CN103983636A - 一种硫酸盐还原菌快速检测方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及油田水样检测处理技术领域，特别涉及一种硫酸盐还原菌快速检测方法及检测用试剂盒，本发明的方法首先将待测水样预处理除杂，然后向水样中加入细菌裂解液使水样中的APS菌体充分裂解释放，再加入反应底物，该酶催化反应底物发生氧化还原反应，在反应体系中加入显色底物，酶催化的反应产物与显色底物结合，得到有颜色的反应终产物。根据反应颜色的深浅得到待测水样中SRB的含量。本发明还根据上述检测方法将SRB检测用装置和试剂标准化成试剂盒，以便于各种施工现场的检测。本发明能够有效去除油田水样中杂质干扰，使检测周期大大缩短，并大幅度提高检测的准确性和敏感性。

Description

一种硫酸盐还原菌快速检测方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及油田水样检测处理技术领域，特别涉及一种硫酸盐还原菌快速检测方法及检测用试剂盒。

背景技术

硫酸盐还原菌（SRB）广泛存在于油田的油井和污水等缺氧环境中。它在缺氧或厌氧条件下能够利用附着于金属表面的有机物作为碳源，并利用细菌生物膜内产生的氢将硫酸盐还原成硫化氢，对金属设备具有极强的腐蚀作用，造成严重损失。

目前使用的测试瓶法是国内外最为常用SRB检测方法。这种方法较为简捷，但也存在一些不足之处，其中最主要的不足是耗时过长，一般需要7天，而且检测的准确性和灵敏度不高。因此，目前国内外大量开展了SRB快速检测技术的研究。研究方向集中三个方面：1、改进工艺，提高测试瓶法的敏感性。2、定量检测SRB的特定基因的方法，即检测SRB遗传标记的分子生物学方法，主要有PCR、PCR-RFLP和原位杂交，常用的遗传标记主要有SRB 16S rRNA基因的特征序列、亚硫酸盐异化酶基因和APS基因等。3、基于SRB代谢产物的快速检测技术。

发明内容

本发明针对现有技术中SRB检测方法耗时长，检测的准确性和灵敏度不高的问题提供一种硫酸盐还原菌快速检测方法及其试剂盒，以缩短油田采出水样中种硫酸盐还原菌的检测周期，并且提高检测的准确性和灵敏性。

本发明的硫酸盐还原菌快速检测方法包括如下步骤：

1）取体积为L的待测水样过滤并结合离心洗涤预处理水样以去除水样中干扰酶活性的杂质，最终将水样浓缩至1.5ml并收集于离心管中；

（2）向预处理过的水样中滴入100μl细菌裂解液，使水样中的硫酸盐还原菌充分裂解并释放，所述细菌裂解液包括30 mmol/l Tris-HCl,2 mmol/lEDTA,100 mmol/l NaCl， 0.1% Triton X-100, 50 μg/ml 溶菌酶，0.5 μl/ml 苯甲基磺酰氟；本步中使用裂解液可使待测水样中的细菌充分释放胞体及膜上的腺苷-5’-磷酸硫酸盐还原酶（ adenosine-5’ -phosphosulfate reductase APS），此种酶为SRB中特有特异性酶，并且本方法中使用的裂解液可以实现温合裂解决并保持酶的活性；

（3）分别取体积为150μl硫酸盐还原菌含量已知并且数量级不同的溶液若干份，再取150μl步骤（2）中裂解过的水样，然后分别向所取的多个所述已知含量的硫酸盐还原菌溶液及裂解过的水样中滴入50 μl的反应底物，并混合均匀避光反应3分钟，所述反应底物包括1.5 mmol/L  K₃Fe(CN)₆、2.5 mmol/L腺苷-5′-磷酸、2.5 mmol/L Na₂SO₃、1.5 mmol/L EDTA、100 mmol/L MES缓冲液；本步中，APS还原酶可催化反应底物发生氧化还原反应生成亚铁离子；

（4）分别向步骤（3）的各溶液中加入50 μl的显色剂，并混合均匀避光反应3分钟，使其充分发生显色反应生成蓝色的亚铁氰化铁反应液，所述显色剂为质量浓度的0.5%  3，3-双（4-羟基苯基）-1（3H）-异苯并呋喃酮；本步中，铁氰化钾与显色液混合得到铁锈指示剂，并与反应体系中生成的亚铁离子反应，生成蓝色的亚铁氰化铁；

