CN104073565A - 一种确定样品中双酚a浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种确定样品中双酚A浓度的方法，其包括：（1）设计与合成生物素化修饰DNA及其互补DNA，并将其固定化至PCR反应容器的内表面，获得表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器；（2）将待测样品加入至所述表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器中，以便双酚A与互补DNA特异性结合；（3）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去结合双酚A的互补DNA；（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对未与双酚A特异性结合的互补DNA进行实时荧光定量PCR；以及（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct值，确定所述样品中的双酚A的浓度。该方法可以简单快速准确地检测样品中双酚A的浓度。

Description

一种确定样品中双酚A浓度的方法
技术领域
本发明涉及化学领域，更具体地，涉及一种确定样品中双酚A浓度的方法。 
背景技术
由于双酚A存在于多种食品、食品接触材料以及环境中，并且对人体危害严重，所以现在多个国家对食品及食品接触材料中双酚A的含量均有严格的限制。食品中双酚A残留重要是通过食品原材料和食品包装两个途径。途径一：双酚A在环境中难以降解，广泛存在于自然界中，并在生物体内中富集，通过食物链进入我们的食品当中；途径二：双酚A可通过食品包装容器和塑料薄膜渗入食品或饮料中，双酚A常用于食品包装内层涂料，特别是金属包装内层，用于防止食品于金属直接接触，其某些食物过高的酸碱性易腐蚀金属包装。因此，对于检测双酚A（以下可简称BPA）的技术的开发随之而来。 
对BPA的检测有液相色谱法、气相色谱法、免疫检测法、光谱分析法、电化学分析法，慢慢的从单一的检测手段走向多种技术相结合。但这些方法往往还需要大量的预处理，增加了很多成本，而且对操作人员有很高的技术要求，所以不能满足社会对实际样品检测的日益增加的需求。 
有学者发现了水溶液中BPA能够与特定的DNA序列相结合。基于此原理，有学者利用寡聚核苷酸对BPA的特异性识别作用，构建了对BPA检测的生物传感器，这类传感器具有选择性好，特异性好的优点，成为最近研究的热点。 
然而目前已有的相关方法都难以做到简单、快速、准确地检测双酚A浓度，因而确定样品中双酚A浓度的方法仍有待改进。 
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。 
本发明具体采用如下技术方案： 
一种检测样品中双酚A浓度的方法，包括：
（1）设计与合成生物素化修饰DNA及其互补DNA，并将其固定化至PCR反应容器的内表面，获得表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器；
（2）将含有双酚A的待测样品加入至所述表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器中，以便双酚A与互补DNA特异性结合；
（3）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去结合双酚A的互补DNA；
（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对未与双酚A特异性结合的互补DNA进行实时荧光定量PCR；以及
（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值，确定所述样品中的双酚A的浓度。
本发明利用特定的DNA序列对BPA的特异性识别的特性，基于实时荧光定量PCR技术，开发了一种操作简单、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测水中BPA的含量，极大地提高了BPA的检测限。 
其中，所述生物素化修饰DNA在5’端进行生物素化修饰，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。 
所述互补DNA具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。 
本发明所述的方法，在步骤（1）中，优选将生物素化修饰DNA及其互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括： 
用戊二醛溶液对所述PCR反应容器进行处理；
用链霉亲和素对所述PCR容器进行处理；
向所述PCR反应容器中加入所述生物素化修饰DNA及其互补DNA，以便在所述PCR反应容器的内表面固定所述生物素化修饰DNA及其互补DNA。
进一步优选在步骤（1）中，将生物素化修饰DNA及其互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括： 
用20微升0.8重量%的戊二醛溶液在37℃下对所述PCR反应容器进行处理5小时，并利用超纯水对所述PCR反应容器进行清洗；
用20微升溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37℃下对所述PCR反应容器处理2小时，其中链霉亲和素在所述PCR容器中的终浓度为12.5 ng/mL，并用PBST溶液进行清洗，其中，所述PBST溶液含有10mM PBS，pH 7.2，0.05重量% Tween-20；
向所述PCR反应容器中加入20微升浓度为100nM的所述生物素化修饰DNA及其互补DNA，在37℃下反应40分钟，并且利用柠檬酸钠缓冲液进行清洗，其中所述柠檬酸钠缓冲液含有750mM NaCl，75mM C6H5Na3O7。
为保证检测结果的准确性，本发明优选所述待测样品中双酚A浓度不低于0.8ng/mL。 
更优选所述待测样品中双酚A浓度为1ng/mL~500 ng/mL，以进一步保证利用本发明方法进行双酚A浓度检测的准确性和灵敏度。 
在本发明的一个实施例中，所述引物组由下列引物构成： 
上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’（SEQ ID NO：3）
下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’（SEQ ID NO：4）。
本发明所述的方法，优选基于下列线性方程确定所述样品中双酚A的浓度：y=0.962x+6.02024，y为所述实时荧光定量PCR的Ct 值，x为相应的双酚A浓度。线性相关性>0.99。 
根据本发明的技术方案，基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值，确定所述样品中的双酚A浓度是通过将所述实时荧光定量PCR的Ct 值与标准曲线进行比较而完成的。其中，所述标准曲线是基于已知双酚A浓度分别为0 ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500ng/mL的标准样品进行平行实验而建立的。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行双酚A浓度检测的效率和灵敏度。 
