CN103558202B - 一种确定样品中汞离子浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种确定样品中汞离子浓度的方法，其包括：（1）将生物素化核酸分子固定化至PCR反应容器的内表面；（2）将待测样品与探针核酸分子在所述表面固定有生物素化核酸分子的PCR反应容器中，其中，在汞离子的作用下，所述探针核酸分子能够与所述生物素化核酸分子特异性结合；（3）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去未结合汞离子的核酸分子；（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对与汞离子特异性结合的核酸分子进行实时荧光定量PCR；以及（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct值，确定所述样品中的汞离子浓度。该方法可以提出了一种全新的、简单快速的、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测样品中汞离子的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及化学领域，更具体地，涉及一种确定样品中汞离子浓度的方法。
背景技术
汞离子是一种主要的环境污染物。它对人的身体健康危害特别大，特别是儿童，微量的汞离子就能给人的大脑、神经系统，肾脏等带来很大的危害。为了满足社会对实际样品检测的日益增加的需求，发展一种对汞离子简单快速、低成本、高选择性、高灵敏性的检测新方法是十分必需的。
现代对汞离子的检测技术主要有：原子吸收光谱法、冷蒸汽原子荧光光谱法、电感耦合等离子质谱法以及电化学方法(电势、电流、电导)等。这些方法不仅需要大型的仪器设备，还需要比较繁杂的预处理过程，成本比较高，还需要专业人员操作，难以实现对汞离子的实时实地的检测，难以实现现代社会对汞离子检测日益增加的需求。
因而，目前的汞离子检测方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。
根据本发明的实施例，本发明提出了一种确定样品中汞离子浓度的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：（1）将生物素化核酸分子固定化至PCR反应容器的内表面，以便获得表面固定有生物素化核酸分子的PCR反应容器；（2）将待测样品与探针核酸分子在所述表面固定有生物素化核酸分子的PCR反应容器中，其中，在汞离子的作用下，所述探针核酸分子能够与所述生物素化核酸分子特异性结合，以便获得汞离子-核酸分子复合物；（3）利用柠檬酸缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去未结合汞离子的核酸分子；（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对与汞离子特异性结合的核酸分子进行实时荧光定量PCR；以及（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct值，确定所述样品中的汞离子浓度。
本发明是基于发明人利用金属汞离子能够与核酸中的两个胸腺嘧啶碱基（T）形成非常稳定的T-Hg2+-T配合物结构的特性，然后基于实时荧光定量PCR技术，开发了一种操作简单、高选择性、高灵敏性的生物传感器，用以检测水中汞离子的含量，极大地提高了汞离子的检测限。实时荧光定量PCR技术是最近十几年才发展起来的一种生物技术，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，并且与常规PCR相比较，它具有更强的特异性，自动化程度非常高，还有效地解决了PCR的污染问题。所谓的实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后再通过标准曲线来对未知模板进行定量分析的方法。目前该技术已经在生物化学、生物技术等领域得到了广泛的应用。根据本发明的实施例，可以利用本发明的方法进行检测的样品的类型并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以为水溶液，例如饮用水、地下水、污水等。由此，本发明的实施例提出了一种基于PCR技术的汞离子检测新方法，可实现水中汞离子的简单、快速、高灵敏检测。
根据本发明的实施例，上述方法还可以具有下列附加技术特征：
在本发明的一个实施例中，所述生物素化核酸分子具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，并且所述SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的3’末端被生物素修饰。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
在本发明的一个实施例中，所述探针核酸分子具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
在本发明的一个实施例中，在步骤（1）中，将生物素化核酸分子固定化与PCR反应容器的内表面进一步包括：用戊二醛溶液对所述PCR反应容器进行处理；用链霉亲和素对所述PCR容器进行处理；向所述PCR反应容器中加入所述生物素化核酸分子，以便在所述PCR反应容器的内表面固定所述生物素化核酸分子。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
