CN113311157A - 一种检测双酚a的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测双酚A的方法，包括以下步骤：S1、制备SERS免疫探针溶液，所述SERS免疫探针溶液包含修饰有拉曼信标分子的Au@Ag纳米颗粒‑抗体复合物；S2、制备SERS免疫层析试纸，将吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫以及PVC板组装在一起，将羊抗鼠IgG抗体固定到所述硝酸纤维素膜作为控制线，将双酚A包被原固定到所述硝酸纤维素膜作为检测线，将所述硝酸纤维素膜放在恒温培养箱培养；S3、检测双酚A，将待测溶液与SERS免疫探针溶液在微孔板中预混合，再将SERS免疫层析试纸插入所述微孔板中，等待至少十分钟后取出SERS免疫层析试纸，待该SERS免疫层析试纸干燥后使用拉曼光谱仪对其进行拉曼检测。

Description

一种检测双酚A的方法
技术领域
本发明涉及一种免疫学结合光谱检测领域，尤其涉及一种检测双酚A的方法。
背景技术
双酚A(BPA)作为典型的环境激素类物质，长时间低剂量摄入，会对人体的内分泌系统、神经系统、免疫系统和生殖系统等构成危害，甚至存在诱发癌症的风险，存在于大气、水环境、污泥及沉积物、食品及包装等多种环境介质中。现有检测方法很多，如酶联免疫吸附法 (ELISA)、荧光分光光度法、电化学分析法、毛细管电泳(CE)、固相微萃取(SPME)、气相色谱质谱法(GC/MS)、高效液相色谱法 (HPLC)等方法推动了双酚A检测的研究进程，但也存在着一些局限：例如样品制备时间长，测量时间长，有害有机副产物量大，昂贵的仪器和间接测量以及需要专业的人员操作等。
表面增强拉曼光谱技术(SERS，surface-enhanced Raman spectroscopy)作为一种新兴的快速检测技术，是指在金、银、铜等贵金属颗粒表面或者溶胶中，在激发区域内，吸附在SERS基底上的分子的拉曼散射信号比普通拉曼散射信号大大增强的现象。表面增强拉曼光谱具有化学指纹信息，因此具有灵敏度高、检测速度快、对操作人员要求不高、不受水干扰等优点。免疫色谱法是借助于抗原与抗体之间能够进行特异性结合而建立的一种具有高选择性的分析方法。由于其简便、快速和低成本的优势，被认为是最成功的POCT。目前，ICA已经被广泛用于病毒、疾病标记、药物残留、细菌和环境污染物的快速检测。但是，传统的金标试纸是基于小尺寸金纳米颗粒积累的颜色反应的低信号强度限制了ICA的现场实时检测；而且，大多数常规胶体金试纸条只能进行定性或者半定量检测，在很多情况下无法满足定量分析的要求。
因此，有必要提出一种技术方案来提高ICA的检测灵敏度和实现定量分析。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种检测双酚A的方法，所述方法包括以下步骤：
S1、制备SERS免疫探针溶液，所述SERS免疫探针溶液包含修饰有拉曼信标分子的Au@Ag纳米颗粒-抗体复合物；
S2、制备SERS免疫层析试纸，将吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫以及PVC板组装在一起，将羊抗鼠IgG抗体固定到所述硝酸纤维素膜的控制线，将双酚A包被原固定到所述硝酸纤维素膜的检测线，将所述硝酸纤维素膜放在恒温培养箱培养，得到SERS免疫层析试纸；
S3、检测双酚A，将待测溶液与所述SERS免疫探针溶液在微孔板中预混合，再将所述SERS免疫层析试纸插入所述微孔板中，等待至少十分钟后取出所述SERS免疫层析试纸，待该SERS免疫层析试纸干燥后使用拉曼光谱仪对其进行拉曼检测。
进一步的，所述步骤S1中包括：
S110、利用氯金酸还原制备出Au纳米溶液；
S120、向所述Au纳米溶液加入DTNB乙醇溶液并持续搅拌；
S130、离心弃上清，用超纯水重悬至原始体积，制备得到AuDTNB NPs溶液；
S140、将Ag层修饰到所述AuDTNB NPs溶液表面得到 AuDTNB@Ag NPs溶液；
S150、将所述AuDTNB@Ag NPs溶液制备为SERS免疫探针溶液。
进一步的，所述步骤S140中包括：
S141、向所述AuDTNB NPs溶液加入浓度为1％wt的聚乙烯吡咯烷酮至少搅拌5min；
