CN106442461A - 一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚a的方法 - Google Patents

一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚a的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚A的方法，包括以下步骤：(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段；(2)金纳米星的合成；(3)金纳米星二聚体的组装；(4)实际添加样品的测定；本发明设计两段具有部分互补序列的DNA，将其分别修饰在金纳米星上，使得金纳米星通过碱基互补形成二聚体，然而在BPA会与其中的一条DNA互补结合，使得金纳米星二聚体分离，导致拉曼光谱的变化，同时在拉曼探针分子4‑氨基苯硫酚(4‑ATP)的作用下，体系所产生的拉曼信号的变化较为显著，通过检测信号的变化强度实现对BPA的简单、快速、灵敏检测。

Description

一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚A的方法
技术领域
本发明涉及一种检测双酚A的方法，具体是一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚A的方法。
背景技术
双酚A(BPA)是一种类似雌激素的化学物质，可以引发人体荷尔蒙的反应。它是含有两个酚基官能团的有机化合物，是一些重要聚合物的原料和添加剂，如环氧树脂、阻燃剂、聚碳酸酯等，广泛应用于塑料以及造纸工业，有研究证明婴儿可能会通过塑料罐装婴儿食品或婴儿塑料瓶过量摄入这种有雌性激素作用的化学品，而且鱼类或其它野生动物也有可能因为环境中的遗弃双酚A制品受到毒害。此外双酚A与成年人的心脏病、糖尿病、肝功能不正常等也有关联。为确保人们身体健康，发展一种超灵敏快速检测方法确定食品及食品容器中BPA的含量是很重要的。特别是在水溶液中，为确保食品安全，从塑料包装袋或杯子中释放的BPA需要被快速检测。
在现代检测技术中，各种以仪器为基础的检测BPA的方法已经得到广泛应用，如高效液相色谱法、液相色谱和气相色谱质谱联用，这些方法不仅需要昂贵的仪器设备，还需要比较繁杂的预处理过程，成本比较高，还需要专业人员操作，利用免疫分析方法探测BPA具有高灵敏度低花费的特点，其也引起研究人员的普遍关注，这种免疫分析方法主要依赖于对应抗体的特异性结合，但BPA类似物的存在会影响检测结果，因此，发展一种新型快速、高灵敏度的检测方法是必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚A的方法，该方法实现水中双酚A(BPA)的简单、快速、高灵敏检测。
为了达到上述技术目的，本发明的技术方案是：
一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚A的方法，包括以下步骤：
(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段：
设计一段能够对双酚A特异性识别且具有双酚A竞争性结合配子作用的DNA1；制备合成具有巯基修饰的DNA2，DNA1和DNA2序列：
DNA1：5′-SH-(T)10-CCGGT GGGTG GTCAG GTGGG ATAGC GTTCC GCGTA TGGCCCAGCG CATCA CGGGT TCGCA CCA-3
DNA2：5′-SH-(T)10-CCCAC CTGAC CACCC ACCGG-3′
(2)采用种子生长法合成金纳米星：
a、首先，将1mM的氯金酸溶液煮沸，加入1％的柠檬酸溶液并不断的剧烈搅拌，冷却至室温即得到金种溶液，氯金酸溶液与柠檬酸溶液的体积比为20:3；
b、其次，将硝酸银溶液和0.1M的抗坏血酸溶液混合均匀，快速加入到已包金种的0.25mM的氯金酸溶液中，调节pH值为3；硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的体积比为2:1，硝酸银溶液和氯金酸溶液的体积比为1:100，金种和氯金酸溶液的体积比为1:100；其中控制硝酸银溶液的浓度可以得到不同粒径的金纳米星，使用1mM硝酸银溶液得到50nm的金纳米星结构。
c、反应液在3000rpm下离心15min，重悬于0.05％的吐温20(Tween-20)中；
(3)金纳米星二聚体的组装：
a、将上述制备的金纳米星溶液和100μM的DNA1溶液在反应室温下反应3h，然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并载不断的摇晃下反应12h，金纳米星溶液与DNA1溶液的体积比为50:1；
b、将上述制备的金纳米星溶液和100μM的DNA2溶液在反应室温下反应3h，然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并载不断的摇晃下反应12h，金纳米星溶液与DNA2溶液的体积比为50:1；