在本发明的一个实施例中，在步骤（1）中，将生物素化核酸分子固定化与PCR反应容器的内表面进一步包括：用20微升0.8重量%的戊二醛溶液在37摄氏度下对所述PCR反应容器进行处理5小时，并利用超纯水对所述PCR反应容器进行清洗；用20微升溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37摄氏度下对所述PCR反应容器处理2小时，其中链霉亲和素在所述PCR容器中的终浓度为12.5ng/mL，并用PBST溶液进行清洗，其中，所述PBST溶液含有10mMPBS，pH7.2，0.05重量%Tween-20；向所述PCR反应容器中加入20微升浓度为50nM的所述生物素化核酸分子，在37摄氏度下反应40分钟，并且利用柠檬酸钠缓冲液进行清洗，其中所述柠檬酸钠缓冲液含有750mMNaCl，75mMC6H5Na3O7。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
在本发明的一个实施例中，所述待测样品中汞离子浓度不低于0.03ng/mL。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
在本发明的一个实施例中，所述待测样品中汞离子浓度为0.05ng/mL~10ng/mL。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
在本发明的一个实施例中，所述引物组由下列引物构成：
上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’（SEQIDNO：3）
下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’（SEQIDNO：4）。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
在本发明的一个实施例中，所述探针核酸分子的浓度为200nM，并且所述探针核酸分子与所述待测样品等体积混合。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
在本发明的一个实施例中，基于下列线性方程，确定所述样品中汞离子的浓度：y=-1.1758x+6.6826，y为所述实时荧光定量PCR的Ct值，x为相应的汞离子浓度。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
根据本发明的实施例，基于所述实时荧光定量PCR的Ct值，确定所述样品中的汞离子浓度是通过将所述实时荧光定量PCR的Ct值与标准曲线进行比较而完成的，其中，所述标准曲线是基于已知汞离子浓度分别为0ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。的标准样品进行平行实验而建立的。由此，可以进一步提高利用本发明方法进行汞离子浓度检测的效率和灵敏度。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例，利用不同汞离子浓度标准样品进行实时荧光定量PCR所得到的扩增曲线，其中汞离子浓度分别取0ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL。
图2显示了根据本发明一个实施例的汞离子标准曲线图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所描述的本发明。
实施例1
(1)设计与合成相应的寡核苷酸片段；
设计一段能够对汞离子特异性识别且富含T碱基的DNA片段，并在其3’段进行生物素化修饰。设计出探针DNA，并且根据该探针DNA核酸序列设计实时荧光定量PCR用的上下游引物。DNA序列通过DNA合成仪制备。
生物素修饰DNA：5’-TTCTTTCTTCTGGCGTAAAGGGAGCATCGG-生物素-3’（SEQIDNO：1）
探针DNA：5’-GTTGTTTGTTAATCTGGTTTAGCTACGCCTTCCCCGTGGCGATGTTTCTTAGCGCCTTAC-3’（SEQIDNO：2）
上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’（SEQIDNO：3）
下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’（SEQIDNO：4）
(2)生物素修饰DNA的固定；
首先PCR管加入20微升,0.8%的戊二醛溶液在37°C处理5小时，然后用超纯水清洗三次，其次用20微升溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37°C再次处理2小时，其中链霉亲和素12.5ng/mL。处理完后紧接着用PBST（10mMPBS，pH7.2，0.05%Tween-20）清洗。取生物素修饰DNA20微升分别加入到PCR管中，其中生物素修饰DNA的浓度为50nM，并在37°C反应40分钟。最后用柠檬酸钠缓冲液（750mMNaCl，75mMC6H5Na3O7）清洗3次。来去除没有固定的DNA。
(3)T-Hg2+-T杂交反应及标准曲线的建立；
T-Hg2+-T杂交反应：分别取200nM的探针DNA各10微升加入到上述PCR管中，然后再依次加入汞离子10微升,使其最终浓度为0ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL，并在37°C进行T-Hg2+-T杂交反应40分钟，最后用柠檬酸钠缓冲液清洗3次，来清洗去除没有反应的DNA。最后依次向PCR管中加入PCR混合液10微升、上下游引物各2微升、水6微升，做实时荧光定量PCR，图1显示了利用不同汞离子浓度标准样品进行实时荧光定量PCR所得到的扩增曲线。
汞离子标准曲线的建立：利用实时荧光定量PCR仪测定不同汞离子浓度下扩增曲线的循环数，根据测定的不同汞离子浓度下扩增曲线的循环数，绘制汞离子浓度的标准曲线。图2显示了在本实施例中得到的汞离子标准曲线图。发明人发现该标准曲线图的线性范围0.05-10ng/mL，检测限为0.03ng/mL。标准曲线的线性方程为y=-1.1758x+6.6826，y为不同汞离子浓度下扩增曲线的循环数，x为相应汞离子的浓度，线性相关性>0.99。
(4)汞离子的特异性测定；
