CN102507481A - 一种水环境中硫酸盐还原菌的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到对于环境中腐蚀微生物的检测，具体的说是一种水环境中硫酸盐还原菌的检测方法。将待测样品离心后，沉淀于选择性培养基中厌氧条件下培养3-4天，离心取上清液，并加入上清液1/9体积的硝酸锌溶液混合均匀后离心取沉淀，再沉淀中加入亚甲基蓝溶液混合均匀后在紫外灯下照射1.5-2.0小时，即可通过吸光度待测样品中检测硫酸盐还原菌。本发明将硫酸盐还原菌的特征代谢产物与检测手段结合起来具有很高的选择性，同时克服了传统方法培养周期长的缺点，大量缩短了检测所需时间。本发明使用光学方法检测，所需设备简单，操作难度小，材料低廉，同时具有很高的准确性。

Description

一种水环境中硫酸盐还原菌的检测方法

技术领域

本发明涉及到对于环境中腐蚀微生物的检测，具体的说是一种水环境中硫酸盐还原菌的检测方法。

背景技术

硫酸盐还原菌是一种具有严重腐蚀性危害的厌氧型微生物，它能够通过新陈代谢将硫酸根离子或亚硫酸根离子转化为硫离子并获得能量。传统的硫酸盐还原菌检测是通过最大可能数法。该种方法需要经历产物的富集阶段故所需要的培养周期较长。其它检测方法都存在不同程度的缺陷，比如，通过抗体-抗原结合的免疫反应进行的检测容易受到检测条件的约束，并且生物试剂容易失活，同时非特异性结合严重。这些不足限制了检测的灵敏度和稳定性。通过生物技术进行检测具有很高的选择性，然而其测试过程十分复杂，需要由专业人员操作，且成本很高。本发明通过将硫酸盐还原菌代谢产生的硫离子分离，并进一步反应生成硫化锌沉淀，并通过这种硫化物沉淀的光催化性质进行检测的方法具有所需的培养周期短，操作比较简单，成本低，准确度高等优点。

发明内容

本发明目的在于提供一种水环境中硫酸盐还原菌的检测方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种水环境中硫酸盐还原菌的检测方法，将待测样品离心后，沉淀于选择性培养基中厌氧条件下培养3-4天，离心取上清液，并加入上清液1/9体积的硝酸锌溶液混合均匀后离心取沉淀，沉淀中加入亚甲基蓝溶液混合均匀后在紫外灯下照射1.5-2.0小时，即可通过吸光度待测样品中检测硫酸盐还原菌。

所述待测样品以8000-10000转/分钟速度，离心8-10分钟，收集沉淀于选择性培养基中在30-35℃中厌氧条件下培养3-4天。所述选择性培养基为，1升陈海水中加入0.4-0.6克NaSO₄，0.4-0.6克K₂HPO₃，1.0-1.5克NH₄Cl，0.1-0.2克CaCl₂，1.5-2.0克MgSO₄，1.0-1.5克酵母浸出膏，3-5毫升乳酸钠。厌氧条件下培养后培养液以12000-14000转/分钟，离心15-20分钟，取上清液并加入上清液1/9体积的硝酸锌溶液混合均匀后以12000-14000转/分钟，离心15-20分钟取硫化锌沉淀。所述硝酸锌的浓度为2-3mM。将染色剂亚甲基蓝溶液加入到硫化锌沉淀中，在紫外灯下照射1.5-2.0小时产生颜色变化，即在665nm波长下进行吸光度检测。所述亚甲基蓝浓度为10-15mg/L。

本发明所具有的优点：

本发明使用的检测方法是通过硫酸还原菌产生的特征代谢产物进行硫酸盐还原菌的检测，使用该方法具有很高的选择性，且克服了使用生物试剂如抗体，生物素等易失活的问题，所需设备简单。相对于目前仍广泛使用的最大可能数法具有检测周期短，成本低的优点。

附图说明

图1.为本发明实施例提供的检测流程图。

图2为本发明实施例提供的合成的ZnS的投射电镜图。

图3为本发明实施例提供的检测方法的特异性结果图。

图4.为本发明实施例提供的检测方法在紫外灯照射(a)和无紫外灯照射(b)下的检测信号图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