（5）将步骤4中各已知含量硫酸盐还原菌溶液反应液显色后的颜色作为比对样本，通过颜色对比法或OD值检测对比法确定待测水样的中硫酸盐还原菌含量；因各已知含量APS溶液经氧化还原和显色反应后生成的亚铁氰化铁溶液的浓度也有所不同，溶液呈现的颜色也不同，本步骤中将待测样本显色后的颜色与已知样本显色后的颜色对比，以便于能过对比的方法确定待测样本的的浓度；

（6）再根据步骤（1）中的水样取量换算原待测水样中硫酸盐还原菌含量因上步中检测的浓度值是步骤（1）中取样过滤浓缩后的样本浓度，本步中，将上步中实际测得值与步骤（1）中体积相除可以确定原待测液中APS的含量。

为进一步提高检测的准确度和灵敏性，如果步骤（5）中测得的待测水样的硫酸盐还原菌数量小于100个/ml，则取20—50倍大体积的水样重复步骤（1）--（6）进行检测。本步骤中，通过浓缩过滤更大体积的水样可以进一步精确测定水样中的APS浓度，提高检测的灵敏性。

为准确测定不同浓度范围内的APS含量并提供对比参考，所述步骤（3）已知含量的硫酸盐还原菌溶液的含量分别取100个/ml、1000个/ml、10000个/ml、100000个/ml和1000000个/ml。

为便于检测结果的比对，所述步骤（5）中的颜色对比法指将各已知含量的硫酸盐还原菌溶液显色反应后反应液的颜色制成标准比色卡，然后将待测液显色反应后的颜色与所述标准比色卡比对，以确定待测水样中硫酸盐还原菌含量。

为便于检测结果的比对，所述步骤（5）中的OD值检测对比法是指将各已知含量的硫酸盐还原菌溶液显色反应后反应液的颜色用化学发光仪分别检测其OD420值，再用硫酸盐还原菌溶液含量和OD420值分别作纵作标和横作标制成SRB含量快速检测标准曲线，然后将待测液显色反应后的颜色用化学发光仪检测其OD420值，再通过所述SRB含量快速检测标准曲线确定待测水样中硫酸盐还原菌的含量。

为进一步实现本发明，所述步骤（1）中预处理方法为取待测水样10—30ml，用200目的筛网过滤水样中的固体微粒杂质，用无菌超纯水洗涤筛网及网上测的杂质微粒1-2次，并将过滤后的水样和清洗滤网后的无菌水一同收集后分装到若干个离心管中，以2500-3000 rpm进行离心分离，弃去上清液，收集沉淀的菌体，分别用少量无菌超纯水悬浮，并用漩涡振荡器混均，合并各离心管中的菌悬液至一支容积为1.5ml的离心管中，离心收集沉淀的菌体，用无菌超纯水洗涤并离心收集沉淀2至3次以去除水样中可溶性杂质。            

为进一步提高检测精度，所述步骤（3）中的反应底物及各反应液的温度为25℃—35℃，反应底物的PH值为7。

为进一步实现本发明的快速检测的目的，以方便在施工现场取样检测，本发明根据上述方法还提供一种硫酸盐还原菌快速检测试剂盒，包括： 

A）200目筛网一只；

B）细菌裂解液A和B各一瓶，每瓶25ml，所述A中包括30 mmol/l Tris-HCl, 2 mmol/lEDTA, 100 mmol/l NaCl)，所述B中包括0.1% Triton X-100, 50 μg/ml 溶菌酶，0.5 μl/ml 苯甲基磺酰氟；

C）阳性对照液和阴性对照液各1瓶，每瓶25 ml，所述阳性对照液为0.8 IU APS还原酶溶液，所述阴性对照液为MES缓冲液；

D）反应底物1瓶25ml ，所反应底物包括1.5 mmol/L  K₃Fe(CN)₆、2.5 mmol/L腺苷-5′-磷酸、2.5 mmol/L Na₂SO₃、1.5 mmol/L EDTA、100 mmol/L MES缓冲液；

E）显色剂一瓶25ml，所述显色剂为质量浓度0.5% 的3，3-双（4-羟基苯基）-1（3H）-异苯并呋喃酮F）

F）微孔反应板若干个。

本发明的试剂盒，将检测用试剂及测试关键装置标准化后制成试剂盒，可以方便在各种施工现场取样采集后测试，并且试剂盒中还同时配备了浓度已知的APS阳极对照液和无APS的阴极对照液，以便于判定测试结果的准确性和灵敏性。