取6个PCR管，重复步骤（2）后，加入200nM的探针DNA10微升，依次加10ng/mLHg2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Ni2+、Fe2+各5微升。在37°C反应40分钟，最后用柠檬酸钠缓冲液清洗3次，来清洗去除没有反应的DNA。最后向PCR管中加入PCR混合液10微升、上下游引物各2微升、水6微升，做实时荧光定量PCR。由实验结果得知这种基于PCR技术的汞离子检测新技术具有很高的特异性。
(5)实际添加样品的测定；
向自来水样品中分别添加0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL及5ng/mL的汞离子，采用前面的方法确定自来水样品中的汞离子浓度，结果如下：
表1自来水样品添加汞离子的测定
结果显示，基于PCR技术的汞离子检测新方法测定实际样本中的汞离子的添加回收率在97.67%-104.00%之间，标准差小于5.22%，能够完全满足现实生活中对汞离子的检测需求。
序列表
<110>常熟理工学院
<120>一种确定样品中汞离子浓度的方法
<130>xb13112104
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>30
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>生物素修饰DNA的核苷酸序列
<400>1
ttctttcttctggcgtaaagggagcatcgg30
<210>2
<211>60
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>探针DNA
<400>2
gttgtttgttaatctggtttagctacgccttccccgtggcgatgtttcttagcgccttac60
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>引物
<400>3
aatctggtttagctacgccttc22
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>引物
<400>4
gtaaggcgctaagaaacatcg21
Claims (10)
1.一种确定样品中汞离子浓度的方法，其特征在于，包括：
（1）将生物素化核酸分子固定化至PCR反应容器的内表面，以便获得表面固定有生物素化核酸分子的PCR反应容器；
（2）将待测样品与探针核酸分子加入所述表面固定有生物素化核酸分子的PCR反应容器中，其中，在汞离子的作用下，所述探针核酸分子能够与所述生物素化核酸分子特异性结合，以便获得汞离子-核酸分子复合物；
（3）利用柠檬酸钠缓冲液对所述PCR反应容器进行清洗，以便除去未结合汞离子的核酸分子；
（4）向所述PCR反应容器中添加扩增引物，以便对与汞离子特异性结合的核酸分子进行实时荧光定量PCR；以及
（5）基于所述实时荧光定量PCR的Ct值，确定所述样品中的汞离子浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物素化核酸分子具有SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，并且所述SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的3’末端被生物素修饰。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针核酸分子具有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，将生物素化核酸分子固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括：
用戊二醛溶液对所述PCR反应容器进行处理；
用链霉亲和素对所述PCR反应容器进行处理；
向所述PCR反应容器中加入所述生物素化核酸分子，以便在所述PCR反应容器的内表面固定所述生物素化核酸分子。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，将生物素化核酸分子固定化至PCR反应容器的内表面进一步包括：
用20微升0.8重量%的戊二醛溶液在37摄氏度下对所述PCR反应容器进行处理5小时，并利用超纯水对所述PCR反应容器进行清洗；
用20微升溶解链霉亲和素的0.01M碳酸缓冲液在37摄氏度下对所述PCR反应容器处理2小时，其中链霉亲和素在所述PCR反应容器中的终浓度为12.5ng/mL，并用PBST溶液进行清洗，其中，所述PBST溶液含有10mMPBS，pH7.2，0.05重量%Tween-20；
向所述PCR反应容器中加入20微升浓度为50nM的所述生物素化核酸分子，在37摄氏度下反应40分钟，并且利用柠檬酸钠缓冲液进行清洗，其中所述柠檬酸钠缓冲液含有750mMNaCl，75mMC6H5Na3O7。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品中汞离子浓度不低于0.03ng/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待测样品中汞离子浓度为0.05ng/mL~10ng/mL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增引物由下列引物构成：
上游引物：5’-AATCTGGTTTAGCTACGCCTTC-3’（SEQIDNO：3）；
下游引物：5’-GTAAGGCGCTAAGAAACATCG-3’（SEQIDNO：4）。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述探针核酸分子的浓度为200nM，并且所述探针核酸分子与所述待测样品等体积混合。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，基于下列线性方程，确定所述样品中汞离子的浓度：
y=-1.1758x+6.6826，
y为所述实时荧光定量PCR的Ct值，x为相应的汞离子浓度。
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