S142、再加入浓度为10mM的抗坏血酸至少搅拌15min；最后加入浓度为10mM的硝酸银溶液至少搅拌30min；
S143、当步骤S142中的溶液颜色由紫红色变成灰黄色，离心弃上清，用超纯水重悬至原始体积得到AuDTNB@Ag NPs溶液。
进一步的，所述步骤S150中包括：
S151、取1mL步骤S143制备得的AuDTNB@Ag NPs溶液，加入 2μL浓度为0.05M的K2CO3，迅速摇晃均匀；
S152、加入6μg浓度为0.2mg/mL的BPA抗体，转动30min；
S153、加入100μL浓度为10％的牛血清白蛋白，转动30min，置于保持所述BPA抗体活性的温度环境中封闭8-10h。
进一步的，所述步骤S153中包括：首先，将步骤S153中封闭 8-10h后的溶液于保持所述BPA抗体活性的温度环境中离心两次，洗涤液为2mM的Broax溶液，再加入金标抗体保存液得到SERS免疫探针溶液。
进一步的，配置所述金标抗体保存液的方法为，每10mL浓度为20mM的硼酸-硼酸钠缓冲液加入200μL 10％的BSA和25μL proclin。
进一步的，先使用稀释液将浓度为9.5mg/mL的双酚A包被原稀释15倍，将浓度为5mg/mL的羊抗鼠IgG抗体稀释10倍，完成稀释后，将双酚A包被原固定到所述硝酸纤维素膜的检测线，将羊抗鼠 IgG抗体固定到所述硝酸纤维素膜的控制线。
进一步的，所述稀释液为含有2％乙醇的PBS缓冲液。
进一步的，所述步骤S3中待测溶液与SERS免疫探针溶液的混合比例为20：1。
进一步的，步骤S3中进行拉曼检测，拉曼光谱的激发波长为 633nm，功率为5mW，采集时间至少10s，在所述检测线上进行多个点的信号采集，选取DTNB拉曼报告分子中1334cm-1为特征峰，检测一系列浓度的BPA标准品溶液。
使用本发明所提供的技术方案，可以有效提高ICA的检测灵敏度并实现定量分析。
附图说明
图1为本发明实施例中的实验步骤流程图。
图2为本发明实施例中AuDTNB@Ag纳米颗粒的TEM图。
图3为本发明实施例中Au纳米颗粒和AuDTNB@Ag纳米颗粒的紫外吸收谱。
图4为本发明实施例中SERS-ICA检测方法原理图。
图5为本发明实施例中不同浓度BPA标准PBS溶液的SERS光谱图。
图6为本发明实施例中SERS ICA条带的测试线线区域和BPA浓度记录的1334cm-1拉曼信号强度的拟合曲线。
图7为本发明实施例中不同浓度BPA的水溶液的SERS光谱图。
图8为本发明实施例中SERS ICA条带的测试线线区域和BPA浓度记录的1334cm-1拉曼信号强度的拟合曲线。
图9为本发明实施例中水中双酚A的基于SERS-ICA的峰值回收率和相对标准偏差。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，虽图示中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的形态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局形态也可能更为复杂。
如图1所示的检测双酚A的方法，包括以下步骤：
S1、制备SERS免疫探针溶液，所述SERS免疫探针溶液包含修饰有拉曼信标分子的Au@Ag纳米颗粒-抗体复合物；
S2、制备SERS免疫层析试纸，将吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫以及PVC板组装在一起，将羊抗鼠IgG抗体固定到所述硝酸纤维素膜的控制线，将双酚A包被原固定到所述硝酸纤维素膜的检测线，将所述硝酸纤维素膜放在恒温培养箱培养，得到SERS免疫层析试纸；
步骤S2中制备的SERS免疫层析试纸如图4所示，以PVC板为底，在该PVC板上安装吸水纸、硝酸纤维素膜以及样品垫，硝酸纤维素膜与吸水纸部分重合，且，硝酸纤维素膜还与样品垫部分重合，所述吸水纸与样品垫互不接触，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线以及控制线，该检测线以及控制线均不被吸水纸和样品垫遮盖，所述检测线靠近样品垫，所述控制线靠近吸水纸。
作为一种示例性实施方式，可以使用定量喷膜仪Biodot XYZ 3050将稀释好的羊抗鼠IgG抗体以及双酚A包被原分别喷涂在硝酸纤维素膜的控制线以及检测线上。
