CN104730018B - 一种检测海洋环境中硫酸盐还原菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及海洋环境和海洋腐蚀领域，具体的说是一种检测海洋环境中硫酸盐还原菌的方法。将氧化态谷胱甘肽加入至经培养的待检测样品中，再加入进行激活使待测样品中硫酸盐得以激化使其还原菌的腐蚀性代谢产物硫化物与巯基蛋白酶作用，进而通过测量巯基蛋白酶的活性检测样品中硫酸盐还原菌的浓度。本发明通过利用其代谢产物检测硫酸盐还原菌，具有很好的普遍性和选择性，可以避免生物识别材料的使用，同时相比于目前仍在广泛使用的MPN法，检测所需的时间大大缩短。另外本发明所需设备简单，操作难度小，材料低廉，同时具有很高的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及海洋环境和海洋腐蚀领域，具体的说是一种检测海洋环境中硫酸盐还原菌的方法。
背景技术
硫酸盐还原菌是一大类具有严重腐蚀性危害的微生物，它们能够通过新陈代谢将硫酸根离子或亚硫酸根离子还原为硫离子并获得能量。目前仍在广泛使用的硫酸盐还原菌检测是通过最大可能数法。虽然这种方法具有很好的检测性能，然而该种方法需要的培养周期较长，至少需要15天的时间。其它检测方法也存在着不同类型的缺陷，比如，通过抗体-抗原免疫反应进行检测受到检测条件的约束，且生物试剂易失活，非特异性结合较为严重。通过生物分子技术进行硫酸盐还原菌检测具有很高的选择性，然而其测试过程十分的复杂，需要专业人员操作，且成本很高。
发明内容
本发明目的在于提供一种海洋环境中硫酸盐还原菌的快速检测方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种检测海洋环境中硫酸盐还原菌的方法，将氧化态谷胱甘肽加入至经培养的待检测样品中，再加入进行激活使待测样品中硫酸盐得以激化使其还原菌的腐蚀性代谢产物硫化物与巯基蛋白酶作用，进而通过测量巯基蛋白酶的活性检测样品中硫酸盐还原菌的浓度。
进一步的说，将待测样品于选择性培养基中培养2-4天，经过离心分离收集上清液，上清液中加入上清液体积1/9-1/10的氧化态谷胱甘肽，经过15-30分钟的反应时间，再加入体积为加入氧化态谷胱甘肽的上清液1-1.2倍的巯基蛋白酶，混合均匀后于37℃下孵育30-40分钟，测量是通过测量巯基蛋白酶催化水解酪蛋白的能力，测定水解产物在275nm波长下的吸光度，进而检测原试样中硫酸盐还原菌的浓度。
所述巯基蛋白酶为木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶或无花果蛋白酶。
所述选择性培养基为，1升陈海水中加入0.4-0.6克NaSO4，0.4-0.6克K2HPO3，1.0-1.5克NH4Cl，0.1-0.2克CaCl2，1.5-2.0克MgSO4，1.0-1.5克酵母提取物，3-5毫升乳酸钠。
所述氧化态谷胱甘肽的浓度为20mM。
将孵育后的上清液中加入酪蛋白溶液，反应10-15分钟后加入三氯乙酸终止反应，而后在275nm波长下的吸光度，进而检测原试样中硫酸盐还原菌的浓度。
本发明所具有的优点：
本发明检测方法是通过将硫酸盐还原菌代谢产生特征硫化物分离，经过氧化态谷胱甘肽激活后，会攻击巯基蛋白酶的活性催化中心，进而抑制其活性。进一步是通过硫酸还原菌产生的特征代谢产物硫化物对巯基蛋白酶的抑制作用进行硫酸盐还原菌的检测，使用该方法具有很高的选择性，准确度高，且避免了生物识别元件的使用，所需设备较为简单。同时相较于目前仍广泛使用的MPN法，该方法具有检测周期短，成本低的优点。
本发明基于硫酸盐还原菌代谢产物对巯基蛋白酶活性抑制作用对其进行检测的方法，使用该方法能有效的检测水环境中的硫酸盐还原菌数量和变化。相对于目前仍采用的检测方法，该方法该培养的天数缩短到2-4天，很大程度的缩短了检测所需时间。并且本发明提供的方法操作简单，易操作，无需复杂的检测仪器，具有很好的实用化前景。
附图说明