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。 
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中： 
图1显示了根据本发明一个实施例，利用不同双酚A浓度标准样品进行实时荧光定量PCR所得到的扩增曲线，其中双酚A浓度分别取0 ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500ng/mL。
图2显示了根据本发明一个实施例的双酚A标准曲线图。 
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。 
实施例1 建立BPA标准曲线 
(1) 设计与合成相应的寡核苷酸片段；
设计一段能够对双酚A（BPA）具有特异性识别的DNA片段，并在其5’段进行生物素化修饰。设计出互补DNA，并且根据该此序列设计实时荧光定量PCR用的上下游引物。DNA序列通过DNA合成仪制备。
生物素修饰DNA： 
5’-biotin-GGCTACGAGGGAAATGCGGTCCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’（SEQ ID NO：1）
互补DNA：
5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCTTACCCCACCTGACCACCCACCGG-3’（SEQ ID NO：2）
上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’ （SEQ ID NO：3）
下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’ （SEQ ID NO：4）
(2) DNA的杂交与固定；
首先 PCR管加入20μL0.8%的戊二醛溶液在37°C处理5小时，然后用超纯水清洗三次，其次用20μL溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37°C再次处理2小时，其中链霉亲和素12.5 ng/mL。处理完后紧接着用PBST（10mM PBS，
pH 7.2，0.05% Tween-20）清洗。取修饰DNA与互补DNA的混合液 20μL分别加入到PCR管中，其中修饰DNA与互补DNA的浓度都是100nM，并在37°C反应40分钟。最后用柠檬酸钠缓冲液（750mM NaCl，75mM C6H5Na3O7）清洗3次。来去除没有固定的DNA。
(3) BPA标准曲线的建立； 
依次向PCR管中加入BPA20μL, 使其最终浓度为 0 nM、1nM、5 nM、10nM、50 nM、100nM、500nM，并在37°C反应40分钟，最后用柠檬酸钠缓冲液清洗3次，来清洗去除没有固定的DNA。最后依次向PCR管中加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR。
图1显示了利用不同双酚A浓度标准样品进行实时荧光定量PCR所得到的扩增曲线。 
BPA标准曲线的建立：利用实时荧光定量PCR仪测定不同BPA浓度下扩增曲线的循环数，根据测定的不同BPA浓度下扩增曲线的循环数，绘制BPA浓度的标准曲线，本传感器的线性范围1-500ng/mL，检测限为0.8ng/mL。标准曲线的线性方程为y=0.962x+6.02024，y为不同BPA浓度下扩增曲线的循环数（Ct 值），x为相应BPA的浓度，线性相关性>0.99。 
 (4) 双酚A的特异性测定； 
本步骤以BPA的类似物为对照，验证了本发明技术方案对于BPA具有极高的针对性与特异性，可广泛用于样品中BPA浓度的检测。
取4个PCR管，重复步骤（2）后，依次向PCR管中加入BPA、BPB、BP、DPA各20μL。在37°C反应40分钟，最后用柠檬酸钠缓冲液清洗3次，来清洗去除没有固定的DNA。最后向PCR管中加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR。由实验结果得知这种基于PCR技术的BPA检测新技术具有很高的特异性。 
实施例2 
本实施例是在实施例1所建立的BPA标准曲线的基础上，对待测样品实际进行检测的具体方法，各步骤的具体操作可参照实施例1。
检测样品中双酚A浓度的方法包括如下步骤： 
 (1) 设计与合成相应的寡核苷酸片段；
设计一段能够对双酚A（BPA）具有特异性识别的DNA片段，并在其5’段进行生物素化修饰。设计出互补DNA，并且根据该此序列设计实时荧光定量PCR用的上下游引物。DNA序列通过DNA合成仪制备。
生物素修饰DNA： 
5’-biotin-GGCTACGAGGGAAATGCGGTCCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3’（SEQ ID NO：1）
互补DNA：
5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCTTACCCCACCTGACCACCCACCGG-3’（SEQ ID NO：2）
上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’ （SEQ ID NO：3）
下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’ （SEQ ID NO：4）
(2) DNA的杂交与固定；
首先 PCR管加入20μL0.8%的戊二醛溶液在37°C处理5小时，然后用超纯水清洗三次，其次用20μL溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37°C再次处理2小时，其中链霉亲和素12.5 ng/mL。处理完后紧接着用PBST（10mM PBS，
pH 7.2，0.05% Tween-20）清洗。取修饰DNA与互补DNA的混合液 20μL分别加入到PCR管中，其中修饰DNA与互补DNA的浓度都是100nM，并在37°C反应40分钟。最后用柠檬酸钠缓冲液（750mM NaCl，75mM C6H5Na3O7）清洗3次。来去除没有固定的DNA。
（3）向自来水样品中分别添加1nM、2nM、5nM及10nM的BPA，形成多个待测样品，将待测样品加入至所述表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器中，以便双酚A与互补DNA特异性结合； 
（4）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去结合双酚A的互补DNA；
（5）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对未与双酚A特异性结合的互补DNA进行实时荧光定量PCR； 基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值，带入实施例1所建立的标准曲线（y=0.962x+6.02024，y为不同BPA浓度下扩增曲线的循环数（Ct 值），x为相应BPA的浓度），从而确定各样品中的双酚A的浓度，结果见表1：
表1 自来水样品添加BPA浓度的测定
 