S3、检测双酚A，将待测溶液与所述SERS免疫探针溶液在微孔板中预混合，再将所述SERS免疫层析试纸插入所述微孔板中，等待至少十分钟后取出所述SERS免疫层析试纸，待该SERS免疫层析试纸干燥后使用拉曼光谱仪对其进行拉曼检测。
进一步的，所述步骤S1中包括：
S110、利用氯金酸还原制备出Au纳米溶液；
S120、向所述Au纳米溶液加入DTNB乙醇溶液并持续搅拌；
S130、离心弃上清，用超纯水重悬至原始体积，制备得到AuDTNB NPs溶液；
S140、将Ag层修饰到所述AuDTNB NPs溶液表面得到AuDTNB@Ag NPs溶液；
S150、将所述AuDTNB@Ag NPs溶液制备为SERS免疫探针溶液。
进一步的，所述步骤S140中包括：
S141、向所述AuDTNB NPs溶液加入浓度为1％wt的聚乙烯吡咯烷酮至少搅拌5min；
S142、再加入浓度为10mM的抗坏血酸至少搅拌15min；最后加入浓度为10mM的硝酸银溶液至少搅拌30min；
S143、当步骤S142中的溶液颜色由紫红色变成灰黄色，离心弃上清，用超纯水重悬至原始体积得到AuDTNB@Ag NPs溶液。
进一步的，所述步骤S150中包括：
S151、取1mL步骤S143制备得的AuDTNB@Ag NPs溶液，加入 2μL浓度为0.05M的K2CO3，迅速摇晃均匀；
S152、加入6μg浓度为0.2mg/mL的BPA抗体，转动30min；
S153、加入100μL浓度为10％的牛血清白蛋白，转动30min，置于保持所述BPA抗体活性的温度环境中封闭8-10h。
进一步的，所述步骤S153中包括：首先，将步骤S153中封闭 8-10h后的溶液于保持所述BPA抗体活性的温度环境中离心两次，洗涤液为2mM的Broax溶液，再加入金标抗体保存液得到SERS免疫探针溶液。
进一步的，配置所述金标抗体保存液的方法为，每10mL浓度为 20mM的硼酸-硼酸钠缓冲液加入200μL 10％的BSA和25μL proclin。
进一步的，先使用稀释液将浓度为9.5mg/mL的双酚A包被原稀释15倍，将浓度为5mg/mL的羊抗鼠IgG抗体稀释10倍，完成稀释后，将双酚A包被原固定到所述硝酸纤维素膜作为检测线，将羊抗鼠IgG抗体固定到所述硝酸纤维素膜作为控制线。
进一步的，所述稀释液为含有2％乙醇的PBS缓冲液。
进一步的，所述步骤S3中待测溶液与SERS免疫探针溶液的混合比例为20：1。
进一步的，步骤S3中进行拉曼检测，拉曼光谱的激发波长为 633nm，功率为5mW，采集时间至少10s，在所述检测线上进行多个点的信号采集，选取DTNB拉曼报告分子中1334cm-1为特征峰，检测一系列浓度的BPA标准品溶液。
此外，为了更好的对本发明所采用的技术手段进行详细说明，便于本领域技术人员充分理解掌握本发明涉及技术方案内容及效果，现结合具体实施例对本发明进行进一步的详细说明，具体实施方法如下：
在步骤S110中，取99mL的超纯水和1mL的1％的氯金酸水溶液先后置于250mL的锥形瓶中，在130℃油浴条件下加热，并拌以磁力搅拌，待溶液沸腾后，迅速加入1.4mL的1％柠檬酸三纳水溶液。继续加热保持沸腾状态15min，此过程溶液由最初的浅黄色，最后变为酒红色，反应结束后自然冷却至室温待用。
在步骤S120中，取10mL步骤S110中制备的Au纳米溶液，加入20μL浓度为10mM的DTNB乙醇溶液，搅拌2h。
在步骤S130中，将经过步骤S120处理后获得的溶液进行离心处理，离心速率12000rpm，离心时长10min，去除上清液，再用超纯水重悬原始体积，由于本具体实施方式取用的Au纳米溶液的体积为 10mL，因此，使用超纯水将溶液重悬至10mL。
进一步的，所述步骤S140中包括：
S141、将步骤S130中制备的AuDTNB NPs溶液离心浓缩至2mL，离心速率为11000rpm，时长为10min；向离心浓缩后的AuDTNB NPs 溶液加入1mL浓度为1％wt的聚乙烯吡咯烷酮至少搅拌5min；
S142、再加入2mL浓度为10mM的抗坏血酸至少搅拌15min；最后加入0.6mL浓度为10mM的硝酸银溶液至少搅拌30min；
S143、当步骤S142中的溶液颜色由紫红色变成灰黄色，离心弃上清，离心速率为10000rpm，时长为10min，再用超纯水重悬至原始体积，即10mL，得到AuDTNB@Ag NPs溶液。