图1为本发明实施例提供的硫酸盐还原菌代谢产生的硫化物在经过氧化态谷胱甘肽激活前后对巯基蛋白酶的抑制作用比较图。
图2为本发明实施例提供的经本发明检测方法的特异性结果图。
图3为本发明实施例提供的经本发明检测方法的线性检测范围图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
将硫酸盐还原菌的待测液离心分离，其离心速度为6000-80000转/分钟，离心时间15-20分钟，取下层液置于选择性培养基（Postgete培养基）中连续培养，培养温度稳定在30-35℃。培养2-4天后取出，取2毫升细菌液离心分离，其，离心速度为12000-14000转/分钟，离心时间15-20分钟，取上清液。向上清液中加入氧化态谷胱甘肽溶液，其中上清液与氧化态谷胱甘肽的体积比为9:1，氧化态谷胱甘肽的浓度为20mM，在37℃反应15-30分钟后，再加入体积为加入氧化态谷胱甘肽的上清液1-1.2倍的1-5mg mL-1木瓜蛋白酶溶液，混匀后于37℃下孵育30-40分钟。之后在溶液（即再加入木瓜蛋白酶的上清液）中加入溶液体积2倍的1%酪蛋白溶液，反应10-15分钟后加入三氯乙酸终止反应，离心后取上清液置于275nm处进行吸光度测量。
根据下方公式计算得到巯基蛋白酶活性抑制率，其中A0代表的是未经过硫酸盐还原菌代谢产物处理的巯基蛋白酶的水解产物的吸光度，而A代表的是经过硫酸盐还原菌代谢产物处理后的巯基蛋白酶的水解产物的吸光度。
抑制率（IR%）=（1-A/A0）×100%
实施例2
根据实施例1中的方法，相同浓度的四种细菌（硫酸盐还原菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和溶藻弧菌）经过在Postgete培养基中培养4天后，按实施例1进行处理，通过测量经过各种细菌代谢产物处理过的巯基蛋白酶的水解产物在275nm处的吸光度，计算出相同浓度不同种类的细菌的对巯基蛋白酶活性的抑制率（参见图2）。结果表明在扣除背景后，通过本发明提供的方法检测硫酸盐还原菌的信号远远超出其它三种细菌，表明该检测方法具有很好的选择性。
实施例3
根据实施例1中的方法，检测一系列不同浓度硫酸盐还原菌（从101到108cfu/mL）经过2-4天的培养后，对巯基蛋白酶的活性抑制作用（参见图3）。结果表明当硫酸盐还原菌在经过2天培养后，在104到108cfu/mL的浓度区间内对巯基蛋白酶的抑制作用随硫酸盐还原菌浓度的升高而增大，并呈现良好的线性相关性。当培养时间延长到3天后，在103到107cfu/mL的浓度区间内呈现良好的线性相关性。硫酸盐还原菌在经过4天的培养后，其检测范围可以降低到102cfu/mL并保持良好的线性相关性。
Claims (2)
1.一种检测海洋环境中硫酸盐还原菌的方法，其特征在于：
将待测样品于选择性培养基中培养2-4天，经过离心分离收集上清液，上清液中加入上清液体积1/9-1/10的氧化态谷胱甘肽，经过15-30分钟的反应时间，再加入体积为加入氧化态谷胱甘肽的上清液1-1.2倍的巯基蛋白酶，混合均匀后于37℃下孵育30-40分钟，测量是通过测量巯基蛋白酶催化水解酪蛋白的能力，测定水解产物在275nm波长下的吸光度，进而检测原试样中硫酸盐还原菌的浓度；
所述巯基蛋白酶为木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶或无花果蛋白酶；
所述选择性培养基为，1升陈海水中加入0.4-0.6克NaSO4，0.4-0.6克K2HPO3，1.0-1.5克NH4Cl，0.1-0.2克CaCl2，1.5-2.0克MgSO4，1.0-1.5克酵母提取物，3-5毫升乳酸钠；
所述氧化态谷胱甘肽的浓度为20mM。
2.按权利要求1所述的海洋环境中硫酸盐还原菌的检测方法，其特征在于：将孵育后的上清液中加入酪蛋白溶液，反应10-15分钟后加入三氯乙酸终止反应，而后在275nm波长下的吸光度，进而检测原试样中硫酸盐还原菌的浓度。
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