CN103760332A - 一种基于适配体的手性传感器检测双酚a的方法 - Google Patents

一种基于适配体的手性传感器检测双酚a的方法 Download PDF

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Abstract

一种基于适配体的手性传感器检测双酚A的方法，双酚A缩写为BPA，属于纳米生物技术检测领域。本发明包括：金纳米粒子修饰DNA探针，金纳米粒子组装成不对称的二聚体，金纳米粒子组装体应用圆二色光谱（CD）进行检测。本发明应用了一种BPA适配体修饰的金纳米粒子探针，基于碱基互补配对原则，由适配体及其互补序列修饰的大小金纳米粒子在DNA杂交的作用下组装成手性二聚体，通过不同BPA浓度下CD信号的差异对BPA进行检测。本发明方法简单、快速、灵敏度高、特异性好，能够对实际样品进行检测。

Description

一种基于适配体的手性传感器检测双酚A的方法
技术领域
一种基于适配体的手性传感器检测双酚A的方法，属于纳米生物技术检测领域。
背景技术
双酚 A（缩写BPA）是一种重要的有机化合物，在工业生产中，广泛使用双酚 A 为原材料用于多种高分子材料的生产，如：聚砜树脂、聚苯醚树脂、不饱和聚酯树脂、环氧树脂、聚碳酸酯等；也可用于精细化工品的生产，如：增塑剂、热稳定剂、橡胶防老剂、阻燃剂、抗氧剂、涂料、农药等，同时它也是一种“环境内分泌干扰物”。食品中双酚 A 残留主要是通过食品原材料和食品包装两个途径，途径一：双酚 A在环境中难以降解，广泛存在于自然界中，并在生物体内富集，通过食物链进入我们的食品当中；途径二：双酚 A 可通过食品包装容器和塑料薄膜渗入食品或饮料中，双酚 A 常用于食品包装内层涂料，特别是金属包装内层，用于防止食品与金属直接接触，某些食物过高的酸碱性易腐蚀金属包装。
传统的BPA检测方法主要是基于仪器的检测方法，如：液相色谱、高压液相色谱、气相色谱、液质联用色谱等。虽然这些方法具有稳定性好、灵敏度高、可准确定量定性检测等特点，但是需要昂贵的仪器、复杂的样品前处理过程以及专业的操作人员，基于免疫学检测的方法依赖抗原抗体的识别反应，然而抗体的稳定性和实验结果的特异性是影响检测结果的主要因素。近年来，随着纳米技术的发展，纳米材料在食品安全检测领域的应用越来越广泛，由纳米材料制备的生物传感器具有检测限低、灵敏度高、造价低、体积小等特点，因此受到人们广泛的关注。等离子纳米粒子组装成的手性纳米结构具有CD信号，这一发现对纳米材料在检测领域的应用成为一个新的进展，可以应用手性纳米材料组装体的CD信号作为检测信号对有害物进行检测。
Aptamer是经体外筛选得到的一种新型的单链DNA或RNA核酸识别探针，它可以代替抗体广泛用于多种目标物的检测，与抗体相比Aptamer具有更多的优势：热稳定性、可重复性并且易于化学合成等，因此使用Aptamer代替抗体应用于目标物的检测具有更多的应用和研究价值。
本发明在抗BPA的Aptamer的作用下，将大小金纳米粒子通过DNA链的杂交组装成不对称的金纳米粒子二聚体，在不同浓度BPA存在的条件下，Aptamer与BPA识别并结合从而使得二聚体解聚成单个的粒子，随着BPA浓度越高，解聚程度越大，从而使得相应的CD信号强度随之降低，根据CD信号的强度与BPA浓度之间所建立的对应关系，从而对BPA含量进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于适配体的手性传感器检测双酚A的方法，借助于Aptamer以及其部分互补序列Aptamer-C 之DNA的作用下金纳米粒子组装成不对称的金纳米粒子二聚体，在不同浓度BPA存在的条件下，二聚体发生不同程度的解聚，最后通过CD光谱对金纳米粒子组装体进行测定，从而间接检测目标BPA的含量。
本发明的技术方案：一种基于适配体的手性传感器检测双酚A的方法，包括：金纳米粒子修饰DNA探针，金纳米粒子组装成不对称的二聚体，金纳米粒子组装体应用圆二色光谱（CD）进行检测；具体步骤为：
（1）金纳米粒子修饰DNA探针
首先将新合成的10nm及20nm的金纳米粒子浓缩5倍，使其终浓度分别为20 nM 及5 nM，然后将金纳米粒子与DNA按照1:5的摩尔浓度比进行偶联，即将1 μL 2.5μM的BPA适配体（Aptamer）修饰到20nm的金纳米粒子的表面，1 μL 10μM的BPA适配体部分互补序列（Aptamer-C）修饰到10nm的金纳米粒子的表面；通过加盐老化的方法逐步将NaCl加入到金纳米粒子中，使NaCl的终浓度达到50 mM；过夜孵育后，金纳米粒子通过离心去除未偶联的DNA;
Aptamer：5’-SH-CCGGTGGGTG GTCAGGTGGG ATAGCGTTCC GCGTATGGCC CAGCGCATCA CGGGTTCGCA CCA-3’；
Aptamer-C：5’-CCCACCTGAC CACCCACCGG-SH-3’；
（2）金纳米粒子组装成不对称的二聚体
