CN105018626B

CN105018626B - 一种确定样品中砷浓度的方法

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Publication number: CN105018626B
Application number: CN201510482759.2A
Authority: CN
Inventors: 王立梅; 朱颖越; 蔡义林
Original assignee: Changshu Institute of Technology
Current assignee: Changshu Institute of Technology
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2015-08-06
Publication date: 2018-12-25
Anticipated expiration: 2035-08-06
Also published as: CN105018626A

Abstract

本发明涉及一种确定样品中砷浓度的方法，包括：（1）PCR管壁上吸附上链霉亲和素；（2）能够特异性识别砷离子的核酸适配体的5’端进行生物素化修饰，在生物素和链霉亲和素的结合作用下，核酸适配体吸附在PCR管壁上；（3）核酸适配体与互补DNA片段结合；（4）待测样品中的砷离子与核酸适配体结合，导致互补DNA片段与PCR管壁分离；（5）用缓冲液将分离的互补DNA片段冲洗掉；（6）荧光定量PCR，通过检测体系中的Ct值确定砷离子的浓度。本发明设计了一种砷离子生物传感器，用以实现水中砷离子的简单、快速、高灵敏检测。

Description

一种确定样品中砷浓度的方法

技术领域

本发明属于分析化学和食品安全技术领域，涉及一种确定样品中砷浓度的方法。

背景技术

单质砷无毒性，砷化合物均有毒性。三价砷比五价砷毒性大，约为60倍；有机砷与无机砷毒性相似。砷的许多化合物都含有致命的毒性，常被加在除草剂、杀鼠药等。为电的导体，被使用在半导体上。化合物通称为砷化物，常运用于涂料、壁纸和陶器的制作等。在长期食用含无机砷的药物、水以及工作场所暴露砷的人会产生肠胃、肝脏、肾脏、心血管系统、神经系统等病变，因此，对于检测水质中砷的技术开发随之而来。

对水质中的As(Ⅲ)检测检测方法主要有氢化物原子荧光法、石墨炉原子吸收法、电感耦合等离子体质谱法、X—射线荧光法等。但这些方法往往还需要大量的预处理，增加了很多成本，而且对操作人员有很高的技术要求，所以不能满足社会对实际样品检测的日益增加的需求。

核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列，能与相应的配体进行高亲和力和强特异性的结合，它的出现为化学生物学界和生物医学界提供了一种新的高效快速识别的研究平台，并在许多方面展示了良好的应用前景。随着As(Ⅲ)及其核酸适配体的发现，有学者利用As(Ⅲ)和其核酸适配体的特异性结合作用，构建了对As(Ⅲ)检测的生物传感器，这类传感器具有选择性好，特异性好的优点，成为最近研究的热点。

实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)技术是在普通PCR的基础上建立起来的一种新型生物技术，该技术不仅实现了对模板DNA的定量分析，并且更加简单高效，可以同时处理大量样品，而且具有很好的准确性和特异性，减少了PCR实验过程中常出现的污染问题。实时荧光定量PCR以荧光共振能量转移为基础，通过对PCR扩增反应过程中荧光信号的实时检测从而实现对模板DNA定量的分析。在实时荧光定量PCR反应过程中，荧光信号随着实时荧光定量PCR对模板DNA的指数级扩增而增加，当反应体系的荧光强度达到所设定的阈值时，此时体系所经历的循环数即为Ct值。其中Ct值与起始模板DNA浓度有一定的线性关系，可以通过建立标准曲线实现对模板DNA浓度的定量分析。目前该技术已经在生物检测、化学分析等领域得到了广泛的应用。

我们利用As(Ⅲ)及其核酸适配体，基于实时荧光定量PCR技术，开发了一种操作简单、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测水中As(Ⅲ)的含量，实现As(Ⅲ)的简便、快速的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种确定样品中砷浓度的方法，可实现水中As(Ⅲ)的简单、快速、高灵敏检测。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种确定样品中砷浓度的方法，包括：

(1)PCR管壁上吸附上链霉亲和素；

(2)能够特异性识别砷离子的核酸适配体的5’端进行生物素化修饰，在生物素和链霉亲和素的结合作用下，核酸适配体吸附在PCR管壁上；

(3)核酸适配体与互补DNA片段结合；

(4)待测样品中的砷离子与核酸适配体结合，导致互补DNA片段与PCR管壁分离；

(5)用缓冲液将分离的互补DNA片段冲洗掉；

(6)荧光定量PCR，通过检测体系中的Ct值确定砷离子的浓度。

进一步的，所述的核酸适配体和互补DNA的序列分别具有如SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行砷离子浓度检测的效率和灵敏度。

进一步的，所述的荧光定量PCR的引物序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行砷离子浓度检测的效率和灵敏度。

进一步的，所述的砷离子的浓度为0.1-100nM。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行砷离子浓度检测的效率和灵敏度。

进一步的，所述的砷离子的浓度为0.5-10nM。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行砷离子浓度检测的效率和灵敏度。

进一步的，基于下列线性方程，确定所述样品中卡那霉素的浓度：

y＝1.04x+7.01，

y为不同砷离子浓度下扩增曲线的循环数，x为相应砷离子的浓度。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行砷离子浓度检测的效率和灵敏度。

