CN102286609A - 一种利用木瓜蛋白酶检测重金属污染的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用木瓜蛋白酶酶抑制法测定重金属浓度的方法。本发明所提供的重金属浓度的方法，包括以下步骤：1)自未成熟的番木瓜提取木瓜蛋白酶；2)以Folin法测定蛋白酶酶活；将不同浓度的重金属与木瓜蛋白酶混合，40℃保温30min后测定酶活抑制率；制作工作方程。3)将待测样品稀释至合适浓度，按照步骤2)测定木瓜蛋白酶酶活；利用2)得到的工作方程计算样品中的重金属浓度。本发明所提供的测定重金属浓度的方法具有操作简单、反应条件温和、经济性好、并能显著降低检测成本等优点。

Description

一种利用木瓜蛋白酶检测重金属污染的方法
技术领域
本发明涉及一种利用木瓜蛋白酶检测重金属污染的方法。
背景技术
木瓜蛋白酶(Papain，E C 3.4.22.2)，主要存在于番木瓜茎叶与果实中，未成熟果实的乳汁中含量最高，因其稳定性好，蛋白水解能力强，并且对多种蛋白质均具有较好的降解作用，目前已被广泛地应用于诸多行业。在食品行业中，用于肉类嫩化、啤酒澄清、饲料添加剂和鱼类加工；在工业行业中，用于明胶制造、蚕茧脱胶、皮革脱毛等；在医疗卫生行业中，用于驱肠虫剂、治疗消化不良、各种炎症以及水肿等疾病。但迄今为止国内还未见将其用于重金属检测中的相关研究报道。
随着我国经济的快速发展，不规范、超常的工业生产造成了严重的环境污染。人们日常生活中充斥着大量含重金属的废弃物(如电池、电器设备等)，这些废弃物没有得到有效的管理和处置，进一步加剧了重金属的污染和危害。当重金属通过土壤-植物系统迁移转化，并经过食物链的积累和放大作用，会对生物产生更大的毒害。为了保证食品和饮用水的安全，确保人们的身体健康，适用的方法和检测手段显得尤为重要和迫切。传统的重金属检测方法有原子吸收光谱法、原子发射光谱法、原子荧光光谱法和阳极溶出伏安法等，这些方法和技术灵敏度高、特异性强，但存在着样品前处理较为复杂、仪器费用高和需要专业人员进行操作等缺陷，难以用于重金属的现场检测。
随着经济的发展和人们生活水平的改善，人们对食品安全的要求不断提高，待测样品量迅速增加，传统的检测技术已无法满足这种需求。因此，食品污染物的快速检测技术越来越受到关注。近年来，酶已被用于测定环境介质(水、土和废弃物)和食品中的痕量有害物质。酶抑制法作为一种快速检测有害物质残留的方法，与传统分析
方法相比，具有简便、快捷和成本低廉等优点。它直接利用酶的抑制率大小来表示有害物质残留程度的高低，能在较短时间内快速、灵敏的筛选出大量超标样品。而现在比较常用的检测用酶主要集中在脲酶、磷酸酯酶、过氧化物酶、黄嘌呤氧化酶、转化酶、葡萄糖氧化酶、丁酰胆碱脂酶和异柠檬酸脱氢酶等，其中，最常用的是脲酶。
利用蛋白酶尤其是木瓜蛋白酶对重金属进行检测的研究报道在国内还是空白。而本方法的实施将可以有效拓宽酶抑制法的使用范围更加扩大、使用方法更加灵活。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用木瓜蛋白酶检测重金属污染的方法。
本发明所提供的利用木瓜蛋白酶检测重金属污染的方法包括以下步骤：
1)自新鲜番木瓜中提取木瓜蛋白酶；以标准Folin法测定木瓜蛋白酶酶活；将木瓜蛋白酶和与重金属离子溶液在30-50℃条件下混合，20-30min后以酪蛋白为底物，Folin法测定木瓜蛋白酶酶活；
2)制作重金属对酶活的抑制曲线，根据酶活抑制率测定待测样品中重金属含量。
本发明测定重金属浓度的方法属于酶抑制法测定重金属方法的范畴。是根据重金属离子对木瓜蛋白酶的抑制率，进而测定重金属浓度的方法。
