CN101250514A - 一种化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法 - Google Patents

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朱利民
薛勇
聂华丽
李树白
张玉高
周立明
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Guangdong Esquel Textiles Co Ltd
Donghua University
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Abstract

本发明涉及一种化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法，步骤包括(1)用化学试剂丁二酸酐修饰木瓜蛋白酶；(2)通过对温度、pH和洗涤剂的单因素实验比较修饰过的木瓜蛋白酶与未经修饰的木瓜蛋白酶的酶活。该方法快速、简便、廉价，修饰过的木瓜蛋白酶与未经修饰的木瓜蛋白酶相比有较高的酶活。

Description

一种化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法
技术领域
本发明属于化学修饰酶的方法，具体涉及一种用化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法。
背景技术
木瓜蛋白酶又称木瓜酶，是一类巯基蛋白酶，广泛存在于番木瓜(Carica papaya L)的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。众所周知，木瓜蛋白酶具有美容护肤的功效，木瓜蛋白酶可作用于人体皮肤上的老化角质层，促使其退化、分解、去除。黑色素是一种蛋白质衍生物，其形成与酪氨酸酶、含疏氨基酸，日光照射、氧的作用等因素有关，木瓜蛋白酶可直接将皮肤中的深褐色的酪蛋白水解为淡色的和无色的酪氨酸；还对铜有结合消除作用，阻断酪氨酸酶的催化作用，从而减少黑色素的形成，有很强的去斑效果。木瓜蛋白酶已被广泛应用于护肤化妆品的添加剂，如众所周知的“索芙特”系列化妆品；同时，木瓜蛋白酶还可以缓解皮肤搔痒，过敏症状，如用于治疗昆虫叮咬，皮肤过敏等症状。
但是由于天然的木瓜蛋白酶在高温、高压、重金属离子、氧化剂、极端pH等条件下，易遭到破坏，使得酶生产和使用受到极大的限制。工业用酶制剂还存在稳定性差、不溶于有机溶剂等缺点，使用酶的成本升高。化学修饰的目的在于，人为地改变天然酶的某些性质，创造出天然酶所不具有的某些优良特征，甚至创造出新的活性中心，扩大酶的应用范围。因此，我们根据蛋白质结构和功能的关系的知识，依照人类的需要，用化学的方法对蛋白质进行修饰，产生性能优良的酶催化剂，适应工业用酶的要求，提高酶的利用活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种用化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法，经过化学试剂修饰过的木瓜蛋白酶对高温、极端pH和洗涤剂表现出了较好的稳定性和活性。该方法快速、简便、廉价。
本发明的一种化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法，包括下列步骤：
(1)用化学试剂丁二酸酐修饰木瓜蛋白酶
将化学试剂丁二酸酐溶解在双蒸水中配成100μg/ml～200μg/ml丁二酸酐溶液，取5～10ml加入到40～50ml浓度为5mg/ml～10mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，25～30℃下搅拌1～2个小时，得到修饰过的木瓜蛋白酶溶液；
(2)在0.1～0.2ml修饰过的木瓜蛋白酶溶液中加入0.7～1.4ml浓度为0.04～0.06M pH5.0～9.0Tris-HCl缓冲液，调温度至40℃～80℃，加入0mg/ml～20mg/ml洗涤剂进行反应20～40分钟；
(3)在0.1～0.2ml浓度为5mg/ml～10mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中加入0.7～1.4ml浓度为0.04～0.06M Tris-HCl缓冲液，调温度至40℃～80℃，加入0mg/ml～20mg/ml洗涤剂进行反应20～40分钟；
(4)测试酶活性。
所述的丁二酸酐溶液浓度优选150μg/ml～180μg/ml；
所述的木瓜蛋白酶溶液浓度优选6mg/ml～9mg/ml；
所述的Tris-HCl缓冲液pH值优选pH6.0～8.0；
所述步骤(2)、(3)中的温度优选50℃～70℃；
所述步骤(2)、(3)中的洗涤剂是国产雕牌洗衣粉，浓度优选5mg/ml～15mg/ml；
所述步骤(2)、(3)中的反应时间优选30分钟。
本发明的有益效果：
(1)本发明的方法操作简单，耗时较少，修饰后的酶活性较高；
(2)样品来源方便且廉价。
附图说明
图1为修饰过的木瓜蛋白酶溶液反应温度曲线；
图2为修饰过的木瓜蛋白酶溶液洗涤剂浓度的曲线；
图3为修饰过的木瓜蛋白酶溶液反应pH的曲线；
图4为木瓜蛋白酶溶液反应温度曲线；
图5木瓜蛋白酶溶液洗涤剂浓度的曲线；
图6木瓜蛋白酶溶液反应pH的曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
                            实施例1
(1)将5mg丁二酸酐溶解在50ml双蒸水中配成丁二酸酐溶液，取5～10ml加入到40～50ml浓度为9mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，25℃下搅拌2个小时，得到修饰过的木瓜蛋白酶溶液。
(2)在0.1～0.2ml修饰过的木瓜蛋白酶溶液中加入0.7～1.4ml浓度为0.05M pH 8.0Tris-HCl缓冲液，分别在40℃，50℃，60℃，70℃，80℃水浴中反应30分钟，并测定酶的活力。
(3)在0.1～0.2ml木瓜蛋白酶溶液中加入0.7～1.4ml浓度为0.05M pH 8.0Tris-HCl缓冲液，分别在40℃，50℃，60℃，70℃，80℃水浴中反应30分钟，并测定酶的活力。
(4)测试酶活性。修饰过的木瓜蛋白酶溶液在反应温度为80℃时，酶的活性达到最高，而木瓜蛋白酶溶液在反应温度为70℃时，酶的活性达到最高。
                            实施例2
(1)将5mg丁二酸酐溶解在50ml双蒸水中配成丁二酸酐溶液，取5～10ml加入到40～50ml浓度为9mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，25℃下搅拌2个小时，得到修饰过的木瓜蛋白酶溶液。
(2)在0.1～0.2ml修饰过的木瓜蛋白酶溶液中加入0.7～1.4ml浓度为0.05M pH 8.0Tris-HCl缓冲液，在洗涤剂浓度为0mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml，50℃水浴中反应30分钟，并测定酶的活力。
(3)在0.1～0.2ml木瓜蛋白酶溶液中加入0.7～1.4ml浓度为0.05M pH 8.0Tris-HCl缓冲液，在洗涤剂浓度为0mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml，50℃水浴下反应30分钟，并测定酶的活力。
(4)测试酶活性。修饰过的木瓜蛋白酶溶液在以上洗涤剂浓度下的酶活均比木瓜蛋白酶酶活要高。
                            实施例3
(1)将5mg丁二酸酐溶解在50ml双蒸水中配成丁二酸酐溶液，取5～10ml加入到40～50ml浓度为9mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，25℃下搅拌2个小时，得到修饰过的木瓜蛋白酶溶液。
(2)在0.1～0.2ml修饰过的木瓜蛋白酶溶液中分别加入0.7～1.4ml pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的0.05M Tris-HCl缓冲液，50℃水浴下反应30分钟，并测定酶的活力。
(3)在0.1～0.2ml木瓜蛋白酶溶液中加入0.7～1.4ml pH值为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的0.05M Tris-HCl缓冲液，50℃水浴下反应30分钟，并测定酶的活力。
(4)测试酶活性。修饰过的木瓜蛋白酶溶液在pH值为9.0时，酶的活性达到最高，而木瓜蛋白酶溶液在在pH值为7.0时，酶的活性达到最高。
                        实施例4
以干酪素为底物的紫外分光光度法酶活的表征，具体步骤如下：
游离酶活力的测定：将木瓜蛋白酶溶解在0.05M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，制成浓度为0.2mg/ml的溶液。取0.1ml的上述酶液，加入0.7ml0.05M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)，再加入0.2ml的木瓜蛋白酶激活剂(上述缓冲液内含0.5M的L-cysteine和0.02M的EDTA，pH8.0)35℃保温恒定，加入同样预热的1％(W/V)酪蛋白溶液(上述缓冲液配制)1ml，35℃反应15mim，加入3ml 5％三氯乙酸(TCA)溶液终止反应(对照组实验先加TCA后加底物)。静置，8000转/分离心20min，取滤液于280nm波长下比色。
固定酶活力的测定：在一定量的固定化酶膜中加入1.6ml上述缓冲液，加入0.4ml木瓜蛋白酶激活剂，按上述方法测定固定化酶的活力。