根据本发明的实施例，确定所述样品中的砷离子浓度是通过将所述体系的循环数Ct值与标准曲线进行比较而完成的，其中，所述标准曲线是基于已知砷离子浓度分别为0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM的标准样品进行平行实验而建立的。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行砷离子浓度检测的效率和灵敏度。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1是添加不同浓度的As(Ⅲ)，并做实时荧光定量PCR，得到其扩增曲线(As(Ⅲ)浓度分别取0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM)。

图2是As(Ⅲ)检测的标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：

实施例1设计与合成相应的寡核苷酸片段

通过查阅相关文献，设计一段As(Ⅲ)的核酸适配体，在其5’段进行生物素化修饰。设计与修饰DNA互补的DNA片段。最后根据此序列来设计实时荧光定量PCR用的上下游引物。序列通过DNA合成仪制备。

核酸适配体：

5’-biotin-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’(SEQ ID NO：1)。

互补DNA：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC CCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCTTACAGATTGCACTTACTATCTCG-3’(SEQ ID NO：2)。

上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’(SEQ ID NO：3)。

下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’(SEQ ID NO：4)。

实施例2 DNA的杂交与的固定

首先PCR管加入20μL0.8％的戊二醛溶液在37℃处理5小时，然后用超纯水清洗三次，其次用20μL溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37℃再次处理2小时，其中链霉亲和素12.5ng/mL。处理完后紧接着用PBST(10mM PBS，pH 7.2，0.05％Tween-20)清洗。取修饰DNA与互补DNA的混合液20μL分别加入到PCR管中，其中修饰DNA与互补DNA的浓度都是100nM，并在37℃反应40分钟。最后用柠檬酸钠缓冲液(750mM NaCl，75mM C₆H₅Na₃O₇)清洗3次。来去除没有固定的DNA。

实施例3 As(Ⅲ)标准曲线的建立

依次向PCR管中加入NaAsO₂20μL,使其最终浓度为0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM，并在37℃反应40分钟，最后用柠檬酸钠缓冲液清洗3次，来清洗去除没有固定的DNA。最后依次向PCR管中加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR。As(Ⅲ)标准曲线的建立：利用实时荧光定量PCR仪测定不同As(Ⅲ)浓度下扩增曲线的循环数，根据测定的不同As(Ⅲ)浓度下扩增曲线的循环数，绘制As(Ⅲ)浓度的标准曲线，本传感器的线性范围0.1-10nM，检测限为0.08nM。标准曲线的线性方程为y＝1.04x+7.01，y为不同BPA浓度下扩增曲线的循环数，x为相应BPA的浓度，线性相关性>0.99。

实施例4砷离子的特异性测定

取4个PCR管，重复步骤(2)后，依次向PCR管中加入Cu²⁺、Fe²⁺、Hg²⁺、Pb²⁺各20μL。在37℃反应40分钟，最后用柠檬酸钠缓冲液清洗3次，来清洗去除没有固定的DNA。最后向PCR管中加入PCR混合液10μL、上下游引物各2μL、水6μL，做实时荧光定量PCR。由实验结果得知这种基于PCR技术的As(Ⅲ)检测新技术具有很高的特异性。

实施例5实际添加样品的测定

向自来水样品中分别添加0.5nM、1nM、5nM及10nM的As(Ⅲ)，采用基于PCR技术的As(Ⅲ)检测新方法测定实际样本中的As(Ⅲ)的添加回收率在96.4％-106.20％之间，标准差小于4.78％，能够完全满足现实生活中对As(Ⅲ)的检测需求。结果如表1：

表1.自来水样品添加As(Ⅲ)的测定

序列表

<110> 常熟理工学院

<120> 一种确定样品中砷浓度的方法

<130> xb15080604

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 核酸适配体

<400> 1

ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttttacagaa caaccaacgt 60

cgctccgggt acttcttcat cgagatagta agtgcaatct 100

<210> 2

<211> 70

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 互补DNA

<400> 2

aatctggttt agctacgcct tccccgtggc gatgtttctt agcgccttac agattgcact 60

tactatctcg 70

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物

<400> 3

aatctggttt agctacgcct tc 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物

<400> 4

gtaaggcgct aagaaacatc g 21

Claims

1.一种确定样品中砷浓度的方法，其特征在于，包括：

（1）PCR管壁上吸附上链霉亲和素；

（2）能够特异性识别砷离子的核酸适配体的5’端进行生物素化修饰，在生物素和链霉亲和素的结合作用下，核酸适配体吸附在PCR管壁上；所述的核酸适配体和互补DNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；

（3）核酸适配体与互补DNA片段结合；

（4）待测样品中的砷离子与核酸适配体结合，导致互补DNA片段与PCR管壁分离；其中，砷离子的浓度为0.5-10nM；

（5）用缓冲液将分离的互补DNA片段冲洗掉；

（6）荧光定量PCR，通过检测体系中的Ct值确定砷离子的浓度，荧光定量PCR的引物序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；

基于下列线性方程，确定所述样品中砷离子的浓度：

y=1.04x+7.01，

y为不同砷离子浓度下扩增曲线的循环数，x为相应砷离子的浓度。