c、上述反应液分别在3000rpm离心10min，去除未偶联上的DNA，将混合液分别命名为GNS-DNA1和GNS-DNA2；
d、将50nm GNS-DNA1和50nm GNS-DNA2按照1:1的体积混合，然后加入4-ATP溶液至终浓度为1μM，室温下孵育过夜，离心重悬在超纯水中；
(4)向上述金纳米星二聚体的组装溶液中加入样品混合并在室温下反应30分钟，通过拉曼光谱法测定双酚A离子。
上述方法实现液体中双酚A的检测，进一步地，为了获得液体中双酚A的浓度，基于下列方程确定样品中双酚A的浓度：Y＝464.86+197.93X，其中Y为1083cm-1处的拉曼光谱峰强度，X为BPA浓度。
上述方程根据建立的依据：
BPA竞争性结合配子反应及标准曲线的建立，取金纳米星二聚体的组装溶液100μL，加入不同浓度的BPA溶液(浓度范围0、0.1、0.5、1、5、10、50ng/mL)，反应30min，对样品进行SERS光谱表征，如图1所示。在BPA溶液中，随着其浓度的增加，GNS的二聚体自组装体的程度越小，因此，可以建立随着BPA的浓度增加而成比例减弱的表面增强拉曼光谱传感器。利用这一特性，设置BPA的浓度为0.1-10ng/mL，基于4-ATP的1083cm-1的峰绘制标准曲线，如图2所示，可得Y＝464.86+197.93X。其中Y为1083cm-1处的拉曼光谱峰强度，X为BPA浓度。所得曲线表现出良好的相关性(R2＝0.992)，LOD为0.07ng/mL。此种方法的LOD低于基于银纳米颗粒，纳米线，或荧光等其他传感器。
BPA的特异性测定：
取小离心管加入金纳米星二聚体的组装溶液100μL，然后向各离心管中分别加双酚B(BPB)，双酚C(BPC)和己烯雌酚(DES)，使加入BPA类似物的最终浓度为10ng/mL，混合并在室温下反应30分钟。基于4-ATP的1083cm-1的峰绘制特异性柱状图，如图3所示，由实验结果得知这种基于拉曼光谱检测技术的BPA检测传感器具有很高的特异性。
基于有效的表面增强拉曼的考虑，本研究利用一种新型的金纳米星(GNS)颗粒具有球形纳米核心和尖锐的表面纳米分支材料，可以产生强的SERS增强效应。此外，金纳米星的组装结构具有很强的等离子共振耦合增强比单个金纳米粒子强很多，表面增强拉曼光谱强度是单个颗粒不能达到，高效率的定向组装，使其形成高产率的二聚体结构，给这种新型传感器的定量和定性特性，比单个纳米粒子具有很多的优越性。
BPA配子是通过指数富集技术筛选出的对BPA具有特异性、强亲和力的单链DNA序列，本发明设计两段具有部分互补序列的DNA，将其分别修饰在金纳米星上，使得金纳米星通过碱基互补形成二聚体，然而在BPA会与其中的一条DNA互补结合，使得金纳米星二聚体分离，导致拉曼光谱的变化，同时在拉曼探针分子4-氨基苯硫酚(4-ATP)的作用下，体系所产生的拉曼信号的变化较为显著，通过检测信号的变化强度实现对BPA的简单、快速、灵敏检测。
附图说明
图1为不同浓度的BPA溶液进行SERS光谱表征光谱图。
图2为不同浓度BPA基于4-ATP的1083cm-1的峰绘制标准曲线图。
图3为不同类似物基于4-ATP的1083cm-1的峰绘制特异性柱状图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段：
设计一段能够对双酚A特异性识别且具有双酚A竞争性结合配子作用的DNA1；制备合成具有巯基修饰的DNA2，DNA1和DNA2序列：
DNA1：5′-SH-(T)10-CCGGT GGGTG GTCAG GTGGG ATAGC GTTCC GCGTA TGGCCCAGCG CATCA CGGGT TCGCA CCA-3
DNA2：5′-SH-(T)10-CCCAC CTGAC CACCC ACCGG-3′
(2)采用种子生长法(现有技术)合成金纳米星：
a、首先，将100mL 1mM的氯金酸溶液煮沸，加入15mL 1％的柠檬酸溶液并不断的剧烈搅拌，冷却至室温即得到金种溶液；
b、其次，将200μL硝酸银溶液和100μL 0.1M的抗坏血酸溶液混合均匀，快速加入到已包含200μL金种的20mL 0.25mM的氯金酸溶液中，调节pH值为3；其中控制硝酸银溶液的浓度可以得到不同粒径的金纳米星，使用1mM硝酸银溶液得到50nm的金纳米星结构。
c、反应液在3000rpm下离心15min，重悬于0.05％的吐温20(Tween-20)中；
(3)金纳米星二聚体的组装：
a、将上述制备的金纳米星溶液100μL和2μL 100μM的DNA1溶液反应室温下反应3h；然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并载不断的摇晃下反应12h；
b、将上述制备的金纳米星溶液100μL和2μL 100μM的DNA2溶液反应室温下反应3h；然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并载不断的摇晃下反应12h；
c、上述反应液分别在3000rpm离心10min，去除未偶联上的DNA，将混合液分别命名为GNS-DNA1和GNS-DNA2；
d、将50nm GNS-DNA1和50nm GNS-DNA2按照1:1的体积混合，然后加入4-ATP溶液至终浓度为1μM，室温下孵育过夜，离心重悬在超纯水中；