步骤S141中添加聚乙烯吡咯烷酮的目的是为了防止纳米粒子发生团聚。
参见附图2，为AuDTNB@Ag的TEM图，从图中可以明显看到颗粒的核壳结构；参见附图3，为Au纳米颗粒和AuDTNB@Ag纳米颗粒的紫外吸收光谱图，从图中看出Au纳米颗粒的吸收峰在522nm，而 AuDTNB@Ag纳米颗粒的吸收峰在430nm，从中看出Ag壳修饰后，吸收峰发生蓝移；上述表征表明Ag壳已经成功修饰在Au纳米颗粒表面。
进一步的，所述步骤S150中包括：
S151、取1mL步骤S143制备得的AuDTNB@Ag NPs溶液，加入 2μL浓度为0.05M的K2CO3(添加K2CO3的目的是为了调节PH)，迅速摇晃均匀；
S152、加入6μg浓度为0.2mg/mL的BPA抗体，转动30min；
S153、加入100μL浓度为10％的牛血清白蛋白，转动30min，置于4℃环境中封闭8-10h。
进一步的，所述步骤S153中包括：首先，将步骤S153中封闭 8-10h后的溶液于4℃环境中离心两次，离心速率为12000rpm，时长为10min，洗涤液为2mM的Broax溶液，再加入金标抗体保存液得到SERS免疫探针溶液。
进一步的，配置所述金标抗体保存液的方法为，每10mL浓度为 20mM的硼酸-硼酸钠缓冲液加入200μL 10％的BSA和25μL proclin。
进一步的，先使用稀释液将浓度为9.5mg/mL的双酚A包被原稀释15倍，将浓度为5mg/mL的羊抗鼠IgG抗体稀释10倍，完成稀释后，再利用Biodot XYZ 3050将双酚A包被原固定到所述硝酸纤维素膜作为检测线，将羊抗鼠IgG抗体固定到所述硝酸纤维素膜作为控制线，将硝酸纤维素膜置于37℃恒温培养箱中干燥2h，用切条机将其切成宽度4mm的试纸条，备用。
进一步的，所述稀释液为含有2％乙醇的PBS缓冲液。
本发明提供试验对试纸条性能进行检测，检测原理如下：
先将样品溶液和SERS免疫探针在微孔板中预混合，然后进行侧向流动免疫测定。如图4所示，当微孔板溶液中含有BPA时，SERS 标签将首先与溶液中的BPA结合，而且当溶液中存在足够多的BPA，它将完全阻断包被抗原和SERS免疫探针之间的反应，因此检测线不会显色。当微孔板中没有BPA时，SERS免疫探针将被检测线上的包被原捕获，形成颜色可见的检测线。并且，无论微孔板溶液中是否含有BPA，控制线始终可见；否则，试纸条无效。拉曼报告分子DTNB 的拉曼信号的特征峰为1334，1558，1062，1154cm-1，并且在1334cm-1的峰更加明显。因此，选择1334cm-1处的峰强度作为定量测量的基础。
步骤S3中，将BPA标准溶液与SERS免疫探针溶液依照比例20： 1混合。
在本实施例中，取5μL SERS免疫探针溶液与100μL 0.0001ng/mL，0.001ng/mL，0.01ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL浓度的 PBS缓冲液稀释的BPA标准溶液，混合均匀后，试纸条的反应时间10min。通过拉曼光谱仪检测检测线的拉曼信号来评估BPA SERS-ICA试纸条的灵敏度。
从图5可见，随着双酚A溶液浓度降低，拉曼信号强度随着BPA 浓度的增加而降低，尤其是在1334cm-1处的峰值，当BPA浓度为 1ng/mL时，拉曼峰强仍可区分。
如图6所示，根据y＝7535.91-7231.16lg(x)的线性方程，得到了 1334cm-1处SERS信号与BPA之间的良好线性关系。由此可知，本发明可以实现定量检测双酚A。
步骤S3中进行拉曼检测，拉曼光谱的激发波长为633nm，功率为5mW，采集时间至少10s，在所述检测线上进行多个点的信号采集，选取DTNB拉曼报告分子中1334cm-1为特征峰，检测一系列浓度的 BPA标准品溶液。
为了确定本发明的准确性，分别向超纯水中加入0.0001ng/mL， 0.001ng/mL，0.01ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL浓度的BPA。使用拉曼光谱仪定量检测测试线的拉曼强度，测试结果如图7所示。
如图8，根据y＝6955.75-7620.93lg(x)的线性方程，得到了超纯水中1334cm-1处SERS信号于BPA浓度之间的线性关系；