取含有硫酸盐还原菌的待测水溶液离心分离(离心速度为8000-10000转/分钟，离心时间8-10分钟)，将上层液吸出倒掉，取下层沉淀置于硫酸盐还原菌的培养基中连续培养，培养温度稳定在30-35℃。培养3-4天后取出，取细菌液离心分离(离心速度为12000-14000转/分钟，离心时间10-15分钟)，取上清液。向上清液中加入硝酸锌溶液，其中上清液与硝酸锌的体积比为9∶1，硝酸锌的浓度为2-3mM，反应20-30分钟后，再次离心分离(离心速度为12000-14000转/分钟，离心时间10-15分钟)，弃掉上清液，保留沉淀物质。用超纯水洗涤沉淀物质，并再次离心(离心速度为12000-14000转/分钟，离心时间10-15分钟)，吸出上清液。洗涤两至三次后，将得到纯净硫化锌沉淀。

将上述得到的硫化锌沉淀分散在染色剂亚甲基蓝溶液中，置于紫外灯下照射(每次测量应保证样品距离紫外灯的距离相同)1.5-2.0小时，将溶液摇匀后使用分光光度计测量样品在665nm处的吸光度(检测流程参见图1)。

根据光照前后亚甲基蓝前后吸光度的变化，根据下方公式即可计算出脱色率，其中A₀与A分别代表亚甲基蓝光照前后的吸光度。

脱色率(DC)＝(1-A/A₀)×100％

实施例2

根据实施例1中的方法，检测相同浓度的三种细菌(硫酸盐还原菌，金黄色葡萄球菌，溶藻弧菌)在相同的培养时间和相同的紫外光照时间条件下的信号响应(参见图3)。通过测量紫外光照射前后样品在665nm处的吸光度，计算出相同浓度不同种类的细菌的脱色率。结果表明在扣除背景后，通过该方法检测硫酸盐还原菌的信号远远超出其它两种细菌，表明该检测方法具有很好的选择性。相比生物元件进行选择性检测，通过该种方法无需考虑生物分子的活性问题，非特异性识别问题。

实施例3

根据实施例1中的方法，检测一系列不同浓度硫酸盐还原菌(从10¹到10⁸cfu/mL)产生的信号变化，并在无紫外灯照射下做了对照。通过测量紫外光照前后样品在665nm处的吸光度，计算出不同浓度的硫酸盐还原菌在有无紫外照射下的脱色率(参见图4)。结果表明在10³到10⁸cfu/mL的浓度区间内脱色率随硫酸盐还原菌浓度的升高而增大，并呈现良好的线性相关性。在无光照实验条件下脱色率则没有显著变化。

本发明提供了一种基于硫酸盐还原菌代谢产物实现选择性检测的方法，使用该方法能有效的检测水环境中的硫酸盐还原菌数量和变化。相对于目前仍采用的检测方法，该方法该培养的天数缩短到3-4天，很大程度的缩短了检测所需时间。并且本发明提供的方法操作简单，易操作，无需复杂的检测仪器，具有很好的实用化前景。

Claims (7)

1.一种水环境中硫酸盐还原菌的检测方法，其特征在于：将待测样品离心后，沉淀于选择性培养基中厌氧条件下培养3-4天，离心取上清液，并加入上清液1/9体积的硝酸锌溶液混合均匀后离心取沉淀，沉淀中加入亚甲基蓝溶液混合均匀后在紫外灯下照射1.5-2.0小时，即可通过吸光度待测样品中检测硫酸盐还原菌。

2.按权利要求1所述的水环境中硫酸盐还原菌的检测方法，其特征在于：所述待测样品以8000-10000转/分钟速度，离心8-10分钟，收集沉淀于选择性培养基中在30-35℃中厌氧条件下培养3-4天。

3.按权利要求1或2所述的水环境中硫酸盐还原菌的检测方法，其特征在于：所述选择性培养基为，1升陈海水中加入0.4-0.6克NaSO₄，0.4-0.6克K₂HPO₃，1.0-1.5克NH₄Cl，0.1-0.2克CaCl₂，1.5-2.0克MgSO₄，1.0-1.5克酵母浸出膏，3-5毫升乳酸钠。

4.按权利要求1所述的水环境中硫酸盐还原菌的检测方法，其特征在于：厌氧条件下培养后培养液以12000-14000转/分钟，离心15-20分钟，取上清液并加入上清液1/9体积的硝酸锌溶液混合均匀后以12000-14000转/分钟，离心15-20分钟取硫化锌沉淀。

5.按权利要求1或4所述的水环境中硫酸盐还原菌的检测方法，其特征在于：所述硝酸锌的浓度为2-3mM。

6.按权利要求4所述的水环境中硫酸盐还原菌的检测方法，其特征在于：将亚甲基蓝溶液加入到硫化锌沉淀中，在紫外灯下照射1.5-2.0小时产生颜色变化，即在665nm波长下进行吸光度检测。

7.按权利要求6所述的水环境中硫酸盐还原菌的检测方法，其特征在于：所述亚甲基蓝浓度为10-15mg/L。

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