度为1.0mg·mL−1的PdCu@HRP-ConA@CuO2,并在相同条件下孵育2h,并将未结合的物质用PBST去除。
S4. 将50μL浓度为10mΜ的2,4-DP和相同体积浓度为10mΜ的4-AP快速添加到离心管中,用磁场收集去除纳米材料,取上层清液用微量酶标仪测量其在510nm处的吸光度值,绘制工作曲线。
图5-C展示了不用浓度的A549细胞分散液的吸收度变化,可以看出,在2,4-DP/4-AP的显色组合下,随着A549细胞分散液浓度增加,在在510 nm处检测到的吸光度信号增加,可以看出在10-1000cells/mL的浓度范围具有良好的线性关系。根据紫外分光光度计510nm处的吸收峰值变化,取每个浓度的吸收峰值,进行数据分析,以细胞浓度为 X 轴,吸光度值为 Y 轴,构建标准曲线(图5-D),曲线决定系数R2为0.9906,显示出了良好的线性和较低的LOD值。
试验例1
采用实施例6的免疫传感器,分别用MCF-7细胞和MCF-10A细胞做显微镜荧光染色对比,对比结果如图6所示。其中,图6-A、6-C分别为加入MCF-7后,免疫传感器在明场和暗场下的图像;图6-B、6-D分别为加入MCF-10A后,免疫传感器在明场和暗场下的图像。可以看出,在图6-A、6-C中可以明显看到MCF-7被成功捕获,而在图6-B、6-D中则看不到MCF-10A被捕获的图像。由此可见,该免疫传感器可以特异性地捕获人乳腺癌细胞MCF-7,而不捕获正常细胞MCF-10A。
试验例2
采用实施例6的免疫传感器,检测血清中的MCF-7细胞浓度,测试结果如表1所示。
表 1 构建的免疫传感器检测血清中的人乳腺癌细胞
由表中可以看出,在MCF-7细胞加入浓度在20~90 cells/mL的范围内,检测血清中细胞浓度的相对标准偏差不超过2.5%,同时回收率保持在96.3%到102.0%之间,表明该免疫传感器在血清样本中的分析精确性和可靠性是可以接受的。
综上所述,本发明实施例提供了一种纳米复合材料及其制备方法,其将HRP与CuO2结合,装载入金属有机框架材料中,利用金属有机框架材料提高其负载能力、酶活性和稳定性,再利用ConA与循环肿瘤细胞的特异性结合,使其具备分离、捕获循环肿瘤细胞的能力。此外,本发明实施例还提供了利用上述纳米复合材料制备而成的免疫传感器及其检测方法,其利用抗体偶联的磁性纳米材料与循环肿瘤细胞的特异性结合,对循环肿瘤细胞进行磁选分离,再与上述纳米复合材料形成夹心结构,该夹心结构具有良好的过氧化物酶和漆酶活性,能够发生明显的蓝色和红色的颜色反应,从而实现对目标物(CTCs)进行快速、明显的可视化检测。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种具有酶活性的纳米复合材料,其特征在于,所述纳米复合材料为PdCu@HRP-ConA@CuO2,其包括PdCu水凝胶,以及负载于所述PdCu水凝胶上的HRP、ConA和CuO2;
所述纳米复合材料的制备方法为:
S1. 将所述PdCu水凝胶、所述HRP和所述ConA混合,得到PdCu@HRP-ConA;
S2. 再将所述PdCu@HRP-ConA和CuCl2、PVP混合,并在碱性条件下进行氧化,得到所述PdCu@HRP-ConA@CuO2;
其中,以所述PdCu水凝胶中Pd的摩尔量计,所述HRP的用量为10~150 g/mol,所述ConA的用量为10~150 g/mol;
以所述PdCu水凝胶中Pd的摩尔量计,所述CuCl2的用量为3~20 g/mmol,所述PVP的用量为5~30 g/mmol;
所述PdCu水凝胶是将H2PdCl4和CuCl2与还原剂混合反应得到的,所述H2PdCl4和所述CuCl2的摩尔比为1:0.8~1.2。
2.一种如权利要求1所述的纳米复合材料的制备方法,其特征在于,包括:
S1. 将所述PdCu水凝胶、所述HRP和所述ConA混合,得到PdCu@HRP-ConA;
S2. 再将所述PdCu@HRP-ConA和CuCl2、PVP混合,并在碱性条件下进行氧化,得到所述PdCu@HRP-ConA@CuO2。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,以所述PdCu水凝胶中Pd的摩尔量计,所述HRP的用量为10~150 g/mol,所述ConA的用量为10~150 g/mol。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,以所述PdCu水凝胶中Pd的摩尔量计,所述CuCl2的用量为3~20 g/mmol,所述PVP的用量为5~30 g/mmol。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述PdCu水凝胶是将H2PdCl4和CuCl2与还原剂混合反应得到的,所述H2PdCl4和所述CuCl2的摩尔比为1:0.8~1.2。
6.一种免疫传感器,其特征在于,包括与抗体偶联的磁性纳米材料,以及权利要求1所述的纳米复合材料;所述磁性纳米材料为AuNPs@ZnFe2O4@COF,所述抗体和所述ConA可特异性结合循环肿瘤细胞的不同表位。
7.根据权利要求6所述的免疫传感器,其特征在于,所述磁性纳米材料和所述纳米复合材料的质量比为1:0.05~2。
8.根据权利要求7所述的免疫传感器,其特征在于,所述抗体为Anti-CD44。