整个组装过程在100μL的反应体系中进行，其中包括20μL 10nm 金纳米粒子-Aptamer和80μL 20nm金纳米粒子-Aptamer-C，反应缓冲液为0.02 M Tris− HCl (0.01% SDS、20mM MgCl 2、40 mM KCl、100 mM NaCl、pH 8.0)缓冲液；室温孵育杂交6h后，即得到组装好的不对称金纳米粒子二聚体，用于下步BPA检测；
（3）金纳米粒子组装体应用圆二色光谱（CD）进行检测
在不对称的金纳米粒子二聚体中加入一系列不同浓度的BPA标准品，在BPA的作用下，抗BPA的Aptamer识别BPA并与之结合，从而导致适配体互补序列从杂交双链上解离下来；不同目标BPA浓度下的二聚体含量呈现出差异，随着BPA浓度的增加，二聚体的含量越少，相应的CD信号强度越小；将最终的反应产物用CD光谱进行检测，根据BPA浓度与CD信号强度之间的对应关系，绘制BPA浓度与CD信号强度的标准曲线，从而通过CD信号对BPA的含量进行检测。
所述的20nm及10nm的金纳米粒子通过柠檬酸三钠还原氯金酸的方法进行合成，合成步骤：将三口瓶用王水浸泡过夜，然后用超纯水清洗干净，在洁净的三口瓶中加入48.5mL的超纯水，再加入1.25mL质量浓度为0.4%的氯金酸，磁力搅拌并加热沸腾，7-8min后加入1.5 mL（10nm Au）或1.0mL(20nm Au)质量浓度为1%的柠檬酸三钠，溶液从无色变为红色后停止加热，继续搅拌15min，即分别得到10nm及20nm的金纳米粒子。
本发明的有益效果：本发明提供一种基于适配体的手性传感器检测双酚A的方法，借助于Aptamer以及与其部分互补序列Aptamer-C的作用下金纳米粒子组装成不对称的金纳米粒子二聚体，在不同浓度BPA存在的条件下，二聚体发生不同程度的解聚，最后通过CD光谱对金纳米粒子组装体进行测定，从而间接检测目标BPA的含量。
附图说明
图1 BPA检测的CD光谱；
图2 BPA检测的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
一种基于适配体的手性传感器检测双酚A的方法，步骤为：
（1）金纳米粒子修饰DNA探针
首先将新合成的10nm及20nm的金纳米粒子浓缩5倍，使其终浓度分别为20 nM 及5 nM，然后将金纳米粒子与DNA按照1:5的摩尔浓度比进行偶联，即将1 μL 2.5μM的BPA适配体（Aptamer）修饰到20nm的金纳米粒子的表面，1 μL10μM的BPA适配体部分互补序列（Aptamer-C）修饰到10nm的金纳米粒子的表面；通过加盐老化的方法逐步将NaCl加入到金纳米粒子中，使NaCl的终浓度达到50 mM；过夜孵育后，金纳米粒子通过离心去除未偶联的DNA；
Aptamer：5’-SH-CCGGTGGGTG GTCAGGTGGG ATAGCGTTCC GCGTATGGCC CAGCGCATCA CGGGTTCGCA CCA-3’；
Aptamer-C：5’-CCCACCTGAC CACCCACCGG-SH-3’。
（2）金纳米粒子组装成不对称的二聚体
整个组装过程在100μL的反应体系中进行，其中包括20μL 10nm 金纳米粒子-Aptamer和80μL 20nm金纳米粒子-Aptamer-C，反应缓冲液为0.02 M Tris− HCl (0.01% SDS、20mM MgCl 2、40 mM KCl、100 mM NaCl、pH 8.0)缓冲液；室温孵育杂交6h后，即得到组装好的不对称金纳米粒子二聚体，用于下步BPA检测。
（3）金纳米粒子组装体应用圆二色光谱（CD）进行检测
在不对称的金纳米粒子二聚体中加入一系列不同浓度的BPA标准品，在BPA的作用下，抗BPA的Aptamer识别BPA并与之结合，从而导致适配体互补序列从杂交双链上解离下来；不同目标BPA浓度下的二聚体含量呈现出差异，随着BPA浓度的增加，二聚体的含量越少，相应的CD信号强度越小；将最终的反应产物用CD光谱进行检测，根据BPA浓度与CD信号强度之间的对应关系，绘制BPA浓度与CD信号强度的标准曲线，从而通过CD信号对BPA的含量进行检测。
（4）检测灵敏度研究
根据每个目标BPA浓度下对应的CD信号强度，以BPA浓度为横坐标，CD信号强度为纵坐标做出一条标准曲线，根据标准曲线计算出BPA的检测限为0.008 ng mL-1。
（5）特异性研究
以双酚C (BPC)、双酚酸(DPA)、己烯雌酚(DES)为检测对象，进行特异性分析，加入浓度均为5 ng mL-1，操作方法与BPA检测的操作方法一致，反应体系的CD信号与阴性空白样品即未加入任何化合物的CD信号进行对比，得到的CD信号与空白样品的CD信号相比没有明显差别，由此得出BPA的Aptamer不能识别BPA的结构类似物，此方法的特异性良好。
（6）添加回收实验
将不同浓度的BPA加入到阴性自来水中，用以上方法建立的BPA检测传感器进行水样品中的添加回收测定，最终得到的回收率范围在93%-98.4%，可以用于进行实际样品的检测。
Aptamer：5’-SH-CCGGTGGGTG GTCAGGTGGG ATAGCGTTCC GCGTATGGCC CAGCGCATCA CGGGTTCGCA CCA-3’；
Aptamer-C：5’-CCCACCTGAC CACCCACCGG-SH-3’；