Claims (7)

1.一种化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法，包括下列步骤：
(1)用化学试剂丁二酸酐修饰木瓜蛋白酶
将化学试剂丁二酸酐溶解在双蒸水中配成100μg/ml～200μg/ml丁二酸酐溶液，取5～10ml加入到40～50ml浓度为5mg/ml～10mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，25～30℃下搅拌1～2个小时，得到修饰过的木瓜蛋白酶溶液；
(2)在0.1～0.2ml修饰过的木瓜蛋白酶溶液中加入0.7～1.4ml浓度为0.04～0.06M pH5.0～9.0Tris-HCl缓冲液，调温度至40℃～80℃，加入0mg/ml～20mg/ml洗涤剂进行反应20～40分钟；
(3)在0.1～0.2ml浓度为5mg/ml～10mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中加入0.7～1.4ml浓度为0.04～0.06M的Tris-HCl缓冲液，调温度至40℃～80℃，加入0mg/ml～20mg/ml洗涤剂进行反应20～40分钟；
(4)测试酶活性。
2.根据权利要求1所述的化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述的丁二酸酐溶液浓度为150μg/ml～180μg/ml。
3.根据权利要求1所述的化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述的木瓜蛋白酶溶液浓度为6mg/ml～9mg/ml。
4.根据权利要求1所述的化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述的Tris-HCl缓冲液pH值为pH6.0～8.0。
5.根据权利要求1所述的化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)中的温度为50℃～70℃。
6.根据权利要求1所述的化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)中的洗涤剂是国产雕牌洗衣粉，浓度为5mg/ml～15mg/ml。
7.根据权利要求1所述的化学试剂修饰木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)中的反应时间为30分钟。
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