9.根据权利要求6所述的免疫传感器,其特征在于,所述抗体与所述磁性纳米材料的偶联方法包括:
将所述磁性纳米材料与所述抗体混合,在摇床中孵育8~20 h,再清洗掉未结合的所述抗体;所述磁性纳米材料和所述抗体的质量比1:0.01~0.5。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211156391.7A CN115453117B (zh) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 纳米复合材料及其制备方法、免疫传感器及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211156391.7A CN115453117B (zh) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 纳米复合材料及其制备方法、免疫传感器及其检测方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN115453117A CN115453117A (zh) | 2022-12-09 |
CN115453117B true CN115453117B (zh) | 2023-11-03 |
Family
ID=84307510
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211156391.7A Active CN115453117B (zh) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 纳米复合材料及其制备方法、免疫传感器及其检测方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN115453117B (zh) |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104391020A (zh) * | 2014-11-04 | 2015-03-04 | 济南大学 | 一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途 |
CN105807057A (zh) * | 2016-03-11 | 2016-07-27 | 武汉大学 | 一种捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法 |
CN110456077A (zh) * | 2019-09-12 | 2019-11-15 | 太仓极光克赛生物技术有限公司 | 一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法 |
CN113019364A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-06-25 | 西北有色金属研究院 | 一种多孔二氧化钌-二氧化铈微球复合材料的制备方法 |
CN113333024A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-09-03 | 云南大学 | 一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料及其检测诺如病毒的试剂盒和应用 |
CN114113582A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-03-01 | 云南大学 | 金属有机框架纳米酶生物探针和elisa试剂盒 |
CN114324863A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-12 | 云南大学 | 一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针及其免疫传感器和检测方法 |
CN114959785A (zh) * | 2022-05-06 | 2022-08-30 | 浙江大学衢州研究院 | 一种磷-氮共掺杂的碳凝胶电催化剂及其制备方法和应用 |
-
2022
- 2022-09-22 CN CN202211156391.7A patent/CN115453117B/zh active Active
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104391020A (zh) * | 2014-11-04 | 2015-03-04 | 济南大学 | 一种电化学适配体传感器、其制备方法及其用途 |
CN105807057A (zh) * | 2016-03-11 | 2016-07-27 | 武汉大学 | 一种捕获和鉴定循环肿瘤细胞同步进行的方法 |
CN110456077A (zh) * | 2019-09-12 | 2019-11-15 | 太仓极光克赛生物技术有限公司 | 一种偶联抗EpCAM抗体的免疫磁珠富集检测CTCs的方法 |