Claims (1)

1.一种基于适配体的手性传感器检测双酚A的方法，双酚A缩写为BPA，其特征在于包括：金纳米粒子修饰DNA探针，金纳米粒子组装成不对称的二聚体，金纳米粒子组装体应用圆二色光谱CD进行检测；具体步骤为：
（1）金纳米粒子修饰DNA探针
首先将新合成的10nm及20nm的金纳米粒子浓缩5倍，使其终浓度分别为20 nM 及5 nM，然后将金纳米粒子与DNA按照1:5的摩尔浓度比进行偶联，即将1 μL 2.5μM的BPA适配体Aptamer修饰到20nm的金纳米粒子的表面，1 μL 10μM的BPA适配体部分互补序列Aptamer-C修饰到10nm的金纳米粒子的表面；通过加盐老化的方法逐步将NaCl加入到金纳米粒子中，使NaCl的终浓度达到50 mM；过夜孵育后，金纳米粒子通过离心去除未偶联的DNA；
Aptamer：5’-SH-CCGGTGGGTG GTCAGGTGGG ATAGCGTTCC GCGTATGGCC CAGCGCATCA CGGGTTCGCA CCA-3’；
Aptamer-C：5’-CCCACCTGAC CACCCACCGG-SH-3’；
（2）金纳米粒子组装成不对称的二聚体
整个组装过程在100μL的反应体系中进行，其中包括20μL 10nm 金纳米粒子-Aptamer和80μL 20nm金纳米粒子-Aptamer-C，反应缓冲液为含0.01% SDS、20mM MgCl 2、40 mM KCl、100 mM NaCl、pH 8.0的0.02 M Tris- HCl缓冲液；室温孵育杂交6h后，即得到组装好的不对称金纳米粒子二聚体，用于下步BPA检测；
（3）金纳米粒子组装体应用圆二色光谱CD进行检测
在不对称的金纳米粒子二聚体中加入一系列不同浓度的BPA标准品，在BPA的作用下，抗BPA的Aptamer识别BPA并与之结合，从而导致适配体互补序列从杂交双链上解离下来；不同目标BPA浓度下的二聚体含量呈现出差异，随着BPA浓度的增加，二聚体的含量越少，相应的CD信号强度越小；将最终的反应产物用CD光谱进行检测，根据BPA浓度与CD信号强度之间的对应关系，绘制BPA浓度与CD信号强度的标准曲线，从而通过CD信号对BPA的含量进行检测。
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