(4)向上述金纳米星二聚体的组装溶液中加入样品一(样品一为自来水中添加0.5ng/mL的BPA)混合，并在室温下反应30分钟，通过拉曼光谱法测定双酚A离子。
实施例2
方法与实施例1相同。不同为：在步骤(4)中，向金纳米星二聚体的组装溶液中加入样品二，样品二为自来水中添加1ng/mL的BPA。
实施例3
方法与实施例1相同。不同为：在步骤(4)中，向金纳米星二聚体的组装溶液中加入样品三，样品三为自来水中添加5ng/mL的BPA。
上述实施例1-3中BPA样品测定结果如表1所示。
表1 BPA水样品的测定
由上表可知，向自来水样品中分别添加0.5、1及5ng/mL的BPA，采用基于拉曼光谱技术的BPA检测新方法测定实际样本中的BPA的添加回收率在97.0％～102.8.0％之间，能够完全满足现实生活中对BPA离子的检测需求。
上述实施例不以任何方式限制本发明，凡是采用等同替换或等效变换的方式获得的技术方案均落在本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚A的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段：
设计一段能够对双酚A特异性识别且具有双酚A竞争性结合配子作用的DNA1；制备合成具有巯基修饰的DNA2，DNA1和DNA2序列：
DNA1：5′-SH-(T)10-CCGGT GGGTG GTCAG GTGGG ATAGC GTTCC GCGTA TGGCC CAGCGCATCA CGGGT TCGCA CCA-3
DNA2：5′-SH-(T)10-CCCAC CTGAC CACCC ACCGG-3′
(2)采用种子生长法合成金纳米星：
a、首先，将1mM的氯金酸溶液煮沸，加入1％的柠檬酸溶液并不断的剧烈搅拌，冷却至室温即得到金种溶液，氯金酸溶液与柠檬酸溶液的体积比为20:3；
b、其次，将硝酸银溶液和0.1M的抗坏血酸溶液混合均匀，快速加入到已包金种的0.25mM的氯金酸溶液中，调节pH值为3；硝酸银溶液和抗坏血酸溶液的体积比为2:1，硝酸银溶液和氯金酸溶液的体积比为1:100，金种和氯金酸溶液的体积比为1:100；
c、反应液在3000rpm下离心15min，重悬于0.05％的吐温20中；
(3)金纳米星二聚体的组装：
a、将上述制备的金纳米星溶液和100μM的DNA1溶液在反应室温下反应3h，然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并载不断的摇晃下反应12h，金纳米星溶液与DNA1溶液的体积比为50:1；
b、将上述制备的金纳米星溶液和100μM的DNA2溶液在反应室温下反应3h，然后加入2M的氯化钠溶液至终浓度为0.05M，混合均匀，并载不断的摇晃下反应12h，金纳米星溶液与DNA2溶液的体积比为50:1；
c、上述反应液分别在3000rpm离心10min，去除未偶联上的DNA，将混合液分别命名为GNS-DNA1和GNS-DNA2；
d、将50nm GNS-DNA1和50nm GNS-DNA2按照1:1的体积混合，然后加入4-ATP溶液至终浓度为1μM，室温下孵育过夜，离心重悬在超纯水中；
(4)向上述金纳米星二聚体的组装溶液中加入样品混合并在室温下反应30分钟，通过拉曼光谱法测定双酚A离子。
2.根据权利要求1所述的一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚A的方法，其特征在于：在所述步骤(2)b中，1mM硝酸银溶液得到50nm的金纳米星结构。
3.根据权利要求1所述的一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚A的方法，其特征在于基于下列方程确定样品中双酚A的浓度：Y＝464.86+197.93X，其中Y为1083cm-1处的拉曼光谱峰强度，X为BPA浓度。
4.根据权利要求3所述的一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚A的方法，其特征在于上述方程根据以下方法建立：
取金纳米星二聚体的组装溶液100μL，分别加入0、0.1、0.5、1、5、10、50ng/mL浓度的BPA溶液，反应30min，对样品进行SERS光谱表征，建立随着BPA的浓度增加而成比例减弱的表面增强拉曼光谱传感器，利用这一特性，设置BPA的浓度为0.1-10ng/mL，基于4-ATP的1083cm-1的峰绘制标准曲线，可得Y＝464.86+197.93X，其中Y为1083cm-1处的拉曼光谱峰强度，X为BPA浓度，LOD为0.07ng/mL。
5.根据权利要求1所述的一种基于增强拉曼光谱效应检测双酚A的方法，其特征在于双酚A特异性根据以下方法测定：
取离心管加入金纳米星二聚体的组装溶液100μL，然后向各离心管中分别加双酚B，双酚C和己烯雌酚，使加入BPA类似物的最终浓度为10ng/mL，混合并在室温下反应30分钟，基于4-ATP的1083cm-1的峰绘制特异性柱状图，从而测定双酚A特异性。
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