图9总结了添加回收率以及相对标准偏差的数据。发现加标样品中，回收率在95％至110％之间，RSD值范围在6％-9％范围内，表明该条带能够有效定量检测真实样品中的目标分析物。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种检测双酚A的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备SERS免疫探针溶液，所述SERS免疫探针溶液包含修饰有拉曼信标分子的Au@Ag纳米颗粒-抗体复合物；
S2、制备SERS免疫层析试纸，将吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫以及PVC板组装在一起，将羊抗鼠IgG抗体固定到所述硝酸纤维素膜的控制线，将双酚A包被原固定到所述硝酸纤维素膜的检测线，将所述硝酸纤维素膜放在恒温培养箱培养，得到SERS免疫层析试纸；
S3、检测双酚A，将待测溶液与所述SERS免疫探针溶液在微孔板中预混合，再将所述SERS免疫层析试纸插入所述微孔板中，等待至少十分钟后取出所述SERS免疫层析试纸，待该SERS免疫层析试纸干燥后使用拉曼光谱仪对其进行拉曼检测。
2.根据权利要求1所述的检测双酚A的方法，其特征在于，所述步骤S1中包括：
S110、利用氯金酸还原制备出Au纳米溶液；
S120、向所述Au纳米溶液加入DTNB乙醇溶液并持续搅拌；
S130、将步骤S120中得到的溶液进行离心弃上清处理，并用超纯水重悬至原始体积，制备得到AuDTNBNPs溶液；
S140、将Ag层修饰到所述AuDTNBNPs溶液表面得到AuDTNB@Ag NPs溶液；
S150、将所述AuDTNB@Ag NPs溶液制备为SERS免疫探针溶液。
3.根据权利要求2所述的检测双酚A的方法，其特征在于，所述步骤S140中包括：
S141、向所述AuDTNBNPs溶液加入浓度为1％wt的聚乙烯吡咯烷酮至少搅拌5min；
S142、再加入浓度为10mM的抗坏血酸至少搅拌15min；最后加入浓度为10mM的硝酸银溶液至少搅拌30min；
S143、当步骤S142中的溶液颜色由紫红色变成灰黄色，离心弃上清，用超纯水重悬至原始体积得到AuDTNB@Ag NPs溶液。
4.根据权利要求2所述的检测双酚A的方法，其特征在于，所述步骤S150中包括：
S151、取1mL步骤S140制备得的AuDTNB@Ag NPs溶液，加入2μL浓度为0.05M的K2CO3，迅速摇晃均匀；
S152、加入6μg浓度为0.2mg/mL的BPA抗体，转动30min；
S153、加入100μL浓度为10％的牛血清白蛋白，转动30min，置于保持所述BPA抗体活性的温度环境中封闭8-10h。
5.根据权利要求4所述的检测双酚A的方法，其特征在于，所述步骤S153中包括：首先，将步骤S153中封闭8-10h后的溶液于保持所述BPA抗体活性的温度环境中离心两次，洗涤液为2mM的Broax溶液，再加入金标抗体保存液得到SERS免疫探针溶液。
6.根据权利要求5所述的检测双酚A的方法，其特征在于：配置所述金标抗体保存液的方法为，每10mL浓度为20mM的硼酸-硼酸钠缓冲液加入200μL10％的BSA和25μLproclin。
7.根据权利要求1所述的检测双酚A的方法，其特征在于：步骤S2中，先使用稀释液将浓度为9.5mg/mL的双酚A包被原稀释15倍，将浓度为5mg/mL的羊抗鼠IgG抗体稀释10倍，完成稀释后，将双酚A包被原固定到所述硝酸纤维素膜的检测线，将羊抗鼠IgG抗体固定到所述硝酸纤维素膜的控制线。
8.根据权利要求7所述的检测双酚A的方法，其特征在于：所述稀释液为含有2％乙醇的PBS缓冲液。
9.根据权利要求1所述的检测双酚A的方法，其特征在于：所述步骤S3中，所述待测溶液与SERS免疫探针溶液的混合比例为20：1。
10.根据权利要求1所述的检测双酚A的方法，其特征在于：步骤S3 中进行拉曼检测，拉曼光谱的激发波长为633nm，功率为5mW，采集时间至少10s，在所述检测线上进行多个点的信号采集，选取DTNB拉曼报告分子中1334cm-1为特征峰，检测一系列浓度的BPA标准品溶液。
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