结果显示，采用基于PCR技术的BPA检测新方法测定实际样本中的BPA的添加回收率在97.6%-105.20%之间，标准差小于5.34%，能够完全满足现实生活中对BPA的检测需求。

Claims (9)

1.一种确定样品中双酚A浓度的方法，其特征在于，包括：
（1）设计与合成生物素化修饰DNA及其互补DNA，并将其固定化至PCR反应容器的内表面，获得表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器；
（2）将含有双酚A的待测样品加入至所述表面固定有生物素化修饰DNA及其互补DNA的PCR反应容器中，以便双酚A与互补DNA特异性结合；
（3）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去结合双酚A的互补DNA；
（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对未与双酚A特异性结合的互补DNA进行实时荧光定量PCR；以及
（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct 值，确定所述样品中的双酚A的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素化修饰DNA在5’端进行生物素化修饰，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述互补DNA具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，将生物素化修饰DNA及其互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括：
用戊二醛溶液对所述PCR反应容器进行处理；
用链霉亲和素对所述PCR容器进行处理；
向所述PCR反应容器中加入所述生物素化修饰DNA及其互补DNA，以便在所述PCR反应容器的内表面固定所述生物素化修饰DNA及其互补DNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，将生物素化修饰DNA及其互补DNA固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括：
用20微升0.8重量%的戊二醛溶液在37℃下对所述PCR反应容器进行处理5小时，并利用超纯水对所述PCR反应容器进行清洗；
用20微升溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37℃下对所述PCR反应容器处理2小时，其中链霉亲和素在所述PCR容器中的终浓度为12.5 ng/mL，并用PBST溶液进行清洗，其中，所述PBST溶液含有10mM PBS，pH 7.2，0.05重量% Tween-20；
向所述PCR反应容器中加入20微升浓度为100nM的所述生物素化修饰DNA及其互补DNA，在37℃下反应40分钟，并且利用柠檬酸钠缓冲液进行清洗，其中所述柠檬酸钠缓冲液含有750mM NaCl，75mM C6H5Na3O7。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品中双酚A浓度不低于0.8ng/mL。
7.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述待测样品中双酚A浓度为1ng/mL~500 ng/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引物组由下列引物构成：
上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’（SEQ ID NO：3）
下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’（SEQ ID NO：4）。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于下列线性方程，确定所述样品中双酚A的浓度：
y=0.962x+6.02024，
y为所述实时荧光定量PCR的Ct 值，x为相应的双酚A浓度。
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