本发明以木瓜蛋白酶为测定酶对待测样品中的重金属离子浓度进行测定，有效扩展了酶抑制法测定重金属的方法。本发明所提供的重金属检测的方法具有操作简单、反应条件温和、经济性好、检测酶易获得，以及能降低检测成本等优点。
附图说明
图1为金属离子对木瓜蛋白酶酶活的影响
图2为检测Cu2+工作方程
具体实施方式
下述实施例中所述方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所述百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、酶液制备
取未成熟的新鲜木瓜汁液离心取上清液，经硫酸铵分级沉淀、sephadex-G50柱色谱纯化得到木瓜蛋白酶。
4℃冰箱冷藏备用。
实施例2、酶体系酶活测定
蛋白酶活力采用Folin法测定。用50mM磷酸缓冲溶液(pH6.5)配制的2％酪蛋白(sigma)为底物。将酶液稀释合适的倍数。取1ml稀释的酶液，在40℃下保温1min，加入同样温度的底物1ml，在40℃下反应10min后，加入2ml三氯乙酸(1％)终止反应。在40℃下保温15min，以12000rpm离心15min，取1ml上清液加入5ml 0.4M碳酸钠，混匀加入1ml福林试剂(sigma)，混匀后在40℃保温20min，测定OD660值。标准曲线用不同浓度的酪氨酸来制定，酶活力定义为在40℃下，每毫升酶液每分钟催化酪蛋白水解生成1微克酪氨酸的酶量为1个单位(U/ml)。
实施例3、酶体系对重金属敏感性的筛选
等体积酶液与重金属溶液互溶至终浓度为1g/L，40℃放置反应20min，而后按照实施例2进行酶活测定。筛选出酶敏感的重金属。
重金属离子可与酶蛋白结合使之变性或与某些蛋白的巯基结合而使酶失活，不同浓度金属离子对酶活的影响如图1所示，酶活抑制差异很大。酶对Cu2+最敏感，其次是Ag+。其中Ag+对酶的活性抑制率达93％以上，而Pb2+对酶的活性抑制率为36.7％。
实验重复三次。以下实验结果为三次重复实验的平均值。
实施例4、木瓜蛋白酶体系检测污水中Cu2+
酶活测定方法同实施例2，以不同浓度Cu2+溶液为横坐标，酶活抑制率为纵坐标，每次测定重复3次，做Cu2+浓度抑制酶活的标准曲线。以Cu2+浓度为横坐标，酶活抑制率为纵坐标，得到Cu2+浓度对酶活影响的标准曲线，如附图2所示，方程为y＝102.67x+2.1309，R2＝0.9890。计算其IC50为0.47mg/mL，标准曲线的检出限为0.0005mg/L。

Claims (1)

1.一种利用木瓜蛋白酶对常见重金属(铅、汞等)污染进行检测的方法，包括以下步骤：检测体系基于蛋白质含量测定法——Folin法，反应体系特征是：
(1)将一定浓度的木瓜蛋白酶(预溶于50mM，pH6.5的磷酸缓冲溶液中)与一定浓度的干酪素建立的反应为被检测体系。
(2)用50mM磷酸缓冲溶液(pH6.5)配制的2％酪蛋白为底物。将酶液稀释合适的倍数，将其与一定浓度重金属溶液混合后40℃下保温30min。取1ml待测酶液，在40℃下保温1min，加入同样温度的底物1ml，在40℃下反应10min后，加入2ml三氯乙酸(1％)终止反应。在40℃下保温15min，以12000rpm离心15min，取1ml上清液加入5ml 0.4M碳酸钠，混匀加入1ml Folin试剂，混匀后在40℃保温20min，测定OD660值。以空白样品作为参比，根据工作方程核算重金属浓度。
其检测体系特征是：以Folin法测定木瓜蛋白酶酶活为反应体系，利用重金属离子对酶的的抑制作用，定量测定待测样品中重金属浓度。
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