本发明的有益效果在于：

1）快速得到检测结果。通过将测试使用的试剂和装置标准化成试剂盒，并且对比测试时使用的标准比色卡或SRB含量快速检测标准曲线只需事先按本发明的方法制作好，在测试中可直接使用。经多次测试统计，采用本发明的试剂盒和方法实际检测中可在1 h内得到检测结果，比传统方法大大缩短检测时间；

2）去除干扰。预处理能够有效去除水样中各种杂质干扰，以提高检测精度；

3）简便易行，便于现场检测。使用裂解液得到APS，仅需要小型离心机，无需特殊的仪器设备即可进行，适合油田现场使用；

4）增加灵敏性。采集大体积水样，通过浓缩，增加了检测的灵敏性，可测到1-10个/ml SRB；

5）特异性强。APS只有在SRB中存在，其他细菌中不含有该酶，因而，该方法反应的只能是样品中SRB的含量。

附图说明

图1为采用本发明的方法制作的SRB含量快速检测标准曲线图。

图2为采用本发明的方法制作的标准比色卡的示意图。

具体实施方式

 下面以具体实施例详细说明采用本发明的试剂盒及其测试方法。

测试水样前，取APS含量分别为100个/ml、1000个/ml、10000个/ml、100000个/ml和1000000个/ml的已知溶液，按本发明的方法经反应底物催化和显色剂反应后溶液显示的颜色通过化学发光仪检测其OD值，再制成如图1所示的SRB含量快速检测标准曲线图和图2所示的标准比色卡。

待测水样通过如下方法测试：

（1）取待测的油田采出水样15ml，用200目的筛网过滤并且筛网下侧放置烧杯承接滤后水样，用无菌超纯水洗涤筛网及网上测的杂质微粒1-2次，并将过滤后的水样和清洗滤网后的无菌水一同收集后分装到10个1.5ml离心管中，以2500-3000 rpm进行离心分离，弃去上清液，收集沉淀的菌体，分别用少量无菌超纯水悬浮，并用漩涡振荡器混均，合并各离心管中的菌悬液至一支离心管中，离心收集沉淀的菌体，用无菌超纯水洗涤并离心收集沉淀2至3次以去除水样中可溶性杂质；（2）向洗涤后的溶液中分别滴入50μl的裂解液A和裂解液B，混合均匀裂解后取三份150μl裂解后的溶液分别转入三个微量反应板的小孔中；

（3）取阳性对照液和阴性对照液各150μl，分别加入另外的微量反应板的小孔中；

（4）分别向装有待测样品、取阳性对照液和阴性对照液的各微量反应板中加入50μl的反应底物，轻轻摇晃30秒以混匀，并且避光反应3分钟；

（5）再向各微量反应板小孔中加入50μl显色剂，25℃避光反应3min；

（6）反应后观察微量反应板中反应液的颜色，阴性对照管中无颜色变化，阳性对照管中出现蓝色时观察各待测样品的颜色变化，并用化学发光仪检测上述溶液的OD值，然后参照图1或图2对比得出溶液的SRB含量值，取三次测量结果的平均值，然后用此值除以原始取样体积既得出待测水样中的SRB含量。

实施中，共抽取了六个不同的采出水水样采用本发明的试剂盒进行测试，测试结果如表1所示。表中，样品编号1和2为阴性对照液和标准的阳性对照液，样品编号3—8为从不同的施工现场取样的待测水样。同时为便于测试结果的对比，测试时还采用了现有技术中的测试瓶绝迹稀释法对8个样品进行测试。

表1

从上述测试结果可以看出，本发明的方法测试的准确度和灵敏性明显高于现有技术中的测试瓶绝迹稀释法，并且检测周期可在1小时内完成，大大缩短了检测周期。

Claims (7)

1.一种硫酸盐还原菌快速检测方法， 包括如下过程，

（1）取体积为L的待测水样过滤并结合离心洗涤预处理水样以去除水样中干扰酶活性的杂质，最终将水样浓缩至1.5ml并收集于离心管中；

（2）向预处理过的水样中滴入100μl细菌裂解液，使水样中的硫酸盐还原菌充分裂解并释放，所述细菌裂解液包括30 mmol/l Tris-HCl,2 mmol/lEDTA,100 mmol/l NaCl， 0.1% Triton X-100, 50 μg/ml 溶菌酶，0.5 μl/ml 苯甲基磺酰氟；