CN113019364A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-06-25 | 西北有色金属研究院 | 一种多孔二氧化钌-二氧化铈微球复合材料的制备方法 |
CN113333024A (zh) * | 2021-05-31 | 2021-09-03 | 云南大学 | 一种具有过氧化物酶催化活性的磁性纳米酶材料及其检测诺如病毒的试剂盒和应用 |
CN114113582A (zh) * | 2021-12-20 | 2022-03-01 | 云南大学 | 金属有机框架纳米酶生物探针和elisa试剂盒 |
CN114324863A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-12 | 云南大学 | 一种基于光/电双信号模式的金黄色葡萄球菌毒素检测生物探针及其免疫传感器和检测方法 |
CN114959785A (zh) * | 2022-05-06 | 2022-08-30 | 浙江大学衢州研究院 | 一种磷-氮共掺杂的碳凝胶电催化剂及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN115453117A (zh) | 2022-12-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gao et al. | High-index {hk 0} faceted platinum concave nanocubes with enhanced peroxidase-like activity for an ultrasensitive colorimetric immunoassay of the human prostate-specific antigen | |
JP5788330B2 (ja) | 有機着色微粒子、それを含む診断薬キット及びインビトロ診断方法 | |
JP5035622B2 (ja) | 着色ラテックス | |
CN104634973A (zh) | 一种纳米金复合材料免疫传感器的制备方法及应用 | |
CN110530839A (zh) | 一种二硫化钼/银纳米免疫基底材料的制备方法及其可重复免疫检测应用 | |
CN106442675A (zh) | 一种基于Au@Ag@Au标记的癌胚抗原电化学免疫传感器的制备及应用 | |
CN114540022B (zh) | 纤维素基碳量子点的制备及在尿酸检测中的应用 | |
CN115453117B (zh) | 纳米复合材料及其制备方法、免疫传感器及其检测方法 | |
CN113457741B (zh) | 多酶活性的三层FeOx@ZnMnFeOy@Fe-Mn双金属有机凝胶的制备方法及应用 | |
CN110531061A (zh) | 一种四氧化三铁/二氧化钛/银核壳纳米材料的制备方法及其可循环免疫检测应用 | |
CN109060790A (zh) | 基于羟基氧化钴纳米片的乙酰胆碱酯酶活性检测试纸条及其制备方法 | |
Wang et al. | High-sensitivity biosensor based on SERS integrated with dendrimer-assisted boronic acid-functionalized magnetic nanoparticles for IL-6 detection in human serum | |
CN113351220A (zh) | 一种作为多功能类漆酶样的CuNi/CoMoO4的制备方法及应用 | |
CN114152757B (zh) | 一种β银环蛇毒检测用生物材料、一种非诊断目的检测β银环蛇毒的方法 | |
CN113861962B (zh) | 一种比率型荧光探针及其制备方法和在检测过氧化氢中的应用 | |
CN109738634A (zh) | 一种提高侧向流动生物传感器对低浓度目标蛋白检测灵敏性的催化剂 | |
CN114966023A (zh) | 基于压电效应和lspr效应协同增强的光电化学免疫分析方法 | |
CN110297029B (zh) | 一种基于超顺磁纳米复合物构建癌胚抗原的光电化学传感器 | |
CN113552345A (zh) | 一种基于免疫荧光增强的外泌体定量检测方法 | |
Luo et al. | An electrochemiluminescence immunosensor based on ABEI-GO-AgNPs as a double-amplified luminophore for the ultra-sensitive detection of prostate-specific antigen | |
CN114113028A (zh) | 混合晶态半导体纳米粒子作为表面增强激光拉曼光谱的基底的应用 | |
CN112029728A (zh) | 一种荧光磁性纳米复合物及其制备方法和应用 | |
CN115902196B (zh) | 一种chi3l1检测试剂盒及其制备方法 | |
CN116735871A (zh) | 一种受体试剂及其应用 | |
CN114942263A (zh) | 一种分体式癌胚抗原检测的光电化学传感器的制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |