CN115902196B - 一种chi3l1检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种CHI3L1检测试剂盒及其制备方法，涉及体外诊断技术领域，包括金标垫的制备方法，金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M的PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上，即得金标垫，本发明一种CHI3L1检测试剂盒采用Au@Ag颗粒制作金标垫，成本低，检测灵敏度高，与目前检测方法检测结果符合率高。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断技术领域，具体的说，涉及一种CHI3L1检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
目前肝纤维化的诊断金标准为肝活组织病理学检查，但是检查的有创性极大地限制了其临床应用，目前大量的肝纤维化无创诊断新技术的研究，都是为了替代肝穿刺，但是总体临床实用性不能令人满意，因此，进一步探索新的血清标志物十分重要。
CHI3L1（Chitinase 3-like protein 1，壳多糖酶3样蛋白1）在组织重塑中扮演重要的角色，作为一个较为新兴的血清学标志物，较其他传统的肝纤维化标志物具有更好的敏感性和特异性，因此对肝纤维化疾病患者的早期诊断具有显著价值。CHI3L1是壳多糖酶家族的一员，免疫组织化学分析表明在肝纤维化区域，特别是在纤维发生活跃的区域CHI3L1抗原呈阳性染色，提示CHI3L1可作为肝硬化的诊断、预后评估、治疗效果监测及病程监测的标志物。CHI3L1检测试剂盒（免疫层析法）适用于体外定性检测人血清样本中的CHI3L1含量，用于肝硬化的辅助诊断。但是，目前的CHI3L1检测试剂盒一般采用传统的胶体金法制备金标垫，价格昂贵。
贵金属纳米材料尤其是金和银纳米材料，由于其具有独特的光学和电子特性，为实际生物医学应用开辟了多种机会，如诊断、治疗、传感等应用。一般来说，Ag纳米材料与Au纳米材料相比，具有更强的等离子体特性。然而，Ag纳米材料在生物医学方面的应用却远远少于Au纳米材料，因为它们的化学稳定性和生物相容性较差。Ag纳米材料表面易于被氧化，会降低其等离子体的性能，释放对生物体有害的Ag+。因此，必须对Ag纳米粒子进行安全性设计，一方面降低Ag+从Ag纳米粒子表面释放，另一方面保留其等离子体特性用于生物医学应用。目前已经提出了多种安全设计方法开发更安全的纳米材料，包括包覆、装载、嫁接等方法。目前，独特的结构成为诊断领域的研究热点，核壳结构在保持胶体稳定性、调节材料理化特性达到优势互补、防止纳米粒子团聚以及控制粒子界面反应方面有着重要作用，并在催化、光催化、电池、气体存储及分离方面有着广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CHI3L1检测试剂盒及其制备方法，采用Au@Ag颗粒制作金标垫，成本低，检测灵敏度高，检测结果符合率高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法，包括金标垫的制备方法，金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M的PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上，即得金标垫；
Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒。
作为一种优化方案，所述AgNO3溶液浓度为1mM或1.5mM或2mM或2.5mM或3mM。
作为一种优化方案，所述AgNO3溶液浓度为2mM。
作为一种优化方案，所述AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:1或1:2或1:3。
作为一种优化方案，所述AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2。
作为一种优化方案，所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h。
作为一种优化方案，所述Au@Ag颗粒的粒径超过100nm。
作为一种优化方案，一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法，还包括包被垫的制备方法，包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2MPBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫。
作为一种优化方案，一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法制备的CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板，PVC板上从左到右依次包括吸水纸、包被垫、金标垫、样品垫，吸水纸的一端搭接在包被垫的一端上，金标垫的一端搭接在包被垫的另一端上，样品垫的一端搭接在金标垫的另一端上。
本发明采取以上技术方案，具有以下优点：本发明一种CHI3L1检测试剂盒采用Au@Ag颗粒制作金标垫，成本低，检测灵敏度高，与目前检测方法检测结果符合率高；
Au@Ag颗粒为核壳结构Au@Ag八面体复合材料，是本试剂盒提高灵敏度的关键技术之一。Au核外面包覆的Ag壳，大大增加了比表面积，扩大结合位点，提高与包被抗体的反应，进而提高检测试剂灵敏度；
此结构利用电子补偿效应有效地抑制了Ag纳米材料的粒子解离，同时保持了其固有的等离子特性。在Au@Ag核壳结构纳米粒子中，由于Au比Ag具有更大的功函，Ag壳中的银原子易于失去电子并流向Au核。随后，Au和Ag之间的电子不平衡被校正，Au将电子又补偿给Ag，导致Au的d轨道电子消耗而Ag中d轨道电子的增加。这种电子补偿效应在Au和Ag的界面处尤其为显著。
另外，Au@Ag颗粒的制备方法具有效率高、易控制的特点且变异系数较低，原来由于空间位阻较大而不能标记的一些抗原决定簇位点，也变得容易接近。因而，一旦确定抗原位置，在银增强技术作用下，金标记变得容易联接和形成。在不采用银增强染色电镜技术的情况下，几个不同的抗原反应决定簇可能被标记在相同的片段上。在这种情况下，采用可分辨出的不同尺寸大小的胶体金标记特异性抗体，该抗体对不同反应决定簇具有特异识别。
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明实施例中一种CHI3L1检测试剂盒的试纸条的结构示意图。
图中，
1-吸水纸，2-包被垫，3- PVC板，4-金标垫，5-样品垫，6-检测T线，7-质控C线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下所有实施例和对比例中的百分数均为质量百分数。
实施例1
如图1所示，一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M的PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上，即得金标垫。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
Au@Ag颗粒为核壳结构Au@Ag八面体复合材料，Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液的浓度为1mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:1。
Au@Ag颗粒的粒径超过100nm，大粒径标记物能提高灵敏度，一方面是可视化，另一方面降低了跑板速度，增加了反应时间。
实施例2
如图1所示，一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M的PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上，即得金标垫。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
Au@Ag颗粒为核壳结构Au@Ag八面体复合材料，Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液的浓度为1.5mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2。
Au@Ag颗粒的粒径超过100nm，大粒径标记物能提高灵敏度，一方面是可视化，另一方面降低了跑板速度，增加了反应时间。
实施例3
如图1所示，一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M的PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上，即得金标垫。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
Au@Ag颗粒为核壳结构Au@Ag八面体复合材料，Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液的浓度为2mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:3。
Au@Ag颗粒的粒径超过100nm，大粒径标记物能提高灵敏度，一方面是可视化，另一方面降低了跑板速度，增加了反应时间。
实施例4
如图1所示，一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M的PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上，即得金标垫。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
Au@Ag颗粒为核壳结构Au@Ag八面体复合材料，Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液浓度为2.5mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2。
Au@Ag颗粒的粒径超过100nm，大粒径标记物能提高灵敏度，一方面是可视化，另一方面降低了跑板速度，增加了反应时间。
实施例5
如图1所示，一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M的PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上，即得金标垫。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
Au@Ag颗粒为核壳结构Au@Ag八面体复合材料，Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01 g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液浓度为3mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2。
Au@Ag颗粒的粒径超过100nm，大粒径标记物能提高灵敏度，一方面是可视化，另一方面降低了跑板速度，增加了反应时间。
实验1：
用对比例1-4的制备方法制成的金标垫制成CHI3L1检测试剂盒，选取20例血清样本，分别用对比例1-4对这20例血清样本进行测试，再用市场同类检测试剂盒对该20例样本进行测试，对测试结果进行比较。
对比例1：一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将胶体金标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上；
对比例2：一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上；
Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液浓度为2mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:1。
对比例3：一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上；
Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液浓度为2mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2；
对比例4：一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上；
Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液浓度为2mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:3。
具体测定数据如下表1所示：
表1
测试结果显示，采用Au@Ag颗粒制作金标垫的CHI3L1检测试剂盒的灵敏度较采用胶体金制作金标垫的CHI3L1检测试剂盒的灵敏度均有所提高，对比例1中有三例与市场同类检测试剂盒测定值结果不符合，对比例2中有两例与市场同类检测试剂盒测定值结果不符合，对比例3、4均与市场同类检测试剂盒测定值结果相符，且对比例3灵敏度高于对比例4灵敏度，所以AuNPs与AgNO3溶液体积比优选1:2。
实验2：
选取20例血清样本，分别用对比例5-9对这20例血清样本进行测试，再用市场同类检测试剂对该20例样本进行测试，对测试结果进行比较。
对比例5：一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上；
Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液浓度为1mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2。
对比例6：一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上；
Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液浓度为1.5mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2。
对比例7：一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上；
Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液浓度为2mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2。
对比例8：一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上；
Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液浓度为2.5mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2。
对比例9：一种CHI3L1检测试剂盒，包括试纸条，试纸条包括PVC板3，PVC板3上从左到右依次包括吸水纸1、包被垫2、金标垫4、样品垫5，吸水纸1的一端搭接在包被垫2的一端上，金标垫4的一端搭接在包被垫2的另一端上，样品垫5的一端搭接在金标垫4的另一端上。
一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法包括金标垫的制备方法和包被垫的制备方法。
包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线6，稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线7，分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫；
金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上；
Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h，备用。
AgNO3溶液浓度为3mM；AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2。
具体测定数据如下表2所示：
表2
对比例5-9测试结果如上表所示，采用Au@Ag颗粒制作金标垫的CHI3L1检测试剂盒的灵敏度较采用胶体金制作金标垫的CHI3L1检测试剂盒的灵敏度均有所提高，采用Au@Ag颗粒制作金标垫过程中加入100mL的硝酸银溶液浓度为2mM时，CHI3L1检测试剂盒的灵敏度及符合率最优。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，实施方式的举例，其中未详细述及的部分均为本领域普通技术人员的公知常识，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法，其特征在于：包括金标垫的制备方法，金标垫的制备方法为：将玻璃纤维素膜在0.2M的PBS缓冲液中浸泡，干燥备用；将Au@Ag颗粒标记的鼠抗人CHI3L1单克隆抗体2和兔IgG混合均匀后喷涂在处理后的玻璃纤维素膜上，即得金标垫；
Au@Ag颗粒的制备方法包括如下步骤：
S1、将20mL 1%柠檬酸钠加入到浓度为0.01g/mL沸腾的HAuCl4·3H2O溶液100mL中，迅速混合，当溶液颜色由无色变为黄色，直至变为酒红色，稳定5min，持续加热反应30min后搅拌冷却至室温，将其在5400rpm条件下离心10min，将所得沉淀物置于500uL的超纯水中溶解，得AuNPs；
S2、在200mL 0.1M PBS缓冲液中加入100mL 1% PVP和50mL 0.1M抗坏血酸，搅拌5min后，加入步骤S1中所得AuNPs和100mL AgNO3溶液，反应3小时，最后，将溶液在6000rpm条件下离心15min，置于50mL超纯水中重悬即得Au@Ag颗粒；
所述Au@Ag颗粒为核壳结构Au@Ag八面体复合材料，Au@Ag颗粒的粒径超过100nm。
2.根据权利要求1所述的一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述AgNO3溶液浓度为1mM或1.5mM或2mM或2.5mM或3mM。
3.根据权利要求2所述的一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述AgNO3溶液浓度为2mM。
4.根据权利要求1所述的一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:1或1:2或1:3。
5.根据权利要求4所述的一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述AuNPs与AgNO3溶液体积比为1:2。
6. 根据权利要求1所述的一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所得Au@Ag颗粒保存至4℃条件下，加入20uL 10% BSA阻断1h。
7. 根据权利要求1所述的一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法，其特征在于：还包括包被垫的制备方法，包被垫的制备方法为：分别将鼠抗人CHI3L1单克隆抗体1和羊抗兔多克隆抗体用0.2M PBS缓冲液稀释，稀释的CHI3L1单克隆抗体1作为检测T线（6），稀释的羊抗兔多克隆抗体作为质控C线（7），分别用划膜仪在硝酸纤维素膜上划膜，干燥即得包被垫。
8.根据权利要求1-7其中之一所述的一种CHI3L1检测试剂盒的制备方法制备的CHI3L1检测试剂盒，其特征在于：包括试纸条，试纸条包括PVC板（3），PVC板（3）上从左到右依次包括吸水纸（1）、包被垫（2）、金标垫（4）、样品垫（5），吸水纸（1）的一端搭接在包被垫（2）的一端上，金标垫（4）的一端搭接在包被垫（2）的另一端上，样品垫（5）的一端搭接在金标垫（4）的另一端上。
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