（3）分别取体积为150μl硫酸盐还原菌含量已知并且数量级不同的溶液若干份，再取150μl步骤（2）中裂解过的水样，然后分别向所取的多个所述已知含量的硫酸盐还原菌溶液及裂解过的水样中滴入50 μl的反应底物，并混合均匀避光反应3分钟，所述反应底物包括1.5 mmol/L  K₃Fe(CN)₆、2.5 mmol/L腺苷-5′-磷酸、2.5 mmol/L Na₂SO₃、1.5 mmol/L EDTA、100 mmol/L MES缓冲液；

（4）分别向步骤（3）的各溶液中加入50 μl的显色剂，并混合均匀避光反应3分钟，使其充分发生显色反应生成蓝色的亚铁氰化铁反应液，所述显色剂为质量浓度的0.5%  3，3-双（4-羟基苯基）-1（3H）-异苯并呋喃酮；

（5）将步骤4中各已知含量硫酸盐还原菌溶液反应液显色后的颜色作为比对样本，通过颜色对比法或OD值检测对比法确定待测水样的中硫酸盐还原菌含量；

（6）再根据步骤（1）中的水样取量换算原待测水样中硫酸盐还原菌含量；

根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌快速检测方法，其特征在于，如果步骤（5）中测得的待测水样的硫酸盐还原菌数量小于100个/ml，则取20—50倍大体积的水样重复步骤（1）--（6）进行检测。

2.根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中已知含量的硫酸盐还原菌溶液的含量分别取100个/ml、1000个/ml、10000个/ml、100000个/ml和1000000个/ml。

3.根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中的颜色对比法指将各已知含量的硫酸盐还原菌溶液显色反应后反应液的颜色制成标准比色卡，然后将待测液显色反应后的颜色与所述标准比色卡比对，以确定待测水样的中硫酸盐还原菌含量。

4.根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中的OD值检测对比法是指将各已知含量的硫酸盐还原菌溶液显色反应后反应液的颜色用化学发光仪分别检测其OD420值，再用硫酸盐还原菌溶液含量和OD420值分别作纵作标和横作标制成SRB含量快速检测标准曲线，然后将待测液显色反应后的颜色用化学发光仪检测其OD420值，再通过所述SRB含量快速检测标准曲线确定待测水样中硫酸盐还原菌的含量。

5.根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中预处理方法为取待测水样10—30ml，用200目的筛网过滤水样中的固体微粒杂质，用无菌超纯水洗涤筛网及网上侧的杂质微粒1-2次，并将过滤后的水样和清洗滤网后的无菌水一同收集后分装到若干个离心管中，以2500-3000 rpm进行离心分离，弃去上清液，收集沉淀的菌体，分别用少量无菌超纯水悬浮，并用漩涡振荡器混均，合并各离心管中的菌悬液至一支离心管中，离心收集沉淀的菌体，用无菌超纯水洗涤并离心收集沉淀2至3次以去除水样中可溶性杂质。

6.根据权利要求1所述的硫酸盐还原菌快速检测方法，其特征在于，所述步骤（3）中的反应底物及各反应液的温度为25℃—35℃，反应底物的PH值为7。

7.一种硫酸盐还原菌快速检测试剂盒，其特征在于，包括

A）200目筛网一只；

B）细菌裂解液A和B各一瓶，每瓶25ml，所述A中包括30 mmol/l Tris-HCl, 2 mmol/lEDTA, 100 mmol/l NaCl)，所述B中包括0.1% Triton X-100, 50 μg/ml 溶菌酶，0.5 μl/ml 苯甲基磺酰氟；

C）阳性对照液和阴性对照液各1瓶，每瓶25 ml，所述阳性对照液为0.8 IU APS还原酶溶液，所述阴性对照液为MES缓冲液；

D）反应底物1瓶25ml ，所反应底物包括1.5 mmol/L  K₃Fe(CN)₆、2.5 mmol/L腺苷-5′-磷酸、2.5 mmol/L Na₂SO₃、1.5 mmol/L EDTA、100 mmol/L MES缓冲液；

E）显色剂一瓶25ml，所述显色剂为质量浓度0.5% 的3，3-双（4-羟基苯基）-1（3H）-异苯并呋喃酮F）

F）微孔反应板若干个。